DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSISBACILOSCOPIALABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNINBlgo. DANIEL FERNANDO ESTRELLA TORERO

La baciloscopia es la tcnica de eleccin para el diagnstico rpido y el control del tratamiento de la tuberculosis pulmonar del adulto.Es simple, econmica y eficiente para detectar los casos infecciosos.Es la herramienta fundamental de un programa de control de la tuberculosis

LA MUESTRA

El envaseBoca ancha: de no menos de 50 mm de dimetroCapacidad entre 30 y 50 mlCierre hermticoMaterial plstico, resistente a roturas.

Nmero de muestras y momento de larecoleccin

Para DiagnsticoDos o tres muestras por SR, (aumenta probabilidad de deteccin).La primera muestra debe ser tomada en el momento de la consulta (muestra inmediata)La segunda muestra la debe recolectar el paciente en su casa por la maana al despertar (muestra matinal).La tercera muestra, cuando sea requerida

Para ControlUna muestra por mes de cada paciente de tuberculosis pulmonar con baciloscopia inicial positiva.Tomar al menos otra muestra para microscopa al finalizar el 4 mes (controlar la evolucin del paciente y detectar un posible fracaso), y una al finalizar el tratamiento para confirmar la curacin.

Obtencin espontnea del esputoEl primer paso para asegurar la calidad de la baciloscopia consiste en explicar al SR, con mucha claridad, la importancia de examinar muestras de esputo, la necesidad de recolectar esputo y no saliva.

Calidad de la muestraLa muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de rbol bronquial, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos

Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y mucoide. Puede ser fluida con partculas de material purulento. El color es variable (blanco, amarillento y hasta verdoso).

Calidad de la muestra

OrinaLquido cefalorraquideoLquidos pleural, asctico, pericrdico, articular y otrosBiopsiasPus

Otras muestras

CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRASEs conveniente procesar la muestra para baciloscopa o para cultivo el mismo da de la recoleccin. Si esto no es posible, conservarla siempre en refrigeracin (4 C no congelar) o en un lugar fresco, protegido de la luz y no por ms de cinco das.

CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRASUtilizar una caja de metal o de plstico opaco, con algn mecanismo que trabe su tapa, y con una manija para facilitar su acarreo.Evitar:

a) Exposicin al calor excesivo.b) Exposicin a la luz solar directa.c) Derrame del contenido del envase.

RECEPCION DE MUESTRASa) Comprobar que las muestras estn bien rotuladas (la etiqueta con los datos del paciente deber estar colocada en el cuerpo del envase y no en la tapa) y que corresponda a lo asentado en la solicitud.b) Limpiar el envase con fenol al 5% si existe un pequeo derrame del contenido. Si el derrame es masivo desechar la muestra por incineracin o esterilizacin en autoclave.c) Evaluar la calidad y cantidad de la muestra, capturar dicha informacin en el cuaderno de registro de laboratorio y en la seccin apropiada de la solicitud de baciloscopa.d) Notificar deficiencias en su identificacin, calidad, cantidad o forma de envo. Si este es el caso, solicitar una nueva muestra.

LA BACILOSCOPIATcnica: Coloracin de Ziehl-NeelsenFundamento:Se basa en la capacidad de las micobacterias para incorporar y retener ciertos colorantes (fucsina fenicada) ante la accin de cido y alcohol, propiedad conocida como cido-alcohol-resistencia. Debido al alto contenido en lpidos, particularmente los cidos miclicos de la pared celular.

Lugar de trabajo y materialesSe recomienda que sea un rea exclusiva

Los requisitos mnimos del laboratorio son: Buena iluminacin Ventanas o extractor para renovar el aire una vez finalizado el trabajo. Paredes y pisos lavables, que puedan ser desinfectados con solucin de hipoclorito de sodio

Lugar de trabajo y materiales Una mesa para colocar las muestras que se reciban y realizar los extendidos, con dimensiones mnimas de 1 x 0,50 m, en lo posible cubierta con material liso y resistente a soluciones germicidas (frmica, acero inoxidable o materiales similares). Un lavadero con fuente de agua y desage, en el que se pueda lavar las manos y realizar la tincin. Una repisa o armario para los reactivos, portaobjetos y dems materiales.

Lugar de trabajo y materiales

Una mesa para el microscopio.

Una mesa para escribir los informes y los registros del laboratorio

Equipo mnimo necesarioEPP: batas o guardapolvos de uso exclusivo para cada persona que realice baciloscopia.Respirador N95Guantes

Equipo mnimo necesarioMicroscopio binocular con oculares 10x, 40x y lente objetivo de inmersin 100x en excelentes condiciones de funcionamiento.Mechero de gasMaterial de vidrio (matraces, probetas pipetas, etc.).Pizetas, embudos, lpiz de punta de diamante. Frascos para soluciones colorantes y reactivos preparados.Gasa o papel para cubrir el rea de trabajo.Envases para muestras.

