1. Microscopiaa) FundamentosEl examen del microscopio suele proporcionar informaciones de fundamental importancia en la investigacin de un gran nmero de sustancias. Con frecuencia, los datos obtenidos mediante este examen no pueden ser aportados por ningn otro mtodo de estudio.Por este motivo, todo analista debe poner el mximo inters en la adquisicin de una informacin, lo ms amplia y profunda posible, sobre la estructura microscpica de este tipo de sustancias y tambin acerca de los mtodos de trabajo utilizados para su observacin y estudio.El microscopio proporcionara una evidencia confirmatoria de primer orden, aun en aquellos casos en que sean ya satisfactorios los resultados obtenidos mediante la aplicacin de las tcnicas analticas de tipo fsico o qumico, pues de enfocan los problemas bajo un ngulo diferente, con lo que la confirmacin de los datos es ms valiosa que la que se obtendra mediante la repeticin de los anlisis previamente practicados.Este tipo de informacin, la proporcionara por los mtodos o tcnicas microscpicas, se obtiene siempre a travs de la ampliacin de la potencia visual del observador, por lo que no obtiene ningn auxilio efectivo del microscopio cuando los caracteres distintivos de un material son ya observables a simple vista. Por otra parte debe tenerse en cuenta que sern raras las ocasiones en las que la simple observacin microscpica aporte la solucin efectiva del problema analtico planteado.Por este motivo, la utilidad prctica de los mtodos microgrficos tiene un campo limitado en cuando a la extensin de sus posibles aplicaciones. En cambio, cuando estos mtodos se utilizan conjuntamente con otras tcnicas analticas, los datos aportados por el anlisis microgrfico pueden ser de un valor inestimable en la confirmacin de la evidencia precisada para la resolucin definitiva del problema objeto de estudio. Es necesario evitar dos errores en lo que con frecuencia incurre el analista: el primero es el confiar en exceso el uso aislado de la observacin microscpica; el segundo, opuesto al interior, es el de infra estimar el valor de la observacin microscpica, aplcale al anlisis de una gran variedad de materiales por el hecho de que su uso no rinde siempre los resultados que se esperan.(libro microscopia analtica pg. 9-11)B) amplificacin La amplificacin del microscopio es el producto de un nmero de aumentos por el objeto del aumento ocular. Aumentos tiles X1000 X2000C) poder de la resolucinCapacidad de una lente para mostrar dos objetos muy cercanos como distintos, discretos y separados.Microscopio de transparencia o de campo claro. Este microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz artificial como energa luminosa para formar las imgenes del objeto que se observa. La imagen muestra puntos o reas iluminadas (generalmente coloreados) sobre un fondo claro o transparente.Para que la imagen sea visible con nitidez es necesario que el objeto examinado este coloreado o teido, es decir que los componentes celulares y tisulares de la estructura se contrasten mediante colorantes especficos que absorban y transmitan determinadas longitudes de onda del espectro visible. Las longitudes de onda que no se absorban son transmitidas al ojo humano o a un material fotogrfico sensible dando como resultado que la estructura teida aparece de un determinado color.El campo microscpico aparece claro o transparente porque los rayos luminosos directos que provienen del condensador no encuentran en su camino ninguna estructura coloreada y entran como rayos de luz blanca hacia el objetivo. Si se examinan objetos sin colorear la imagen ofrecer detalles poco contrastados, casi transparentes. Las secciones de tejidos deben ser delgadas con un grosor de 5 um a 10 um. Se puede emplear secciones de mayor espesor pero la imagen no mostrar un buen poder de resolucin y tampoco exhibir contornos ntidos, pues en el campo microscpico se observarn varios planos superpuestos de las imgenes.

