BIOCATALISIS ENZIMATICA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTALABORATORIO DE BIOPROCESOS

ENERO DEL 2013[Escriba el nombre de la compañía]BIOCATALISIS ENZIMATICA

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BIOCATALISIS ENZIMATICA


I. RESUMEN:

El presente trabajo tuvo como finalidad determinar las condiciones de operación para la

hidrólisis de sacarosa en lote por la enzima inmovilizada en un reactor, cuantificando la

cantidad de azúcares reductores liberados, la velocidad inicial de hidrólisis y la hidrólisis

a diferentes concentraciones de sustrato y a una temperatura de 45°C. El pH fue de 4.7

regulados con buffer acetato.

II. INTRODUCCIÓN:

Como todos los catalizadores, las enzimas disminuyen la energía requerida para conseguir una reacción comenzada. Debajo se demuestra un diagrama similar con más detalle para el patrón de la energía para la reacción catalizada enzima. Primero, la energía se requiere para formar el complejo entre la enzima y el substrato (complejo del E-S) que es un estado de una energía más alta que la enzima y el substrato/el producto libres.

Figura 01. Diagrama de la energética de la enzima catalizó la reacción contra la reacción no-catalizada.

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La funcionabilidad biológica de las enzimas depende de la mantención de su estructura biológica de las enzimas depende la mantención de su estructura proteica nativa que es consecuencia directa de la información genética contenida en el ADN.

Su capacidad catalítica reside en su centro activo, que es una estructura formada por un número reducido de grupos funcionales (residuos aninoacidicos) que poseen una alta afinidad por el sustrato, con la cual se combina específicamente dando origen a la reacción:

De forma general, la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo, según:

Las enzimas pueden requerir, además de su estructura proteica de otras moléculas esenciales para su actividad denominada cofactores, existiendo cofactores ligados o catalíticos y cofactores disociables o estequiometricos.

Desde el punto de vista de su utilización tecnológica, las enzimas son catalizadoras del proceso de transformación de materias primas en producto útiles.

El carácter catalico de la enzima permite en teoría su indefinido en la conversión de sustratos en productos.

En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica. Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:

v = Vmax[S]/(Km + [S]) = k'[E0] Vmax = kcat

[E0]

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Presentan una gran actividad catalítica Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y

regioespecificidad) Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.

A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos químicos industriales debido a que la mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es difícil, y por tanto, no se pueden reutilizar.

Con la inmovilización de las enzimas se han podido superar estos últimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable.

ACTIVIDAD ENZIMATICA

Las enzimas son de naturaleza proteica y, aunque muchas contienen en su estructura otro tipo de molécula, su funcionabilidad biológica radica siempre en su porción proteica. La capacidad catalítica de la enzima reside en su sitio activo, que está conformado por un número de residuos aminoaciditos que se agrupan en la estructura tridimensional para generar un nicho, donde el substrato es ligado y químicamente transformado. La presencia de la estructura de este nicho es esencial para la expresión de dicha capacidad catalítica, por lo que la estabilidad configuracional de la estructura `proteica de la enzima resulta fundamental parta su funcionabilidad.

Desde el punto de vista termodinámica las enzimas actúan rebajando la barrera energética que presenta la energía de activación requerida para lograr un complejo de transición activado que dará origen al producto. Desde el punto de vista cinético, la actividad enzimática, que corresponde a la capacidad catalítica de la enzima, se traduce en un incremento de la velocidad de la reacción catalizada y, dado que en ausencia de la enzima la velocidad es generalmente despreciada, la cuantificación de la actividad enzimática se basa justamente en la medición de la velocidad de la reacción.

La actividad enzimática representa en consecuencia el máximo potencial catalítico de la enzima para un conjunto de condiciones ambientales dadas.

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La actividad enzimática se expresa en términos de unidades de actividad. La definición de unidades de actividad ha sido bastante arbitraria lo que dificulta muchas veces el análisis comparativo de los resultados obtenidos por diversos obtenidos. En general se ha adoptado la definición propuesta por la UI de bioquímica.

Se define la UI como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micro mol de sustrato por minuto.

Cinética enzimática:

El objeto de la cinética enzimática es el estudio de las enzimas en su funcionamiento. Se propone, en particular, establecer las relaciones que existen entre la velocidad de la reacción enzimática y las concentraciones del substrato (S) y de la enzima, así como la influencia de algunos factores como: pH, temperatura, presencia de efectores y eventualmente actividad del agua.

Curiosamente, este máximo no depende del tamaño del sustrato o de la enzima. La proporción de las constantes de especificidad para dos sustratos es una comparación cuantitativa de la eficiencia de la enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuación de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando [S] << Km) también proporciona la constante de especificidad.

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S].

Mecanismo de unión de único sustrato para una reacción enzimática. k1, k-1 y k2 son las constantes cinéticas para cada una de las etapas de la reacción.

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El modelo de cinética michaeliana para una reacción de único sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formándose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimático para una reacción unimolecular

puede ser bastante complejo, existe una etapa enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cinética única cuya constante es k2.

(Ecuación 1)

k2 también llamado kcat o número de recambio, hace referencia al máximo número de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] también aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reacción depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeños cambios en la [S]. Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reacción (v ≈ k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeños cambios en la [S]. En este caso, la concentración total de enzima ([E]tot) es aproximadamente igual a la concentración del complejo ES:

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Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima donde se puede observar cómo evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.

La ecuación de Michaelis-Menten[] describe como la velocidad de la reacción depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximación del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuación:

(Ecuación 2)

Esta famosa ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de sustrato único.

La constante de Michaelis Km se define como la concentración a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la Vmax. Esto puede verificarse sustituyendo la concentración de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la etapa limitante de la velocidad de la reacción es lenta comparada con la disociación de sustrato (k2 <<< k1), la constante de Michaelis Km será aproximadamente la constante de disociación del complejo ES, aunque sea una situación relativamente rara.

La situación más común, donde k2 > k1, es denominada cinética de Briggs-Haldane. La ecuación de Michaelis-Menten aún se mantiene bajo estas condiciones más generales, como puede derivarse de la aproximación del estado estacionario. Durante el período inicial, la velocidad de la reacción es más o menos constante, indicando que la [ES] también se mantendrá constante:

De esta forma, la concentración de ES viene dada por la siguiente expresión:

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Maud_Menten&action=edit&redlink=1

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Donde la constante de Michaelis Km se define así:

Con lo cual, después de operar todos los factores, obtenemos una fórmula general para la velocidad de la reacción que coincide con la ecuación de Michaelis-Menten:

La constante de especificidad kcat / Km mide la eficiencia con la que una enzima convierte un sustrato en producto. Utilizando la definición de la constante de Michaelis Km, la ecuación de Michaelis-Menten podría escribirse de la siguiente forma:

donde [E] es la concentración de enzima libre. Así, la constante de especificidad se convierte en una constante bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona con sustrato libre para formar producto. Esta constante viene definida por la frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una solución, y ronda aproximadamente un valor de 1010 M-1 s-1 a 25º C. Curiosamente, este máximo no depende del tamaño del sustrato o de la enzima. La proporción de las constantes de especificidad para dos sustratos es una comparación cuantitativa de la eficiencia de la enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuación de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando [S] << Km) también proporciona la constante de especificidad.

