bretta

Estabilizacin biolgica de los VinosActualizacin de conocimientos

www.intellioeno.wix.com/intellioeno

Christophe Gerland

Organizado por APM y APEAA - LA ENOTECA

El 3 de junio 2015

[email protected]

SUMMARIO DE LA PRESENTACION

Los microorganismos mas peligrosos y los puntos llave en sus manejos

Lo que piden los clientes y la legislacion

Importancia de los biofilms

Los puntos llave al momento del embotellamento

Parte 1

Los microorganismos mas peligrosos

Los puntos llave en sus manejos

Enemigos vinicos n1

Brettanomyces

Lactobacillus

Zygosaccharomyces bailii

Enemigos vinicos n1

Brettanomyces

Lactobacillus

Levaduras de refermentacion+ bacterias aceticas+ Pediococcus

Brettanomyces : actualizacin al nivel mondial

Subida de la resistencia al SO2

Sinergia negativa de otros microorganismos

Mejor manejo de la esterilizacin del roble (barricas, toneles)

Mejoracion de las tcnicas de control

Mejoracion de las tcnicas de eliminacin

Un punto negro : el factor HUMANO

PLAN DE CONTROL PREVENTIVOHACCP

PORQUE HABLAR DE BRETTANOMYCES AL MOMENTO DEL EMBOTELLAMANTO ?

Se detectan aumento de 4EP en botella durante su crianza

Se detectan Brettanomyces en la lina de embotellamento

CONTROL DE BRETTANOMYCES EN LA LINEA DE EMBOTELLADO

ATP BRETTANOMYCES

valvula filtro 8 ausencia

bec rinceuse 10 Ausencia

bec rinceuse 9 Ausencia

BEC 1 28 presencia *



BEC 29 84 non effectu

BOUCHEUSE 15 ausencia

PRESENCIA DETECTADA EN UNA LINA CON LIMPIEZA CON VAPOR

CADA MANANA

Y CHIMICA CADA FIN DE SEMANA

BRETTANOMYCES : AUMENTO DE SU RESISTENCIA AL SULFUROSO

Ms exactamente : identificacin cada vez ms frecuente de cepas muy

resistentes

Curtin , Australia

Aislamiento de 244 cepas de Brett en Australia

3 genotipos ms frecuentes

Resistencia al sulfuroso respectivamente de 30, 40 y 75 mg/L (valor mximo

donde se observa crecimiento en medio sinttico pH no indicado)

Edwards, USA

Identificacin de 2 cepas de Brett. que pueden multiplicarse en un vino de

Syrah despus de adicionar 0,89 mg/L de SO2 molecular activo

Despus de 1 da, no se detectan en medio de cultivo (unicamente en

epifluorescencia = viable pero no cultivable) , despus de 10 dias multiplicacin

para volver al nivel inicial de 1 milln/mL

Coulon e Lonvaud, Bordeaux (Symposium international oenologie Bordeaux

2011)

Han islado en terroirs de Bordeaux diversas cepas de Brett resistentes a mas

de 0.8 mg/L de SO2 molecular activo

Sinergia negativa de otros microorganismos

Caftarico coutarico fertarico

acido cafeico acide coumarique acide frulique

4-vinil-catecol 4-vinil-fenol 4-vinil-guaacol

Aspergillus niger

cinnamyl esterasa

Levaduras POF+

Cinnamato

decarboxilasa

4-etil-catecol 4-etil-phnol 4-etil-guaacol

Brettanomyces

vinil fenol reductasa

Brettanomyces

Cinnamato dcarboxilasa

MECANISMOS DE PRODUCION DE FENOLES VOLATILES

Levaduras ?

cinnamyl esterasa

2013

Osborne, 2013

CAPACIDAD DIFERENTE DE LAS CEPAS DE OENOCOCCUS OENI

A TRANSFORMAR COUTARICO EN COUMARICO

Edwards, 2013

LAS CEPAS DE BRETTANOMYCES NO PUEDEN HACER ESTA TRANSFORMACION

Aspergillus niger

cinnamyl estrase

Levures POF+

Cinnamate

dcarboxylase

Brettanomyces

vinyl phnol reductase

Brettanomyces

Cinnamate dcarboxylase

Levures ?