Microscopia de contraste de fasesLas clulas vivas son transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luz pasan a travs sin sufrir prdidas en intensidad. La luz transmitida a travs de las clulas vivientes, sin embargo, encuentra a su paso, regiones de ndices de refraccin diferentes, y diferentes grosores y/o densidades, lo que es capaz de alterar su velocidad y su direccin. En la Figura 1 se da la representacin esquemtica en donde dos regiones adyacentes de una misma clula, A y B, de un diferente grosor, t1y t2y con diferentes ndices de refraccin, n1y n2, son atravesadas por un rayo luminoso. Las variaciones en grosor e ndices de refraccin son capaces de producir una diferencia en el curso ptico de la luz transmitida por las dos regiones. En este caso especfico, le toma ms tiempo pasar a la luz a travs de la fraccin B, cuyo ndice de refraccin es mayor (n2) y por lo tanto esta retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz de atravesar la porcin A, cuyo ndice de refraccin es ms bajo. Si la diferencia de los ndices de refraccin es pequea, la magnitud del cambio de fase inducido igualmente es muy pequea y se mide en trminos de longitudes de onda (l). As, en la representacin de la Figura 1, el rayo que pasa a travs de la parte B se muestra retrasado 1/4 de longitud de onda (l/4) y emerge fuera de fase. con respecto a la transmisin que nos muestra la parte A.

Microscopio de campo oscuro. Se denomina as porque la imagen que se forma est constituida por una serie de estructuras brillantes sobre un fondo oscuro. El principio ptico de este microscopio es el de aprovechar un conjunto de rayos luminosos oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del objetivo, observndose el campo microscopio totalmente oscuro.Para que esto ocurra se requiere en primer lugar que la apertura numrica del condensador sea mayor que la apertura numrica del objetivo. Esta condicin facilita que los rayos luminosos directos provenientes de la fuente luminosa sean impedidos de entrar a la porcin central de la lente del condensador y solo penetren y emerjan de l, los rayos perifricos que al refractarse se hacen oblicuos.

Figura 2 Diagrama que representa el recorrido de los rayos luminosos, en el sistema ptico del condensador y la desviacin de los rayos luminosos oblicuos, en el microscopio de campo oscuro.

INMUNOFLUORESCENCIAEn 1941 Coons intent conjugar los anticuerpos con colorantes fluorescentes y en 1942 public la primera aplicacin de esta tcnica inmunolgica. La microscopia de inmunofluorescencia es una tcnica inmunohistoqumica que consiste en conjugar colorantes fluorescentes (isotiocianato de fluorescena, rodamina B de lisamina o cido 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfnico) con anticuerpos o antgenos, exponiendo despus este conjugado a los anticuerpos o antgenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de clulas, o cultivo de tejidos en capa nica. Cuando la reaccin es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producir fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia(1,2)(verfigura1b).