Cinética de un substrato:

Principales hechos experimentales: debemos señalar como un preámbulo la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y desprovistas de actividad parasita.

Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales de de la cinética enzimática son:

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a) El substrato S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario transitorio ES. este complejo resulta de una complementaria de la estructura entre el sitio activo de la enzima y d la molécula del substrato.

b) La velocidad de la reacción en el tiempo t, es decir la velocidad de la

desaparición del substrato, -

dSdt , o de aparición del producto,

dPdt que se

representa por la pendiente de la tangente a la curva, P o S = f(t) no es constante para las concentraciones dadas en enzimas o en substrato (fig. 6-6), y disminuye en función del tiempo debido a la desaparición del substrato en el curso de desarrollo de la reacción. Siempre al principio de la reacción, se puede considerar que la tangente a la curva se confunde con aquella en que la velocidad permanece constante.

Los estudios de cinética enzimática corresponden siempre a esta parte lineal de la curva; lo que implica el trabajar a velocidades iníciales. En estas condiciones, al principio de la reacción, la concentración en producto es muy débil; puede despreciarse, así como la reacción inversa de transformación del producto en substrato. Entonces se puede escribir:

c) Por otra parte, para una concentración dada de substrato, el estudio de las variaciones de la velocidad inicial de reacción en función de la concentración de enzimas (fig. 6-7) muestra que esta variación no es lineal. La curva presenta un trazo hiperbólico corre3spondiente al hecho de que para una cierta concentración de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la forma de complejo enzima-substrato; de lo que resulta que la velocidad inicial, función de la concentración de este complejo, permanece constante. Para los estudios cinéticos, es necesario situarse en las condiciones que corresponden al principio de la curva, donde es lineal, es decir a concentración bajas de enzimas.En otros términos, al cantidad de enzima debe ser pequeña en comparación a la concentración del substrato, de tal manera, que la formación del complejo enzima – substrato, ES, no modifica, o modifica poco la concentración del substrato.

Influencia del contenido de agua:

E + S k⃗ 1

k⃗ 2[ ES ] K⃗ 3 E + P

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Las enzimas son proteínas globulosas solubles en agua y las reacciones enzimáticas se efectúan, en su mayor parte, en medio acuoso.

Es común observar que alimentos han sido protegidos del desarrollo microbiano por aplicación de diferentes tratamientos de deshidratación (secado de legumbres, en crudo) sufren sin embargo, a pesar del bajo contenido de agua, degradaciones enzimáticas que conducen a la aparición de olor y sabor desagradables.

En estos casos, el papel del disolvente de la enzima que corresponden habitualmente al agua, es del todo secundario y no es indispensable.

La lipasa, situada en la interfase aceite-agua, y la lipogenasa que actúan en presencia de cantidades de agua, son un buen ejemplo de este tipo de comportamiento.

Pero siempre el agua interviene en todas las reacciones de hidrólisis como un segundo substrato. En este caso, el factor a considerar no es en realidad el tenor en agua, si no la actividad del agua en el medio considerado, actividad que cifra su grado de disponibilidad, especialmente para participar en la reacción de hidrólisis enzimática. Las curvas de sorción - desorción del agua, constituyen el método clásico para determinar la variación de la actividad del agua en función del tenor en agua.

Cuando el tenor en agua es débil, todo factor que aumenta la movilidad de la enzima y la frecuencia de la s colaciones enzima-substrato, acelera el desarrollo de reacciones enzimáticas; uno de los ejemplos mejor conocidos es el del amasamiento intensificadito que favorece la acción de las lipoxigenasas. Considerando la existencia de factores limitantes ligados a la movilidad de los reactivos, las cinéticas no son michelianas.

Enzimas inmovilizadas:

La gran especificidad en la acción de las enzimas y de las condiciones tan suaves en las cuales funcionan les confiere una decidida ventaja sobre los catalizadores químicos ordinarios. Por ello en numerosos sectores se han desarrollado considerablemente el uso de preparaciones enzimáticas. Pero el alto costo de los de los procedimientos de extracción y de purificación de las macromoléculas enzimáticas, su alta inestabilidad cundo están en solución, son un obstáculo a su recuperación después de haber sido utilizado este biocatalizador. En la práctica la

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mayor parte de las operaciones industriales se realizan de forma discontinua, en lotes, con la renovación de la enzima al principio de cada ciclo.

La inmovilización sobre un soporte insoluble, que a menudo se acompaña de un aumento en la estabilidad de la enzima, facilita el desarrollo de reactores en continuo, que funcionan durante periodos largos, sin necesidad de renovar el catalizador. Permiten también utilizar preparaciones más puras, cierto es que más caras, pero de especificidad en su acción más estrecha, lo que mejora la calidad de los productos que se obtienen.

Para los enzimologos, la fijación sobre un soporte realiza un modelo cercano a las condiciones de la célula viviente, en donde las enzimas se encuentran con frecuencia asociadas a la membrana o a organelos intracelulares.

Desde 1916, Nelson y Griffin habían demostrado que la invertasa absorbida sobre carbón activo, conserva su actividad. Pero de cualquier modo hubo que esperar hasta la década de los 50”s para que aparecieran las primeras aplicaciones de esta técnica, en particular con los trabajos de Grub-hofer y Schleith.

Después de 1960, las investigaciones, las investigaciones se han intensificado y bajo al impulso de los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales de las enzimas inmovilizadas. En 1969 Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japón el primer reactor industrial con enzima fijada, una L-aminoácidos a partir de la correspondiente mezcla racemica. Esta técnica permitiría, según los autores, disminuir el precio de costo a menos del 40% con relación al procedimiento convencional.

En Francia varios equipos han trabajado activamente en este campo. Citaremos en particular los estudios de Durand y Monsan del instituto nacional de ciencias aplicadas de Toulouse, los de Broun y Thomas de la Universidad de Tecnología de Compiegne, o el de Engasser del Instituto Nacional Politécnico de Lorraine.

En la actualidad, se han desarrollado numerosos métodos de fijación de interés para más de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto y se ha abierto un campo de experimentación, después de algunos años, para la inmovilización de células intactas, vivas o muertas. Esta multiplicación de trabajos ha dado lugar a una abundante literatura científica.