cinnamyl estrase

Brettanomyces

cinnamyl estrase

Edwards, 2013Oenococcus oeni

cinnamyl esterasa

Osborne, 2013

Gran impacto de la

Cepa que hace la FML

Interes de hacer la

Analisis

Del coumarico libre

Caftarico coutarico fertarico

acido cafeico acide coumarique acide frulique

4-vinil-catecol 4-vinil-fenol 4-vinil-guaacol

4-etil-catecol 4-etil-phnol 4-etil-guaacol

MECANISMOS DE PRODUCION DE FENOLES VOLATILES

Mejoracion de las tcnicas de control

Microscopa

Epifluorescencia

Citometra de flujo

Biologa molecular : Q-PCR

Cultivo en medios especficos

Medicin de ATP

Llegada de tecnicas rapidasY especificas

Mejor manejo de la esterilizacin del roble (barricas, toneles)

Debil relargacion de Viable Cultivable.Relargacion lenta VNC a 28 dias

Vapor

Cero Brett VC despus de la limpieza

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

Barrique 1 Barrique 2(Mchage)

Barrique 3(Oxygne -)

bre

tt V

C e

n U

FC/g

de

bo

is

Analisis de antes/despues del proceso

Avant

Aprs

Finition

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

J+7 J+28 J+7 J+28 J+7 J+28


Barrique 3(Oxygne - )

Bre

tt e

n U

FC/m

L

Evolucin del vinoPtri (VC)

Cytomtrie (VNC)

2 barriques sur 3 subissent un relargage de Brett VC dans le vin strile

5 min leau

ozone 850-900

ppm

Agua ozonizada

Aprs nettoyage, il reste des Brett VC.Zro Brett VC aprs finition mchage,

mais il en reste aprs oxygne - !

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06


Barrique 3(Oxygne -

)

bre

tt V

C e

n U

FC/g

de

bo

isAnalisis de la madera

antes/despues del tratamiento

Avant

Aprs

Finition

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

J+7 J+28 J+7 J+28 J+7 J+28


Barrique 3(Oxygne -)

Bre

tt e

n U

FC/m

L

Evolucion del vinoPtri (VC)

Cytomtrie (VNC)

Effectividad de tecnicas de esterilizacion de barricas

VaporMechado

Ultra-sonidos

Agua caliente Sosa/permanganatoAgua ozonizada

Entran en profundidad

Unicamente en superficia

No desinfectan totalmenteLa superficia

Existan ahora sistema de control del roblePROTOCOLO DE CONTROL MICROBIOLOGICO DE LAS BARRICAS

1

2

Wood seeker se conecta con una perceuse y permite de tomar muestra de roble hasta 1 cm de profundidad

Inoculacion de sniffbrett y incubacion. Lectura de 1 a 10 dias, acopleado con citometria a partir de 3 dias.

3El resultado permite de ver y despues optimizar el protocolo de limpieza-desinfecion de las barricas.

Mejoracion de las tcnicas de eliminacin

TECNICAS DE ELIMINACION DE LOS BRETTDE LOS VINOS ANTES DE EMBOTELLAR

Centrifugacion o clarificacion - sulfitacion

Filtracion frontal

Microfiltracion tangencial

Flash-pasteurizacion

DMDC

Chitosan

Embotellamento al caliente

Alta pression

UVB

Micro-ondas

Ultra-sonidos

Un punto negro : el factor HUMANO

Importancia del higiene en la bodega

Ponto muito crtico: as bombas

PLAN DE CONTROL PREVENTIVOHACCP

0,1 g/L G+F consumido

implica la produccin de

300 a 500 g/L de 4-EP

A CONSIDERAR

ANTES DEL

EMBOTELLADO

Coulter, AWITC, 2007

El anlisis fiable de glucosa/fructosa

es fundamental

por cuantificar el riesgo de desviacin

(mtodo preciso para detectar 0,1 g/L

HPLC o enzimtico especialmente calibrado)

Identificar los vinos con riesgo : por la analisis fina del fructosa

FRUCTOSE > 0,100 g/L

Ni 4EP ni Brett

Mais vin risque si arrive une contamination

Fructose

Metoda del analisis de la fructosaMaison Loron Pre et filsadaptacion de la metoda enzimatica

analisador sequencial Modelo Arena 30 de Thermofisher

calibracion effectuada con soluciones habituales (patrones de la UOEF) pero disluido al 1/10

Tomada de muestra multiplicada por 10

El agrego dosificado de fructosa (0.5 g/L) en diferente tipos de vinos (blanco, rosado, tinto, tintosmuy tanicos) se ha reencontrado en todos los casos