Figura b1 Consta de una fuente de luz (lmpara de mercurio o halgena) la cual debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta, el microscopio y un sistema de filtros, el de excitacin o seleccin de luz ubicado entre la fuente de luz y el preparado, tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. Es segundo filtro es el de calor y est ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitacin en los microscopios de luz transmitida y entre la fuente de luz y el espejo dicrmico en los microscopios de luz incidente. El tercer tipo de filtro es de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daos retinianos que podran ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrmico (3).FUNCIONAMIENTOLa luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro excitador que solo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiacin de excitacin. Confocal Su principal ventaja es que permite obtener imgenes de mayor calidad mediante tcnicas de filtrado espacial que eliminan la luz que proviene de planos fuera de foco. Esto permite controlar la profundidad de campo y, adems, obtener series de imgenes del espcimen cambiando el plano de foco. Se pueden obtener secciones pticas de 0.5 a 1.5 micras de especmenes fluorescentes de un espesor de aproximadamente 50 micras o ms.Figura 3 - Microscopio confocalFue inventado a mediado de 1950 por Marvin Lee Minsky con el objetivo de visualizar las redes neuronales y observar los eventos biolgicos en sistemas vivos. Debido a problemas en la intensidad de las fuentes de luz y a la escasez de potencia de clculo de las computadoras de la poca, el invento pas desapercibido por mucho tiempo. El primer instrumento comercial apareci en 1987, y se desarroll durante los aos '90 debido al avance en ptica y en electrnica.El lser emitido se refleja en un espejo dicroico y escanea la muestra en el plano de foco, provocando la fluorescencia del fluorocromo, que emite fotones en el mismo plano focal. Estos fotones atraviesan el espejo dicroico y llegan al fotodetector luego de atravesar el pinhole del detector. Las emisiones de fluorescencia que ocurren en puntos por encima y por debajo del plano de foco, no son confocales con el pinhole del detector y por lo tanto son bloqueados por ste. Al igual que en el microscopio de epifluorescencia, la luz ingresa a un fotomultiplicador que la convierte en una seal elctrica.F. describir principales caractersticas y usosLas caractersticas del Microscopio ptico:El microscopio es un instrumento ptico de ampliacin, que est compuesto de un soporte y una parte pticaEl Soporte tiene un PIE metlico bastante pesado que se articula con el brazo, de forma curvada que sostiene al tubo ptico.El Tubo ptico se puede acercar o alejar de la preparacin mediante un tornillo macromtrico o de grandes movimientos que sirve para realizar un primer enfoque.Para afinar el enfoque inicial existe un tornillo micromtrico o de pequeos movimientos que permite realizar el enfoque exacto y definitivo.El Tubo ptico lleva en su parte superior una lente, el OCULAR, que es donde aplica el ojo el observador. Su aumento es comnmente de 5 a 10 dimetros (5 a 10 X).En la parte inferior del Tubo existe un dispositivo en forma de disco giratorio, el revolver, donde se atornillan los objetos, que estn formados por lentes de gran aumento. Los Objetivos suelen ser 3, que con el Ocular pueden producir ampliaciones de aproximadamente 60, 200 y 400 dimetros (60, 200 y 400 X).El clculo de aumento total resulta de multiplicar el aumento producido por el Objetivo por el aumento del Ocular.el tubo optico, con sus oculares y objetos, constituye la parte fundamental del Microscopio,el brazo es una pieza metlica de forma curvada que gira sobre el pie; sostiene por su extremo superior al Tubo ptico y en el inferior lleva varias piezas importantes como la platina, el espejo, el condensador y el diafragma. Sobre la platina se coloca la preparacin que se va a observar. Situada en posicin horizontal, es de forma cuadrada o circular con un Orificio central por el que pasa la Luz procedente del Espejo. El espejo con una cara plana y otra cncava, est montado sobre un eje giratorio ubicado en la zona ms inferior del brazo por debajo de la Platina.Entre la Platina y el Espejo se encuentra el condensador y el diafragma. El condensador est formado por una gran lente que concentra ms o menos el haz luminoso sobre la preparacin mediante su acercamiento o alejamiento de la Platina, al accionar un tornillo similar al macromtrico. El diafracma anexado a la parte inferior del Condensador permite regular la cantidad de luz proveniente del Espejo mediante un mecanismo de apertura y cierre similar al de la pupila del ojo humano.Con el Microscopio ptico se pueden observar clulas vivas o Preparaciones fijadas o coloreadas; se distinguen la forma de las clulas y la presencia de la mayora de sus componentes pero es imposible reconocer la estructura de los mismos.Microscopio electrnicoEl microscopio fotnico tiene una capacidad mxima de mostrar detalles de la imagen de un objeto (poder de resolucin), cuando entre ellos existe una distancia aproximada de 0.2 de micrmetro. Este tipo de microscopio es incapaz de ofrecer un poder de resolucin mayor porque existen dos factores limitantes: la longitud de onda de la energa luminosa utilizada y la apertura numrica (A.N.) de la lente del objetivo. La nica manera de aumentar el poder de resolucin de un microscopio era encontrar energa radiante con longitudes de onda menores a las que posee el espectro radiante visible.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN. Fue diseado y construido basndose en los mismos principios de un microscopio fotnico; con la diferencia que en vez de usar energa luminosa emplea haces de electrones y reemplaza las lentes pticas (de vidrio) por lentes construidas mediante campos electromagnticos. En la figura 5 se representan los principales componentes del M.E. de transmisin, los cuales son: Un ctodo, constituido por un filamento de alambre de tungsteno que se calienta e irradia un chorro de electrones cuya velocidad y longitud de onda estn relacionadas con el voltaje de la energa elctrica que se le aplica. Un nodo, encargado de orientar los haces de electrones, reagruparlos y acelerar su recorrido. Lente condensadora (primer campo electromagntico). Los haces de electrones provenientes del nodo son concentrados por este primer campo electromagntico y dirigidos hacia el Soporte de la muestra, en este lugar, dependiendo de la densidad que posean los componentes del espcimen los haces de electrones los atraviesan, son absorbidos, reflejados o son desviados en su recorrido. Las muestras deben ser secciones sumamente delgadas para permitir el paso de los electrones. Generalmente se utilizan secciones de tejidos del orden de 20 a 100 nanmetros. El escaso grosor del espcimen dificulta la formacin de la imagen por lo que es necesario teir o contrastar las secciones con soluciones de sales de metales pesados (plomo, uranio, plata o vanadio), los cuales tienen cierta afinidad por determinados componentes celulares. Lente objetivo (segundo campo electromagntico). Los electrones que atraviesan la muestra o los desviados por los componentes de la misma, llegan a esta zona donde son enfocados para formar una imagen ampliada. Esta imagen es recogida por la Pantalla fluorescente o placa fotogrfica Lente ocular o de proyeccin (tercer campo electromagntico) que vuelve a enfocar la imagen y la proyecta, ampliada tambin numerosas veces, hacia la pantalla fluorescente. sta es una superficie plana constituida por un soporte de colodin donde se distribuyen partculas muy finas de sales de zinc o de fsforo verde, las cuales emiten energa luminosa (ondas de mayor longitud, visibles al ojo humano) cuando son estimuladas por el choque de los electrones. Para obtener un registro permanente de la imagen observada se reemplaza la pantalla fluorescente con una placa fotogrfica, cuyos componentes son estimulados por los electrones de la misma manera que actan los fotones.