Propiedades de las enzimas inmovilizadas:

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Los efectos de la inmovilización sobre la actividad de las enzimas resultan de la interacción de diferentes factores:

a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a causa de tensiones durante la fijación.

b) Modificaciones del microambiente: pH local, interacciones electrostáticas.

c) Fenómenos difusionales en el interior del complejo.d) Impedimentos estéricos.

Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y estabilidad de la enzima.

Medición de la actividad:

Las condiciones óptimas de acción de las enzimas inmovilizadas difieren a menudo de las enzimas en solución y deben ser perfectamente conocidas para evitar todo riesgo de error de interpretación. Asi para la ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de ph es de 7.7 no alcanza sino a 75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de100% a ph 7,1.

Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilización entraña con frecuencia una pérdida de de actividad, muy variable según sea la naturaleza de la enzima y el modo de fijación; pero también se han señalado algunos casos en los que hay aumento de la actividad. Estas variaciones en un sentido o en otro podrían explicarse por una modificación estérica del sitio activo de la enzima de bajo el efecto de un cambio de conformación de la cadena polipeptidica.

Influencia de las condiciones de operación:

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Si la actividad residual de las enzimas inmovilizadas es más débil que de las enzimas nativas, por el contrario, su estabilidad se encuentra generalmente aumentada. La duración de la vida de los complejos es sin embargo muy variable y las cifras citadas en las diferentes obras científicas varían de algunas decenas de horas a varios meses y para algunos casos excepcionales, a varios años, la estabilidad de las preparaciones comerciales es un factor primordial para la explotación industrial de los reactores de enzimas.

Las cantidades de proteína retenidas son también muy variables (2-400% de la masa de polímero) y depende de la enzima considerada, del soporte que se utiliza y del método de inmovilización empleado. No se presentan fenómenos de impedimento estérico, de relación lineal entre la actividad en relación a la unidad de masa del complejo y a la cantidad de biocatalizador fijado.

La inmovilización de la enzima, en presencia del substrato o de u inhibidor competitivo, protege el sitio activo e impide la formación de enlaces entre el soporte y los ácidos aminados que interviene en la catálisis. Para las enzimas con agrupamientos –SH, muy sensibles a la oxidación, es preferible bloquear las funciones tiol antes de la fijación y de regenerarlas en el momento del empleo.

Las condiciones de pH y de temperatura necesarias para la reacción de inmovilización pueden provocar la desnaturalización parcial o total de la proteína. Peo, una vez que se ha realizado la inmovilización, se observa menudo, que las enzimas fijadas resisten mejor las variaciones de pH y a los tratamientos térmicos, que las especies en solución.

INVERTASA

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La β-D-fructofuranosidasa fructohidrolasa, comúnmente llamada invertasa y también conocida como β-D-fructofuranosidasa, β-fructosidasa, β-fructosilinvertasa y sacarasa fue descubierta por primera vez por Berthelot en 1860 (Neuman y Lamped, 1967). La reacción de rompimiento del residuo no reductor L-D-fructofuranosido es catalizada por la invertasa.

El sustrato preferido de esta enzima es la sacarosa pero la invertasa tiene la capacidad de catalizar la hidrólisis de rafinosa y estaquiosa (Fiedurek et al., 2000, Belcarz et al., 2002), produciendo una mezcla de fructosa y glucosa, esta mezcla conocida como azúcar invertida, tiene mayor poder edulcorante que la sacarosa y es usada en la producción de chocolate, bombones, jarabe, miel sintética, mermelada y jaleas. El azúcar invertido no es el único producto de importancia que produce la invertasa. La producción y aplicación de fructooligosacáridos formados por invertasa obtenida de cepas de A. niger ha ganado tremenda importancia comercial debido a sus propiedades funcionales; éstas incluyen: mejora de la microflora intestinal, alivian la constipación, disminuyen el colesterol y lípidos, promueven el crecimiento animal y son edulcorantes bajos en calorías (Nguyen et al., 1999).

Actualmente, la invertasa es una de las enzimas más utilizadas en la industria de los alimentos, especialmente en la preparación de dulces, bebidas y en la producción de ácido láctico por fermentación de melazas (Acosta et al., 2000). La invertasa también se utiliza para la hidrólisis de sacarosa en procesos de producción de etanol; lo que evita la formación de sorbitol durante el proceso de fermentación (Lee y Huang, 2000).

Microorganismos productores de invertasa

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Se ha reportado la presencia de invertasa en bacterias, hongos, plantas superiores y en algunas células animales (Belcarz et al., 2002, Mátrai et al., 2000, Luxhoi et al., 2002, Huang et al., 2003). Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre producción de invertasa se ha realizado con Saccharomyces cerevisiae, el cual es un microorganismo particularmente interesante ya que mientras otras especies de levaduras que consumen sacarosa tienen la habilidad de sintetizar sólo una forma de invertasa intra o extracelular, S. cerevisiae sintetiza ambas formas de invertasa. Una es la proteína periplasmática glucosilada y la otra es una proteína citosólica no glucosilada (Belcarz et al., 2002)

La invertasa es producida de manera comercial principalmente por Saccharomyces cerevisiae y por cepas de hongos del género Aspergillus como A. niger, A. oryzae y A. ficcum (Vargas et al., 2004). En estos hongos la invertasa puede ser intra y extracelular. En A. niger se ha observado la prese ncia de múltiples formas de esta enzima y aproximadamente del 40-60% de ésta es intracelular (Vargas et al., 2004).

Producción de invertasa

Muchos de los trabajos sobre producción de invertasa se han hecho en fermentación líquida usando sacarosa y melazas como principal fuente de carbono. Belcarz y col. (2002) observaron que a una concentración de 1% de sacarosa se induce la síntesisde invertasa por C. utilis. Siendo S. cerevisiae uno de los principales productores a nivel industrial, se ha cultivado en diferentes medios para producir altas cantidades de invertasa.

Con hongos filamentosos se han realizado numerosos intentos para incrementar la producción de invertasa. Se ha reportado (Fiedurek et al., 2000) la selección de cepas de A. fumigatus utilizando técnicas de mutagénesis clásicas, encontrando la mayor actividad de invertasa extracelular e intracelular (5.27 U/ml y 0.44 U/ml) después de 96 horas de incubación, el incremento de la actividad de invertasa comparada con la cepa parental fue de dos veces aproximadamente. Mukherjee y colaboradores (2002) reportan la producción de invertasa por Termitomyces clypeatus cuando el hongo fue cultivado por 5 días en un medio sintético con 1% de sacarosa.

Una opción para la producción de invertasa son los procesos de fermentación en medio sólidos. Se han sugerido varias ventajas de la fermentación sólida sobre la fermentación líquida (Mitchell et al., 2000) entre las que destacan la menor represión catabólica, la alta productividad de enzimas y la mayor concentración de enzimas (Romero-Gómez et al., 2000).