Metoda classica : precision +/- 0,5 g/L

Metoda optimizada : precision +/- 0,05 g/L

Secundo microorganismo en frecuenciaLactobacillus

Homofermentativos : plantarum, cellobiosus

Las menos peligrosas (plantarum usada en

Siembras) an si algunas cepas de plantarum

pueden provocar la enfermedad del rebote

o tourne (degradacin del cido tartrico)

Heterofermentativas : hilgardii,

brevis,

Picadura lctica

Enfermedad del rebote o tourne

Enfermedad del amargor (glicerol acroleina)Gusto a ratn (produccin de Tetrahidroxipiridina)

kunkeei, naglei : pueden producir 2 g/L de cido

actico en 2 das

Secundo microorganismo en frecuenciaLactobacillus

Gusto de laine mouille

Gusto a raton

Etil-fenol

Parada de fermentacion con picadura lactica

Gusto a raton

Tercero microorganismo en frecuenciaLevaduras de refermentacin

Zygosaccharomyces bailii

fuerte resistencia al alcohol y al SO2, osmotolerante(puede contaminar las MCR)

cultivo en medio +1% cido actico

puede producir mucha acidez voltil (ej. vendimias tardas)

prevencin/lucha : higiene, manejo de las fermentaciones, filtracin, sorbato

Saccharomycodes ludwigii

Quarto microorganismo en frecuenciaBacterias acticas

Acetobacter (aceti y pasteurianus)

y Gluconobacter (oxydans)

Las Acetobacter son muy resistentes al alcohol

G. Oxydans prefiere el azcar (mostos)

Las 3 se multiplican bien a partir de glicerol

Poblaciones ms grande en bayas botritizadas

Pueden producir grandes cantidades de acidez

voltil, en condiciones aerobias

Mientras ms tengamos oxgeno disuelto, ms alto es

el riesgo.

Posible durante las fermentaciones pero representa

riesgo sobre todo luego del trasiego de barricas, o en

vinos dbilmente sulfitados.

Problemas recientes en botellas conservadas

verticalmente.

Acetobacter

Quinto microorganismoPediococcus

Especies encontradas en los vinos : damnosus (mayoritariamente),

cerevisiae, pentosaceus

Puede provocar la enfermedad de la grasa (produccin de glucanos dextrano = Leuconostoc mesenteroides)

Test gentico de determinacin del carcter filante (ver ms adelante)Produce en general aminas biogenas (en gran cantidad)

Homofermentativas pero producen cid actico y cido lctico por la va de las

pentosas

Gusto a ratn para algunas cepas

LOS MICROORGANISMOS A MANEJAR AL MOMENTO DEL EMBOTELLAMENTO

- Brettanomyces

- Zygosaccharomyces y Saccharomycodes

- Lactobacillus

- Acetobacter

- Pediococcus

Otros como Kloeckera y Schizosaccharomyces son problematicos mas durante la vinificacion

TECNICAS DE ESTABILIZACION MICROBIOLOGICA ANTES DE EMBOTELLAR



Filtracion frontal



DMDC

Chitosan

Toxinas producidas por otros hongos


Alta pression

UVB

Micro-ondas

Ultra-sonidos

Agua ozonizada o ozono gaz ?


Filtracion que tipo ?

Eliminacion de los Brettanomyces por filtracion

ejemplosEnsayos de diferentes niveles de porosidad de filtros de placas

0,00E+00

5,00E+02

1,00E+03

1,50E+03

2,00E+03

2,50E+03

3,00E+03

3,50E+03

Brett (/mL)

1993 1994 1995

AOC Pauillac - analisis en 2006

Non filtr

10 m

4 m

1 m

0,3 m

0

500

1000

1500

2000

4-EP (g/L)

1993 1994 1995

AOC Pauillac - analisis en 2006

Non filtr

10 m

4 m

1 m

0,3 m

Renouf, Lonvaud

Am. J. Enol. Vitic.

58:3 (2007)


ejemplos

Renouf, Lonvaud

Am. J. Enol. Vitic.