Figura 4

MICROSCOPA ELECTRNICA DE BARRIDOEl microscopio electrnico de barrido (SEM) se utiliza para obtener imgenes de gran resolucin de los rasgos topogrficos superficiales de los objetos, su fundamento consiste en hacer interaccionar un haz primario de electrones sobre un rea del objeto que se pretende estudiar. El haz debe ser muy fino, intenso y estable porque su funcin es explorar la superficie de la muestra, dando lugar a diversas seales que sern recogidas por diferentes detectores, de seales, y nos darn una informacin morfolgica estructural y microanaltica segn el detector que se haya utilizado ointerese.Lasmuestras para ser observadas al microscopio electrnico de barrido deben estar libres de lquidos y adems si no son conductoras deber ser recubiertas con material conductor Una de las caractersticas principales de la microscopia electrnica de barrido es la gran versatilidad en las aplicaciones tanto en el campo de las ciencias de materiales como en las ciencias biomdicas.Figura 5 imgenes que forma el microscopio de barrido

.El sombreado metlico consiste en pulverizar el espcimen con una fina capa de un metal pesado como oro o platino, desde un ngulo. Los objetos de la preparacin producen sombras en la capa de metal dando lugar a una imagen con una cierta apariencia tridimensional que permite calcular el tamao del objeto..Figura 6 Microfotografa de un bacterifago obtenida por sombreado metlico.La microscopa electrnica de criofractura y la de grabado por congelacin proporcionan una nueva visin del interior celular Otros dos mtodos que utilizan rplicas metlicas han sido particularmente tiles en la biologa celular. Uno de ellos, el de la microscopa electrnica de criofractura, constituye un sistema de visualizar el interior de las membranas celulares. Las clulas se congelan a la temperatura del nitrgeno lquido (-196 C) en presencia de un crioprotector (un anticongelante) para impedir la distorsin provocada por la formacin de cristales de hielo, y el bloque se fracciona con la hoja de una cuchilla. A menudo, el plano de fractura pasa a travs del centro hidrofbico de las bicapas lipdicas, exponiendo as el interior de las membranas celulares. Las caras de fractura resultantes se metalizan con platino, y las rplicas se observan al microscopio electrnico.