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Montiel-González y col. (2002) compararon mutantes haploides de A. niger, previamente caracterizadas como sobreproductoras de enzimas y diploides de A. niger formadas a partir de las mutantes haploides, de esta manera encontraron una mayor producción de invertasa en FMS en comparación con el método convencional de fermentación líquida.

Invertasa Inmovilizada

La invertasa está catalogada dentro de las enzimas solubles de alta demanda (Huerta-Ochoa, 2004), por lo que se han usado diferentes métodos para tratar de obtener la mayor producción de esta enzima a partir de los microorganismos que comercialmente la producen. Sin embargo, se tienen desventajas ya que la enzima está en solución, lo que puede representar problemas en la purificación de los productos y generalmente la enzima no se puede recuperar, incrementando el costo del proceso. Para tratar de evitar estos problemas se han diseñado métodos de inmovilización de enzimas para favorecer la reacción y reuso de las enzimas. Las enzimas pueden estar inmovilizadas en geles hidrofílicos como agar, agarosa, alginato, carregenina, o en matrices poliméricas semipermeables o en celulosa

(Huerta-Ochoa, 2004).

Las ventajas de usar enzimas inmovilizadas son muchas y algunas tienen especial relevancia en el área de alimentos (Torres et al., 2002). Sin embargo, la inmovilización de células con actividad invertasa puede ofrecer ventajas económicas comparadas con la inmovilización de invertasa soluble (Krastanov, 1997). Los materiales para inmovilizar células con actividad invertasa son diversos como poliacrilamida (Ghosh y D’Souza, 1989), polihidroxietilmetacrilato (Cantarella et al., 1992), alginato (Pira et al., 1991), gelatina (Parascandola et al., 1993) y pectinato de calcio (Polakovic et al., 1993) entre otros, sin embargo, ni uno de los métodos mencionados reúne las características catalíticas necesarias para su aplicación en procesos industriales de hidrólisis de sacarosa (Krastanov, 1997).

Se ha observado que la invertasa inmovilizada en diferentes materiales (Mansfeld et al., 1992,, Monsan y Combes, 1983, Prodanovic et al., 2001, Krastanov 1997, Basha y Palanivelu, 2000), se puede mantener estable por periodos prolongados de tiempo a concentraciones de sacarosa y temperaturas relativamente elevadas.

III. OBJETIVOS:

Objetivos generales:

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Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de un preparado enzimático en bruto de invertasa de levadura de panadería (β-D-fructofuranosidasa) en sus formas soluble e inmovilizada.

Objetivos específicos:

Preparar reactivos para obtener curvas de calibrado de DNS y proteínas.

Obtener el preparado enzimático en bruto de invertasa de levadura.

Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividades

volumétrica y específica) del preparado soluble.

Determinar los parámetros cinéticos de la invertasa soluble.

Inmovilizar invertasa en geles.

Montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para evaluar su

comportamiento.

IV. MATERIALES:

Metodo Bradford

0.1g de azul de coomassie G-250

Reactivo Bradford

Etanol al 98%

Acido fosfórico al 85%

Água destilada

Micropipetas

Pipetas

Tubos de ensayo 500 µL

Espectrofotómetro

Suero de bobino 0.3g/l

Matraces

Inmovilizacion de invertasa

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Alginato de sódio al 2%

Solución de CaCl2 0,1M y 0,05M.

Jeringa

Matraces

Mechero

Mini-reactor

Baño Maria

Cronometro

Pipetas

Micropipeta

Rango de linealidad

Tubos de ensayo con tapa (4) y 2 tubos para blanco

Soluciones:

Solucion de sustrato (2.9 ml por tubo)

Extracto crudo enzimarico (0.25 ml para 4 tubos)

Pipetas (3)

Baño Maria

Cronometro

Espectrofotometro UV

Agua helada

Determinacion de azucares reductos DNS

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Ractivo DNS

Micropipeta

Tubos de ensayo (9)

Pipeta

Agua destilada

Rejilla

Mechero Bunsen

Agua delada

Agitador Maximix

Espectrofotometro

V. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL:

Consideraciones:

Usar soluciones concentradas de sacarosa: 0.2 M – 0.6 M

Utilizar como soporte Alginato de sodio al 1.5%-2.5% (p/v)

Usar un sistema mini-reactor enzimático por lotes agitado.

Definición: una unidad internacional de Invertasa es aquella cantidad de enzima

necesaria, que libera un micromol (1 µmol) de azucares reductores por minuto,

desde una solución de 20g/L a 40º C y pH 4.7 (Tampón acetato de sodio 0.05 M)

Elaboracion de preparado enzimatico

a) Pesar 1.053 g de Na4P2O7.

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Hallando peso de Na4P2O7 para 0.066 M

PM= 266 g/mol

M=¿demolesvolumen

→ 0.066=¿ demoles0.06 L

→¿demoles=3.96 x10−3 mol

¿de moles= WPM

→ W=1.053 g de Na 4 P 2 O7

b) Agregar 60 ml de fosfato de sodio (Na4P2O7) 0.066 M en un recipientec) Llevar a un pH 8.5d) Agregar 20 g de levadura a un vaso de precipitación de 100 ml y cubrir con papel

aluminioe) Mantener a 20°C y dejar reposar hasta el día siguientef) Centrifugar, quedándonos con el sobrenadante (centrifugar 2 veces)g) Guardar el sobrenadante (preparado enzimático) hasta la siguiente semana.

Pesar 1.053 g de fosfato de sodio y agregarle 60 ml de agua para obtener fosfato de sodio 0.066 M

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Determinacion de proteínas: Metodo de Bradford

Reactivo: Disolver 0.1 g de azul de Coomassie G-250 en 50 ml de etanol al 98%, mas 100 ml de acido fosfórico al 85% y con agua destilada aforar a un litro-

Procedimiento:

a) Agregar a un tubo de ensayo 500 µl de muestra convenientemente diluida.b) Añadir 5 ml de reactivo Bradford (a cada muestra) y dejar reaccionar durante 5

minutos.c) Leer la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm, contrastándola con un

blanco de agua destilada de 500 µl.d) La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de

calibrado.

La curva de calibrado se obtiene a partir de muestras de concentración conocida de una solución estándar de albumina suero de bovino y analizadas según este procedimiento.

Determinacion del rango de linealidad y actividad de la enzima

Las experiencias se realizaron a diferentes diluciones del extacto crudo enzimático, 1:1, 1:2, 1:4 y 1:6 según como convino. Se grafico la concentración de producto contra el

Ajustar el pH a 8.5. Agregar 20 gramos de levadura y dejarlo repposar hasta el siguiente dia.