Aplicadores de madera.Portaobjetos.Varillas de vidrio para soporte de la tincin (puente).Hisopos de algodn.Soluciones antisepticas: Frasco con fenol al 5%Recipientes para eliminacin de material contaminado.Gradillas para lminas.Aceite de inmersin.Papel lente.Papel filtro.

Reactivos y colorantesa) Fucsina fenicada.Para 1000 ml:Fucsina bsica..................................................................3 gAlcohol de 95 ...............................................................100 mlFenol acuoso*.55 ml(Completar a 1000ml).b) Solucin decolorante: (alcohol cido).Para 1000 ml:cido clorhdrico..............................................................30 mlAlcohol de 95 ................................................................970 mlc) Azul de metileno.Para 1000 ml:Azul de metileno................................................................1 gAgua destilada 1000 ml

Preparacin del extendidoPara este examen se deben usar slo portaobjetos nuevos, los rayados o viejos pueden producir como resultado falsos positivos.

Preparacin del extendidoOrdenar las muestrasRotular portaobjetos con el nmero nico de la muestra de acuerdo al orden progresivo del registro de laboratorio.Preparar los aplicadores

Preparacin del extendidoPara evitar confusiones, colocar frente al operador solo la muestra y el portaobjeto que se va a procesar.

Destapar el envase de la muestra, colocndolo junto a la laminilla que ha sido marcada con el mismo nmero de identificacin que la muestra

Preparacin del extendidoUsar un aplicador o palillo de madera al que previamente se le ha quebrado uno de los extremos (captura el material mucopurulento y trasladarlo al portaobjetos)

Abrir el envase atrs del mechero y colectar con el palillo de madera la fraccin til. (mayor posibilidad de encontrar bacilos).

Preparacin del extendidoHacer un frotis de 2 cm de largo x 1 cm de ancho, haciendo movimientos circulares para obtener una pelcula uniforme

Preparacin del extendidoNo debe ser demasiado grueso ni demasiado delgado. En ambos casos se dificulta la tincin y la lectura microscpicaDesechar el aplicador de madera en un frasco que contenga fenol al 5%. Usar un aplicador diferente para cada muestra de esputo aunque sean del mismo paciente.Dejar secar a temperatura ambiente. Nunca se debe calentar la laminilla mientras est hmedo el frotis. Hacerlo produce aerosoles peligrosos para el operador.

Preparacin del extendidoSolo despus que el extendido se ha secado, fijar el frotis pasando la laminilla sobre la flama del mechero con suavidad 2 o 3 veces, evitando el sobrecalentamiento

Fijacin deficiente = falso negativa. Calentar demasiado = alterar la estructura de los bacilos.

Preparacin del extendidoSi es muy grueso, el extendido puede barrerse durante el proceso de tincin.

Por lo general, cuando es del grosor adecuado, se puede leer un peridico colocado detrs de un extendido seco.

Preparacin del extendidoAl terminar, desinfectar el rea de trabajo con fenol al 5% y esterilizar el recipiente con los aplicadores y el papel o gasa usados sobre la mesa.

Conservar las muestras hasta terminada la observacin microscpica, en caso de que sea necesario repetir el extendido, la tincin o la observacin al microscopio.

Solo cuando estos procedimientos se han completado satisfactoriamente, los contenedores con las muestras se esterilizan y desechan.

TincinTcnica de Ziehl Neelsen

ColoracinSe recomienda teir como mximo 12 frotis en cada oportunidad para lograr una coloracin uniforme Colocar los frotis, conservando el orden numrico sobre las varillas de vidrio (distancia mnima aproximada de 5 mm 10mm - para evitar contaminacin por arrastre)

ColoracinCubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada recin filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero.

ColoracinCon la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivn, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero.En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.Calentar tres veces hasta la emisin de vapores. Dejar reposar 5 min.

ColoracinEnjuagar con abundante agua. Cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solucin de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado tambin la parte posteriorInclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua (evitar diluir los reactivos que se utilizarn a continuacin).

Decoloracin Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y dejar actuar 3 minutos Enjuagar con abundante agua. Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes ms gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cmulos rojos o coloracin rosada intensa, volver a cubrir con solucin decolorante 1-3 minutos y enjuagar nuevamente. Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos

Coloracin de fondo Cubrir todo el extendido con solucin de azul de metileno. Dejar actuar durante un minuto. Enjuagar las lminas en ambas caras con agua a baja presin.

Coloracin de fondoLimpiar la parte inferior con un algodn si ha quedado coloreada.Observar si las lminas conservan la numeracin. Si no es as volver a numerarlas.

Dejar secar las lminas a temperatura ambiente (no por calentamiento). No apoyar papel absorbente sobre el extendido.