Figura 7 Electronmicrografa de una criofractura de la membrana del tilacoide de un cloroplasto de una clula vegetal. Las membranas del tilacoide, que llevan a cabo la fotosntesis, se encuentran apiladas. El plano de fractura se ha desplazado de capa a capa, pasando a travs de cada bicapa lipdica y exponiendo las protenas transmembrana que tienen un tamao en el interior de la bicapa suficiente para hacer sombra y aparecer como partculas intramembrana en esta rplica de platino. Las partculas mayores que se aprecian en la membrana son el fotosistema II completo un complejo de mltiples protenas (Por cortesa de L.A. Staehelin).Principales caractersticas y aplicaciones Estudio ultraestructural de clulas y tejidos normales y patolgicos. Morfologa y ultraestructura de microorganismos. Localizacin y diagnstico de virus. Caracterizacin inmunocitoqumica e histoqumica de distintos tipos celulares. Comprobacin morfolgica de tratamientos teraputicos experimentales. Estudio ultraestructural de suspensiones celulares y orgnulos aislados. Estudios ultraestructurales en diferentes tejidos y clulas de los efectos que producen los tratamientos con diferentes frmacos en una experimentacin concreta.

Qu es el plagio?El plagio es cuando una persona toma las ideas o palabras de otra persona y las utiliza en algn trabajo oral o escrito sin darle crdito a la persona cuyas ideas o palabras se estn utilizando (Park, 2003, p. 471).El plagio puede ocurrir de forma intencional o de forma no intencional. Independiente de la intencin, el plagio es una conducta acadmica deshonesta que tiene consecuencias para tu carrera e inclusive puede impedir que pases tus cursos y te grades (Park, 2003; Park, 2004).Tipos de Plagio1. Copiar las palabras de un texto y entregarlas en un trabajo como si fueran tuyas.2. Contratar a otra persona o a una pgina web para que escriba tu trabajo.3. Cuando haces referencia a un autor pero usas su texto palabra por palabra sin poner el textoentre comillas.4. Cuando parafraseas a un autor pero no lo acreditas.5. Cuando utilizas y entregas un trabajo de investigacin en varias materias. En este caso te estsplagiando a ti mismo.Qu tan frecuente es el plagio?El plagio es bastante frecuente, especialmente por la disponibilidad de de trabajos cientficos en el internet (Park, 2003; Scanlon & Neumann, 2002; Hoad & Zobel, 2009). Hasta un 95% de estudiantes universitarios ha admitido a cometer algn tipo de conducta inapropiada en trminos acadmicos. Un 67.4% se ha copiado en algn examen o a plagiado del internet o de otra fuente (Scanlon & Neumann, 2002). A pesar de su frecuencia, solo un 11% de estudiantes consideran al plagio una conducta apropiada (Scanlon & Neumann, 2002).

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Referenciashttp://sumsaiumu.wordpress.com/trabajo/tecnicas-2/http://cursosvirtuales.cfe.edu.uy/semipresencial/file.php/1/01/Primero/8113Organizacion%20celular%20y%20tisular/paginas/unidades/unidad_2/anexos/anexos21/anexosTema1/anexo3.pdfMicroscopia analtica. Sus fines y mtodos en relacin.Editorial acribia Zaragoza T.E Wallishttp://ocw.um.es/gat/contenidos/ubero/microscopia/material_clase/Sesion_Teorico-02.pdfhttp://ocw.um.es/gat/contenidos/ubero/microscopia/material_clase/Sesion_Teorico-02.pdfLocquin, M. y Langeron, M. Manual de Microscopa. Editorial Labor, S.A., Barcelona, 1985figurashttp://www.tareasymas.es/contenidos/fisica-y-quimicahttp://www.modernmicroscopy.com/http://www.bioedonline.org/http://ocw.um.es/gat/contenidos/ubero/microscopia/material_clase/Sesion_Teorico-02.pdf

Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Biologa Celular

Microscopia

Bentez Feria Alonso