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tiempo de reacción y se expreso correctamente los valores de las actividades volumétrica y especifica. El procedimiento fue el siguiente:

a) Se prepararon 4 tubos de ensayo con tapa, se agrego a cada uno 2.5 ml de solución de sustrato a la concentración definida (concentraciones estándares de sacarosa 20 g/l; rafinosa 15 g/l e inulina achicoria 10 g/l) a pH 5.0 con tampón citrato-fosfato y se calentaron en una baño Maria a 55°C durante 2 minutos.

b) Se adiciono 0.25 ml de extracto crudo enzimático a cada uno de los 4 tubos de ensayo y se dejo reaccionar por los tiempos requeridos por el experimento: 5, 10, 15 y minutos, respectivamente.

c) La reacción se detuvo introduciendo cada tubo en baño de agua a 100°C por 3 minutos y luego puestos en agua helada.

d) Simultaneamente en otros dos tubos se hicieron los blancos para el sustrato y para la enzima.

e) Finalmente se hicieron las determinaciones de azucares reductores.

Con una pipeta se cogio 0.25 ml de caldo enzimático de invertasa

22



Se extrajo 250 ml de solución concentrada de sacarosa de concentracion 20 g/l. Y con otra pipeta coger solución tampón acetato pH 4.7 y mezclarlos.

Se numeran 4 tubos (1,2,3,4) se rotula un tubo para el blanco enzima (BE), se enumera un tubo mas para el blanco sustrato (BS). A los 4 tubos enumerados y el tubo BS se le agrega 2.9 ml de solución preparada (solución sacarosa + tampón acetato); y al tubo BE se le agrega 2.9 ml de tampón acetato.

Posteriormente, a los tubos 1,2,3,4,BE se les agrega 0.1 ml de caldo crudo. Se lleva a Baño Maria (45ªC) a los seis tubos durante 2 minutos.

23



Con una micropipeta, colocar 1 ml decaldo enzimático en diferentes tiempos. Al primer tubo se le retira del Baño Maria 5 minutos después dehaberle agregado el caldo enzimático, al segundo tubo 10 minutos después de agregarle la enzima, al tercer tubo a los 15 minutos y al cuarto tubo a los 20 minutos.

Retirado los tubos del Baño Maria, se colocan (cada uno a su respectivo tiempo de salida de agua caliente) en agua hirviendo durante 3 minutos.

Despues del agua a ebullición, llevar los tubos al agua helada durante 5 minutos aproximadamente y después se almacena en refrigeración hasta realizar el análisis de azucares reductores DNS.

24



Determinacion de azucares reductores

Metodo de inmovilización de invertada en alginato de sodio

a) Prepara una disolución de alginato de sodio al 2% y calentar a 80°C por 15 minutos y luego enfriar a 45°C.

Realizar todos los pasos de análisis de azucares reductores por DNS, pero haciendo una dilución 1:5 (100 µl de muestra + 400 µl de agua destilada). Luego de hacer todos los pasos, leer Abs en el espectrofotómetro a 540 nm.

25



b) De la disolcuion anterior tomar 5 ml, mezclar con1 ml del preparado invertasa y cargar todo a una jeringa provista de aguja.

c) Con la jeringa gotear la mezcla dentro de 30 ml de solución agitada de CaCl2 0.1 M.

d) Los “beads” esféricos de enzima inmovilizada, dejarlos en reposo en refrigeración por 3 a 4 horas y luego lavarlos con una solución de CaCl2 0.05 M.

e) Empacar los “beads” dentro del minireactor.

Prepara una disolución de alginato de sodio al 2% y calentar a 80ºC por 15 minutos y luego enfriar a 45ºC.

De la disolución anterior tomar 5 mL, mezclar con 1 mL del preparado invertasa y cargar toda una jeringa provista de aguja.

Con la jeringa gotear la mezcla dentro de 30 mL de solución agitada de CaCl

Los “beads” esféricos de enzima inmovilizada, dejarlos reposar en refrigeración por 30 min y luego lavarlos

26



Comportamiento de un reactor por lote con enzima inmovilizada

a) Preparar 45 ml de sacarosa (20 g/ml)b) Colocarlo en el reactor y dejarlo que alcance 45°C.c) Colocar los” beads” dentro del reactor e inmediatamente sacar la 1° muestra (1 ml

con una micropipeta).d) Colocar la muestra en Baño Maria por 3 minutos.e) Llevar a agua helada por 5 minutos, y posteriormente almacenar hasta realizar el

análisis de azucares reductores.

Preparar 45 ml de solución de sacarosa de concentración 20g/ml y agregarlos junto con la solución tampón dentro del mini-reactor.

Mediante un agitador magnético se va removiendo las solución hasta que alcance una temperatura de 45ºC. Mientras tanto se lava los “beads” con solución tampón hasta eliminar todas las impurezas.

Agregar al mismo tiempo todos los “beads”, y justo en ese momento se coge la primera muestra de 1 ml con una micropipeta

Los “beads” esféricos de enzima inmovilizada, dejarlos reposar en refrigeración por 30 min y luego lavarlos

27



Despues del agua a abullicion, colocar los tubos en agua helada por 5 minutos aproximadamente y depsues alamacenarlos en refrigeración hasta relaizar el análisis de azucarfes reductores.

28



Método de inmovilización de

invertasa en alginato de sodio

Prepara una disolución de alginato

de sodio al 2% y calentar a 80ºC

por 15 minutos y luego enfriar a

45ºC.

De la disolución anterior tomar 5

mL, mezclar con 1 mL del

preparado invertasa y cargar toda

una jeringa provista de aguja.

Con la jeringa gotear la mezcla

dentro de 30 mL de solución agitada

de CaCl20.1 M.

29



Empacar los “beads” dentro del

mini-reactor a 40°C, que tiene

20ml de tampon y 25ml std.

Luego tomar 1020ul de muestra

cada 30min por 5 horas.

Cada muestra se pone a hervir por

3min, luego se enfría en agua

helada y guardar en cada vial.

30



Metodología de la obtención de preparado enzimático de levadura

Materiales:

Levadura seca Fosfato de sodio a 0.066M Vasos precipitados Probeta

Procedimiento:

Se mezclara 43.33gr de levadura

desecada con 130ml de fosfato de

sodio a 0,066M.

Se tomo 2.28ml de fosfato

de sodio para una solución

de 130ml

Ajustar el valor de pHa 8,5.

Dejar reposar toda una noche

manteniendo la temperatura a 20°C.

31



Determinación de azúcares reductores mediante el método del DNS

Materiales:

Reactivo DNS Espectrofotometro Mechero

Agua destilada Micropipeta Matraces

Procedimiento:

El preparado enzimático

obtenido, si no se está usando

mejor guardarlo en frío.