OBSERVACION MICROSCPICA Y LECTURA DE EXTENDIDOS

La observacin microscpica debe cumplir principalmente dos objetivos:

Determinar si en el extendido hay BAAR.Cuantifica la riqueza en bacilos.

Caractersticas morfolgicas del bacilo de la tuberculosis De 1 y 10 m de largo. Con la coloracin de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacndose claramente contra el fondo azul.Pueden presentarse aislados, apareados o agrupados.

Observacin microscpicaColocar una gota de aceite de inmersin en el extremo izquierdo del frotis teido.

B. Enfocar el portaobjetos con el lente objetivo de 40x antes de 100xC. Despus de encontrar el rea adecuada, cambiar a la lente objetivo de 100x.

Observacin microscpicaD. La lente objetivo no debe tocar el portaobjetos (falsos positivos).E.Examinar sistemticamente 100 campos tiles. F. Despus de observar un campo microscpico, desplazar el portaobjetos longitudinalmente para poder examinar el campo contiguo.

Observacin microscpicaCampos tilesAquel en el cual se observan elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas).

Los campos sin estos elementos no deben ser considerados para contar el total de campos observados, a menos que contengan BAAR.

Observacin microscpicaConteo de BAARContar el nmero de campos que ha ledo y el nmero de BAAR que ha identificado.

Se puede utilizar una cuadrcula de 10 cuadrados por 10 cuadrados, que representan los 100 campos microscpicos, como ayuda para registrar la cuenta.

En cada cuadrado anotar el nmero de BAAR que se observa.

Si no observa BAAR consignar 0.

Reporte de resultados

Reporte de resultados

Resultado: (No. de bacilos/No. de campos)Resultado: (49/100) = 0.49Entonces: Positivo +

Reporte de resultados

Resultado: (No. de bacilos/No. de campos)Resultado: (165/50) = 3.3Entonces: Positivo ++

30506745054005706004460057550605750060606070506706

Reporte de resultados

Resultado: (No. de bacilos/No. de campos)Resultado: (250/20) = 12.5Entonces: Positivo +++

15130916201001815020151117160182017

Registrar el resultado

Qu hacer si es paucibacilar?

Leer 100 campos utiles ms.Si persiste el resultado, realizar otro extendido de una porcin mas representativa.Si persiste el resultado, anotar el hallazgo y enviar a cultivo.Anotar en el rubro Observaciones (Ej. 5 BAAR)Solicitar nuevas mxs.

Algunas razones que causan resultados falsos positivos son:

Error al manejar la muestra o al registrar la informacinVolver a usar recipientes o portaobjetos PositivosFucsina Fenicada sin filtrarAceite de inmersin contaminado Decoloracin incorrecta.

Algunas razones que causan resultados falsos negativos son:

Errores al manejar la muestra o al registrar informacinMala calidad del esputoDecoloracin excesivaLectura de menos de 100 campos

microscpicos.

CONTROL DE CALIDAD DE LAS BACILOSCOPIAS

Objetivo: elevar y mantener la calidad de trabajo.

El control de calidad permite evaluar si la informacin producida por el laboratorio es precisa, reproducible y oportuna.

Instaura un sistema de alarmas que permite prevenir, descubrir y corregir errores

Resulta ms eficaz para detectar y asistir a los casos de tuberculosis y para controlar la enfermedad

Conservacin de las lminas:Quitar el aceite presionando muy suavemente sobre ellas un papel absorbente.Sumergirlas en un recipiente con xilol o alcohol 70%, durante no ms de 30 segundos. Dejar secar al aire.Comprobar que la numeracin est visible en las lminas.Guardarlas en cajas para lminas portaobjetos, o dentro de una caja comn envueltas individualmente en papel, (en paquetes rotulados con la fecha, en el orden en que se realizaron). Conservarlas en lugar seco y fresco.

Conservacin de las lminas:Laboratorios que procesan:-Ms de 100 bks por mes y con ms de 10 bks positivos (diagnostico mas control) conservaran todas la positivas y las dos negativas siguientes-Ms de 100 bks por mes y presentan menos de 10 bks positivos conservaran adems el 10% de lminas negativas.-Menos de 100 bks como promedio mensual, conservarn todas las positivas y negativas del mes de numeracin.-Si durante el periodo un laboratorio no ha tenido lminas positivas, conservar todas la lminas del mes de numeracin correlativa.

Evaluacin de las lminas:Calidad de la coloracin

Evaluacin de las lminas:Calidad del extendidoMuestras de frotis: (1)muy chico(2)no uniforme y demasiado grande(3) muy delgado(4) muy grande(5)mal decolorado y muy grueso(6)tamao y tincin adecuadas

Evaluacin de las lminas:Calidad del extendido

Evaluacin de las lminas:Calidad del extendido

GRACIAS POR SU ATENCIONLABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNINTELF: 064-217394CORREO ELECTRONICO: labreferencial@yahoo.es