58:3 (2007)

3,60E+03

1,25E+02

1,40E+03

0,00E+00

1,00E+03

2,00E+03

3,00E+03

4,00E+03

5,00E+03

6,00E+03

Brett(/mL)

1996 1997 1998

AOC ST EMILION - analisis en 2006

no filtrado

7 m

4 m

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4-EP (g/L)

1996 1997 1998

AOC ST EMILION - analisis en 2006

Non filtr

7 m

4 m

Ensayos de diferentes niveles de porosidad de filtros de placas

- Todo tipo de filtracion elimina una grande parte de los Brettanomyces

- Filtracion al nivel de 1 m apporte una gran securez pero no una garantia total

- Nuevas placas a base de cellulosa parecen muy effectivas

- Ultra-importante : desinfecion de los filtros


Uso de productos enologicos

SO2

Chitosan

DMDC (Velcorin)

Sorbato de potassium

Dosis letal de DMDC (vino con 500 UFC/mL)

Acetobacter pasteurianus 80 mg/L

Botrytis cinerea 100

Brettanomyces spp.

Evaluation of the inhibitory effect of dimethyl dicarbonate (DMDC) against wine microorganismsA. Costa, A. Barata, M. Malfeito-Ferreira

chitosan

Polimero producido por hongos (como las enzimas pectoliticas)

Elimina una parte pero no todos los Brett

Necessidad de hacer un trasiego por eliminarlo

No hay residuo activo en el vino

Attencion effectividad parcial sobre bacterias lacticas (no poner antes de FML)

NO ES UN PRODUCTO POR EL MOMENTO DEL EMBOTELLAMENTO

Pero se usa ahora mucho durante en crianza en Francia

TECNICAS DE ELIMINACION DE LAS OTRAS LEVADURASDE LOS VINOS ANTES DE EMBOTELLAR


Filtracion



DMDC


Sorbato de potassium

Alta pression tecnicas fisicas (Bartowsky, 2008)

UVB (Tebaldi, 2011)

Campos pulsados (Poulard, 2011)

Micro-ondas

Ultra-sonidos (Jiranek et al. 2008)

Embotellado al caliente

3.5.4. EMBOUTEILLAGE A CHAUD (OENO 9/97)

Dfinition :

Mise en bouteille du vin pralablement rchauff et bouchage

immdiat de la bouteille.

Objectifs : a) La stabilisation biologique du vin ; b) L'limination de l'oxygne ; c) La stabilisation physico-chimique.

Prescription:

Le vin ne doit pas tre rchauff plus de 45C.

Recommandation de l'OIV :

Admis.

ALTA PRESSION

TECNICAS DE ELIMINACION DE LAS BACTERIASDE LOS VINOS ANTES DE EMBOTELLAR

Centrifugacion o clarificacion - sulfitacion Filtracion frontal Microfiltracion tangencial Flash-pasteurizacion Lisozima (minimum 3 semanas antes del EMB) Embotellamento al caliente

Alta pression UVB Micro-ondas Ultra-sonidos

ELIMINACION DE LAS BACTERIAS LACTICAS CON LISOZIMA

MEJOR DURANTE LAS VINIFICACIONES

EN TINTO AGREGAR 3 SEMANAS ANTES DE EMBOTELLAMENTO

EN BLANCOS, ELIMINAR LA LISOZIMA RESIDUAL ANTES DE EMBOTELLAR

REANIMO DEL USO EN EUROPA LIGADO A LA PUBLICACION POR FIN DE LA LEY DE ETIQUETADO : unicamente si el vino tiene mas que 0,25 mg/L de lisozima

PROTOCOLO DE ELIMINACION DE LISOZIMA (vinos blancos o rosados)

1. ELECCION EN PRUEBA DE LABORATORIO DE LA DOSIS DE METATARTARICO

2. TRATAMIENTO CON EL METATARTARICO

3. ELECCION DE LA DOSIS DE BENTONITA PARA REMOVER LAS PROTEINAS

INESTABLES DEL VINO

4. TRATAMIENTO EN DEPOSITO : adicion del metatartarico con una mezcla perfecta,

Dejar precipitar, trasiegar y tratar despus con la bentonita make a well done racking

TRATAMIENTO SIN IMPACTOORGANOLEPTICO

ENCOLADO CON ACIDO METATARTARICO

ver www.lysoclub.compor el protocolo completo

0

10

20

30

40

50

60

70

0 2 4 6 8 10 12

METARTARIC ADDED (g/hL)

TU

RB

IDIT

Y (

NT

U)