Se centrifugara, durante 15 minutos a temperatura ambiente, tomar el sobrenadante y volver a repetir este paso. El sobrenadante mantiene la mayor actividad enzimática.

Se añade 1 mL de

reactivo DNS a un 1 mL

de muestra a analizar.

Se mantiene la mezcla en

baño de agua a ebullición

durante 5 minutos para luego

enfriar con agua helada.

Se añaden 5 ml de agua

destilada, y se deja

reposar por 15 minutos,

luego agitar.

Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado..

32



Diseñar y montar el sistema mini-reactor con invertasa inmovilizada, para

determinar los parámetros cinéticos de la enzima.

La forma usual de usual de determinar los parámetros cinéticos es a través de

mediciones de velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de

sacarosa en un reactor por lote. La manera más adecuada de obtenerlos es por

linealización de la ecuación cinética. Para ello emplearemos el método de los

inversos o Lineweaver – Burke, para un modelo cinético simple

V = K sK + s

La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra

de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

33



Métodos de linealización para determinar parámetros cinéticos

Método Eje Y

Eje X

Intercepto Eje Y

InterceptoEje X

Pendiente

Lineweaver – Burke 1/v 1/s 1/v -1/k k/V

Hames s/v S k/V -k 1/v

Eadie – Hofstee V v/s V v/k -k

Figura 02: Determinación de parámetros cinéticos mediante método de inversos de Lineweaver – Burke

1/s-1/KAP

1/VAP

1/v

KAP/VAP

34



VI. RESULTADOS

A. DETERMINACION DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMATICA

DILUCIÓN ABSORBANCIA 01:05 0.48101:05 0.801:10 0.44801:10 0.368

B. SUSTRATO 0.014B. ENZIMA 0.239

GRUPO A-1DILUCION 1:1

Para la determinación de la actividad de la enzima, utilizamos preparados enzimaticos con distinta concentración para evaluar la formación de producto en el tiempo. En todos los casos se observa que aproximadamente después de 15 minutos de reacción, la producción decae.

Las pendientes de las rectas, nos permiten determinar la actividad enzimática.

TIEMPO (min) CONC. (g/L) Conc. Ajustada

0 0 05 5.026153115 4.596291013

10 8.818354731 8.3884926315 9.267712791 8.83785068920 7.365668093 6.935805991

BLANCO ENZIMA 0.429862102BLANCO

SUSTRATO-0.10508797 0

35





TIEMPO (min) CONC. (g/L) conc. Ajustada

0 0 05 0.4914 0.392018165

10 1.9887 1.88931816515 2.5878 2.48841816520 1.1826 1.083218165

BLANCO ENZIMA 0.1 0.099381835BLANCO

SUSTRATO0.027 0

DILUCIÓN ABSORBANCIA 01:03 0.12701:03 0.33701:03 0.42101:03 0.224

TIEMPO (min) CONC. (g/L) Conc. Ajustada

0 0 05 2.006 1.906618165

10 3.1754 3.07601816515 5.0982 4.99881816520 3.1012 3.001818165

BLANCO ENZIMA 0.1 0.099381835BLANCO

SUSTRATO0.033 0

DILUCIÓN ABSORBANCIA01:01 0.90201:02 0.72601:03 0.77301:03 0.493

36



Las ecuaciones de las rectas halladas son las sgts:

Y1= 0.8388X+0.134

Y2= 0.3233X+0.0705

Y3= 0.1793X-0.1519

37



METODO DE BRADFORD PARA LA DETERMINACION DE PROTEINAS

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.20

0.10.20.30.40.50.60.7

f(x) = 0.551447368421053 x + 0.0458496240601504R² = 0.981666890011033

CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINA

Sol. Std. Albúmina 1 g/L

Series2Linear (Series2)

Concentración

ABS

Solo consideramos la concentración de proteínas en un rango 0.5-1 para obtener la ecuación de la recta con R=0.9959, que permite el calculo de concentración de proteínas en las

muestras con mayor exactitud.

Solo consideramos la concentración de proteínas en un rango 0.5-1 para obtener la ecuación de la recta con R=0.9959, que permite el calculo de concentración de proteínas en las

muestras con mayor exactitud.

Concentración g/l Abs.

1 0.577

0.7 0.425

0.5 0.348

0.3 0.239

0.2 0.173

0.1 0.103

0 0

38



B. DETERMINACION DE VELOCIDAD INICIAL DE REACCION A DISITINTAS CONCENTRACIONES DE SUSTRATOS

Técnica experimental:

(A) Buffer acetato 0.05M, pH= 4.7(B) Preparado Enzimático, extracto crudo de invertasa(C) Solución sustrato de sacarosa So=20gr/L

Para la determinación de la velocidad inicial de reacción Vi o también actividad inicial, se prepararon solucions de sacarosa con distinta concentración como se muestra en la tabla siguiente

para medir la efectividad de la enzima en la formación de producto a través del tiempo. Solo se tomaron las evaluaron indicadas por motivos de tiempo

SOLUCIONES DE SACAROSA A DISTINTA CONCENTRACION

N° muestra

Solución A (ml)

Solución B (ml)

Solución C (ml)

Sacarosa (g/l)

1 26 1 3 22 23 1 6 43 20 1 9 64 18 1 11 7.35 15 1 14 9.36 12 1 17 11.37 9 1 20 13.38 6 1 23 15.39 3 1 26 17.3

10 0 1 29 19.3

39



DNS/Min 2 3 4 7 8 1002 0.233 0.158 0.192 0.120 0.105 0.0326 0.397 0.298 0.401 0.201 0.151 0.113

10 0.649 0.456 0.671 0.314 0.212 0.23215 0.923 0.702 0.924 0.454 0.266 0.378

dilución 01:04 01:04 01:05DNS/Min 2 3 4 7 8 10

02 0.482807731 0.330213632 0.798779247 1.011597152 0.88952187 0.369277726 0.816480163 0.615055951 1.64923703 1.670803662 1.26388606 1.19328586

10 1.329196338 0.936520855 2.747914547 2.590437436 1.76032553 2.4038657215 1.886673449 1.437029502 3.777416073 3.729806714 2.19979654 3.88911495

La ecuación de la curva de calibrado DNS para la determinar la concentración de producto es:

Abs= x*0.4915 – 0.0043

Los resultados de absorbancia obtenidos para cada una de las muestras se muestan a en los cuadros siguientes junto a las concentraciones de producto obtenidos con la ecuación de la curva de calibrado. Para la determinación de Vi se utilizaron las rectas obtenidas al relacionar Concentracion vs Tiempo. Las graficas se muestran también.

40



Las ecuaciones de las rectas obtenidas son las siguientes:

Y2= 0.11X+0.2209Y3= 0.0851X+0.1278Y4= 0.2329X+0.3218Y7= 0.2116X+0.5048Y8= 0.1027X+0.6811Y10=0.2746X-0.3012

Se puede observar que no hay estabilidad en la variación de la Vi en relación a la concentración inicial de sustrato. Estos fueron los resultados obtenidos por ello se

reportan para favorecer la discusión.Se puede observar que no hay estabilidad en la variación de la Vi en relación a la concentración inicial de sustrato.esto también se observa en la pendiente de las

curvas mostradas en el grafic siguiente.

41



C. DETERMINACION DE LOS PARAMETROS CINETICOS DE LA ENZIMA LIBRE

Para la determinación de los parámetros cinéticos Vmax Y Kmax se utilizan los valores de Vi hallados anteriormente. El modelo utilizado es la ecuación de Lineawer-Burk. Los valores de los parsámetros utilizados se muestran a continuación.

42



Así tendremos que:

1/V= (Kmax/Vmax)*(1/S) + (1/Vmax)

RELACIONANDO:

(1/Vap)= 4.227

Entonces: Vap= 0.2340

(Kap/Vap)= 24.566

Entonces: Kap= 5.7493

Concluimos que los parámetros cinéticos de la enzima para los cálculos del Grupo A

Y= 24.566 (1/S) + 4.227

muestras s 1/s Vi 1/Vi2 4 0.25 0.11 9.0909090913 6 0.166666667 0.0851 11.750881324 9.3 0.107526882 0.2329 4.2936882787 13.3 0.07518797 0.2116 4.7258979218 15.3 0.065359477 0.1027 9.737098345

10 19.3 0.051813472 0.2746 3.641660597

43



V K0.23403857 5.7493915

sacarosa g/lDNS/Min 1 3 5 7 9 10

02 0.3098678 0.59267548 0.6889115 1.42950153 1.0103764 1.046998986 0.6231943 1.17660224 0.90050865 2.3491353 2.03173957 2.08870804

10 0.9385554 1.69338759 2.10498474 2.93102747 3.04089522 2.9147507615 1.2172940 2.19593082 3.03682604 3.94832146 4.0785351 3.9768057

activ(g/l*mi) 0.0703 0.1233 0.1803 0.1893 0.2368 0.2232

DNS/Min 1 3 5 7 9 1002 0.148 0.287 0.165 0.347 0.244 0.2536 0.302 0.574 0.217 0.573 0.495 0.509

10 0.457 0.828 0.513 0.716 0.743 0.71215 0.594 1.075 0.742 0.966 0.998 0.973

Dilucion 01:02 01:02 01:02 01:02

Para efectos de comparación de resultados se muestran también los parámetros cinéticos obtenidos por el Grupo B, cuya linealidad en la grafica de Lneawer-Burk es de R=0.9807.Se muestran los valores de absorbancia y concentración que permiten determinar los valores de Vi y los cálculos posteriores.

44



En este caso se determinaron los parámetros cinéticos de la misma forma, obteniéndose:

Vmax= 0.288159 y Kmax= 6.32

En el grafico anterior también se observa la relación lineal entre la formación de producto y el tiempo en las soluciones de sacarosa.

s (g/l) 1/s Vi 1/a2 0.5 0.0703 14.22475116 0.16666667 0.1233 8.11030008

9.3 0.10752688 0.1803 5.546311713.3 0.07518797 0.1893 5.2826201817.3 0.05780347 0.2368 4.2229729719.3 0.05181347 0.2232 4.48028674

45



D. COMPORTAMIENTO DE LA ENZIMA INMOVILIZADA EN UN REACTOR POR LOTES

Para una mejor comprensión de los resultados obtenidos se muestran los cálculos de todos los grupos de trabajo. Se muestran los resultados del grupo A-1 y A-2, utilizando los parámetros cinéticos del grupo B por indicación del docente.

46



Cinética simple:

Como:

Vmáx = ke

Kmáx = k

sok

x−ln (1−x )=Vmax tkmax

V K0.288159 6.32

GRUPO A2 EJE Y EJE XDilucion TIEMPO

minABS P(gr/l) valores de

X(Ke*t)/k

01:08 0 0.034 0.33853428 0.0260411 001:08 30 0.159 2.70260047 0.20789234 1.3678433501:08 60 0.315 5.65295508 0.4348427 2.7356867101:08 90 0.506 9.26524823 0.7127114 4.1035300601:08 120 0.536 9.83262411 0.7563557 5.4713734201:08 150 0.645 11.8940898 0.91492999 6.8392167701:08 180 0.689 12.7262411 0.97894163 8.2070601301:08 210 0.71 13.1234043 1.00949264 9.5749034801:08 240 0.724 13.3881797 1.02985997 10.9427468

47



GRUPO A1 EJE Y EJE XDilucion TIEMPO(min ABS P(gr/l) valores de

X(Ke*t)/k

01:10 0 0 0 0 001:10 60 0.175 0.33096927 0.01654846 2.7356867101:10 120 0.37 4.94089835 0.24704492 5.4713734201:10 150 0.522 8.53427896 0.42671395 6.8392167701:10 180 0.567 9.59810875 0.47990544 8.2070601301:10 210 0.663 11.8676123 0.59338061 9.5749034801:10 240 0.701 12.7659574 0.63829787 10.9427468

Utillzando nuestros propios valores de :

V K0.2340385

75.7493915

48



EJE Y EJE XDilucion TIEMPO

minABS P(gr/l) valores de

x(Ke*t)/k

01:10 0 0 0 0 001:10 30 0.072 0 0 1.2212000

301:10 60 0.175 0.3309692

70.0165484

62.4424000

701:10 90 0.273 2.6477541

40.1323877

13.6636001

01:10 120 0.37 4.94089835

0.24704492

4.88480013

01:10 150 0.522 8.53427896

0.42671395

6.10600016

01:10 180 0.567 9.59810875

0.47990544

7.3272002

01:10 210 0.663 11.8676123

0.59338061

8.54840023

01:10 240 0.701 12.7659574

0.63829787

9.76960026

49



0 2 4 6 8 10 120

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

f(x) = 0.419323439628367 ln(x) + 0.0684365696422041R² = 0.98275129886298

Comportamiento del reactor por lote A-2 parametros B

Series2Logarithmic (Series2)

ke*t/K

Grad

o de

conv

ersio

n X

Se muestra a continuación la grafica del comportamiento del reactor por lote con la enzima inmovilizada. Para efectos del calculo no se considero el punto 0.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 110

0.10.20.30.40.50.60.7

f(x) = 0.473285447935183 ln(x) − 0.449539281845545R² = 0.978148721235465

Comportamiento del reactor por loteA-1 parametros A


ke*t/K

Grad

o de

conv

ersio

n X

50



Grupo Parametro K Si (g/l) Si/K

A-1 5.7493915 20 3.4786

A-1 6.32366078 20 3.1627

A-2 6.32366078 13 2.0557

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

0.10.20.30.40.50.60.7

f(x) = 0.460644397803572 ln(x) − 0.473788433573463R² = 0.978502989042044

Comportamiento del reactor por loteA-1 parametros B


ke*t/K

Grad

o de

conv

ersio

n X

La relación Si/K que describe el comportamiento del reactor por lote con la enzma inmovilizada se muestra a continuación.