WINE TREATED WITH LYSOZYME

WINE AFTER METATARTARIC

FINING

DETECION DE LA LISOZIMA RESIDUAL EN LOS VINOS CON TECNICA ELISA

ANALYSIS ON WINES FROM ARGENTINA

REF. DO 450 lisozima (mg/L) VINO

VINOS

COMMERCIALES EN

BOTELLA

analisis del

14/8/2012

B5 0.358 0,004 CRIANZA VIOGNIER BARRIQUA

B6 0.355 0,004 CRIANZA VIOGNIER TANQUE

R6 1.914 0,307 CRIANZA MALBEC

R7 0.521 0,036 CRIANZA TINTO

R8 2.572 >0,4 CRIANZA VIS B1207

R9 0.528 0,037 MALBEC RESERVA 2009 BOTELLA *

R10 1.234 0,175 SYRAH RESERVA 2011 BOTELLA *

R11 2.645 >0,4 CRIANZA B1204

R12 0.488 0,03 SELEC PARC MALBEC 09 BOTELLA *

R13 0.358 0,004 LB SEL CABERNET SAUVIGNON 2010 BOTELLA *

R14 2.209 0,364 PINOT NOIIR CRIANZA AUSTRALIA 0,163

R15 2.156 0,354 SYRAH CRIANZA AUSTRALIA 0,081

En verde los vinos que son debajo de la limita oiv de 0,25 mg/L

ELIMINACION DE LAS BACTERIAS ACETICAS ?

SO2 NO TAN EFFECTIVO

CUIDAD A LAS BOTELLAS CON O2 (screw caps si no es bien manejado, mal manejo del embotellamento)

MANEJAR BIEN LAS VINIFICACIONES, Y LA HIGIENA PREVENTIVA

Parte 2

Lo que piden los clientes

Lo que pide la legislacion

Lo que piden los clientes :

No hay legislacion en terma de cantidad de micro-organismo limite Practicas comerciales :

Vinos secos :

Lo que pide la legislacion

CODEX ALIMENTARIUS

HYGIENE DES DENREES ALIMENTAIRES texte de base 4me dition

Obligacion de limpiezaY desinfecion antesDe poner un vino en Un deposito, botella,..

Parte 3

Como detectar y eliminar los biofilms

Hay cuasi ningun estudia en el mundo del vino

Pocas estudias en vino

Estudia de los fenomenos

IFV Tours (France)

Parte 4

Los puntos llave al momento del embotellamento

Vinos

Materiales

Aire

Adaptacion del processo

Contaminacion por el aire ambiante ??

Analysis of airborne yeast in one winery over a period of one yearE. Ocna, P. Garijob, S. Sanza, C. Olartea, R. Lpezb, P. Santamarab, A.R. Gutirreza, ,

a ICVV, Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (Universidad de La Rioja, CSIC), C/Madre de Dios 51, 26006 Logroo, Spainb ICVV, Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (Gobierno de La Rioja, CSIC), C/Madre de Dios 51, 26006 Logroo, Spain

The airborne yeast flora associated with four different areas in a Spanish winery was analyzed monthly over the course of one year (February 2008January 2009), in order to characterize the yeasts in this particular ecosystem, an aspect relatively unknown until now. The sampling areas were: vinification, bottling, cask aging and bottle cellar aging. 382 yeasts were identified from two different culture media: one generic for yeasts and the other selective for the Brettanomyces/Dekkera genus. The levels of yeasts present in the air throughout the year were low and the highest presence of yeasts was in the bottling area. Most of the yeasts isolated were members of the non-Saccharomyces groups. Yeasts of the Saccharomyces cerevisiae species were only detected in the air in the vinification area during the vinification period. Sporidiobolus and Cryptococcus were the dominant genera in the air and they were found continuously in every area analyzed. The spoilage yeast Brettanomyces/Dekkera was not detected in any sampling made.

PRECAUCION MINIMA : poner pression positiva en la sala de embotellamento

Contaminacion del vino

Hacer un control microbiologico del vino previo

Adaptar el nivel y protocolo de filtracion a la contaminacion inicial

Controlar la efficacidad de la filtracion

Controlar la higiena de la lina de embotellamento

Necessidad de un buon manejo de la higiena en bodega

Hacer un plan de higiena

Selecionar los productos

Utilisar los protocolos de empleo adecuados

Importancia de la calidad del agua utilisada

Formar el personal

Securidad

CONTROL DE EFFECTIVIDAD : balance higienico

Contaminacion de los materiales en contacto con el vino

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