51



52



VII. DISCUSIONES

En la presente practica de laboratorio se realizaron los procedimientos para un caso

de biocatalisis enzimática utilizando invertasa inmovilizada con alginato de sodio y

actunado con sacarosa como sustrato. Los procedmientos incluyeron la determinación

del rango de linealidad de la enzima, los parámetros cinéticos de la enzima libre y el

análisis del comportamiento de un sistema minireactor por lotes.

En la determinación del rango de linealidad, se observa que a partir de 10 minutos de

reacción enzimática, la formación de producto decae invariablemente en todos los

casos analizados, alcanzándose un mayor concentración de producto cuando el

extracto enzimático esta menos diluido.

La determinación de la velocidad inicial de reacción o actividad inicial de la enzima,

el análisis del comportamiento de la enzima a distintas concentraciones de sustrato

( 2-19.3 g/l). en el caso del grupo B, esta actividad aumenta con la concentración de

sustrato inicial, en el caso del grupo A-1 no hay un comportamiento estable

susceptible al modelamiento como se describió en los resultados. Es por ello que la

ecuación de Lineawer-Burk utilizada para la determinación de los parámetros arroja

resultados tan disimiles de Vmax ( 0.2340 y 0.288159) y Kmax ( 5.7494 y 6.32) para

el grupo A-1 y B respectivamente. Sin embargo en ambos casos, el valor X o grado

de conversión de sustrato aumenta en el tiempo.

El análisis del comportamiento del reactor y la relación Si/K se muestra también en

los resultados.

La invertasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de la sacarosa en D-fructosa y

Dglucosa. En la levadura común, dicha enzima se encuentra como un complejo

fosfomanano proteína localizada en el espacio periplasmático y su función hidrolizar

la sacarosa proveniente del medio ya que no está descripta la existencia de

transportadores específicos para sacarosa en la membrana plasmática (UNQ, 2005)

53



La variación en la actividad enzimática de la invertasa puede deberse a su condición de inmovilizada.

La cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del soporte,

la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de difusión y muchos

otros parámetros. Además de estos factores, otros como las velocidades de agitación

y las tasas de flujo desempeñan también un papel importante en la cinética aparente

de las enzimas inmovilizadas.

A manera de ejemplo se presenta la tabla 1.1, en que se muestran los cambios de KM

al inmovilizar la enzima; Weetall informa de un caso muy claro en que el valor de KM

depende directamente del flujo del sustrato; encontró que KM disminuye cuando el

flujo aumenta, lo que explica que a medida que se incrementa el flujo, la turbulencia

también aumenta y disminuye la capa estática del liquido alrededor de cada

partícula, lo que lógicamente reduce el efecto de transferencia de masa.

Tabla 1.1 Comparación de valores de KM de algunas enzimas en solución e

inmovilizadas

KM (milimolar)ENZIMA SUSTRATO SOLUCIÓN INMOVILIZADAInvertasa Sacarosa 0.448 0.448Arilsulfatasa p-nitrofenilfosfato 1.85 1.57Glucoamilasa Almidón 1.22 0.30Ureasa urea 10.0 7.60Glucosa oxidasa glucosa 7.70 6.80L-amioacido oxidasa

L-leucina 1.00 4.00

Alcalino fosfatasa p-nitrofenilfosfato 0.10 2.90* Las enzimas están inmovilizadas en partículas de vidrio poroso (96% sílice)

La inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la estabilidad

enzimática como también permite reciclar la enzima y separarla fácilmente del

54



producto, lo cual tiene beneficios económicos. Dichas ventajas pueden aplicarse a la

producción de jarabes fructosados a partir de sacarosa si se cuenta con un método

para inmovilizar y un soporte barato, que no afecte la especificidad de sustrato y la

velocidad de reacción de la invertasa (β-fructofuranosidasa EC: 3.2.1.26).

Según “HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR INVERTASA INMOVILIZADA

EN NYLON-6 EN UN REACTOR CONTINUO.PDF”:

Según INMOBILIZED ENZYMES: THEORY, METHODS OF STUDY AND

APPLICATIONS.PDF: A menudo, la inmovilización altera significativamente el

comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su

estabilidad, además de que la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el

cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos,

productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) el cual se encuentran en

interface: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la

enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de

tipo difusional, estérico y del microentorno.

VIII. CONCLUSIONES

55



Se diseño y realizo una experiencia de estudio cinético con un preparado

enzimático en bruto de invertasa de levadura de panadería en sus formas solubles

e inmovilizadas.

La actividad de la enzima invertasa diluida 1:1, 1:2 y 1:3 en tampón, mantiene su

rango de linealidad hasta por 10 minutos de reacción con el sustrato.

Las velocidades iniciales de reacción o actividades iniciales obtenidas no tienen

relación con la concentración de sustrato inicial.

Para la experiencia A-1 los parámetros cinéticos obtenidos con la ecuación de

Lineawer-Burk fueron de Vmax y Km de 0.2340 mmol/mlmin y 5.7494.

La relación Si/K para nuestra experiencia fue de 3.478.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

SCRIBAN RENE; Biotecnologia Segunda Edicion 1985; Editorial El Manual

Moderno, S.A., de C.V. ; Mexico, D.F.; pp. 254 – 315.

GACESA P., y HUBBLE J.; Tecnología de Enzimas 1990; Editorial Acribia

S.A; ZARAGOZA – ESPAÑA; cap. 6.

Ingeniería Bioquímica, QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, primera edición.

México, edit. Alhomba, 1981.

Cinética enzimática. Profesor Andrés Illanes Frontaura. Escuela de Ingeniería

Bioquímica. Universidad Católica de Valparaíso.

Reactores Enzimáticos. Profesor Agustín López Munguia. Departamento de

Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.

FUSIÓN TRADUCCIONAL DE LA INVERTASA ZMINVB DE Zymomonas

mobilis A UN DOMÍNIO DE UNIÓN A CELULASA.PDF

56



HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR INVERTASA INMOVILIZADA EN

NYLON-6 EN UN REACTOR CONTINUO.PDF

ENZIMAS: QUÉ SON Y PARA QUE SIRVE.PDF

Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications.pdf

http://www.bio.mtu.edu/campbell/401lec11p6.html

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