Tecnología del Café

13 de Abril 2015.

Cafeína, y su determinación cromatográfíca

Caffeine, and chromatographic determination

RESUMEN

La cafeína es una sustancia que se encuentra en ciertas plantas naturales y puede producirse sintéticamente en laboratorio. Se localiza en cantidades variables en las semillas, las hojas y los frutos de algunas plantas, donde actúa como un pesticida natural que paraliza y mata ciertos insectos que se alimentan de las plantas. Se encuentra en el café, té, chocolate, yoco, cacao y, en bebidas de cola y energéticas. El café es una de las fuentes de cafeína consumidas con mayor frecuencia aunque los expertos recomiendan generalmente limitar la ingesta en torno a 300 mg al día. La semilla de cafeto contiene un 2% de cafeína.

En 1943 se comprobó que un gramo diario de cafeína (equivalente a 10 tazas de café express o a 5 de café filtrado por goteo), absorbido durante una semana basta para inducir un cuadro carencial o síndrome de abstinencia. Dependiendo del procesado al que es sometido el café, se obtiene una mayor o menor cantidad de cafeína. Por lo general los cafés con tostado natural o mezcla son los que tienen una mayor cantidad de cafeína, seguidos de los cafés instantáneos. Los que menos cantidad tienen son los cafés naturales o mezclas descafeinados, seguidos de los cafés instantáneos descafeinados que son los que menos tienen de todos. (Calle, S.)

La determinación de la cafeína se suele llevar a cabo mediante técnicas de separación como HPLC (Cromatografía líquida de alta eficiencia), CE (Electroforesis capilar), TLC (Cromatografía de capa fina) o GC (Cromatografía de gases). A continuación se pone en manifiesto información relacionada con el concepto de café y cafeína así como su determinación y análisis cromatográfico.

Palabras clave: Café, cafeína, análisis cromatográfico.

ABSTRACT

Caffeine is a substance found in some natural plant and can be produced synthetically in the laboratory. Is found in varying quantities in the seeds, leaves and fruit of some plants, where it acts as a natural pesticide that paralyzes and kills certain insects that feed on plants. It is found in coffee, tea, chocolate, yoco, cacao and in colas and energy. Coffee is one of the sources of caffeine consumed more frequently although experts usually recommend limiting intake about 300 mg per day.

Coffee seed contains 2% caffeine. Already in 1943 it was found that one gram daily of caffeine (equivalent to 10 cups of espresso or coffee filter 5 drip), absorbed for a week is sufficient to induce a deficiency box or withdrawal. Depending on the processing that is subjected to coffee, a larger or smaller amount of caffeine is obtained. Usually natural roasted coffees or mixture are those which have higher amounts of caffeine, followed by instant coffees. The least amount they are natural or decaffeinated coffee blends, followed decaffeinated instant coffees that are the less fortunate of all. The determination of caffeine is usually carried out through separation techniques such as HPLC (high efficiency liquid chromatography), CE (capillary electrophoresis), TLC (thin layer chromatography) and GC (gas chromatography). Below is underlined related to the concept of coffee and caffeine information and its determination and chromatographic analysis.

Keywords: Coffee, caffeine, chromatographic analysis.

INTRODUCCIÓN

El primer café instantáneo fue inventado y patentado por el químico japonés Satori Kato, en Chicago, hacia el año 1900. Algunos años después el inglés George C. Washington, mientras vivía en Guatemala,  inventó el La cafeína es una sustancia que se encuentra en ciertas plantas naturales y puede producirse sintéticamente en laboratorio. Se localiza en cantidades variables en las semillas, las hojas y los frutos de algunas plantas, donde actúa como un pesticida natural que paraliza y mata ciertos insectos que se alimentan de las plantas. Se encuentra en el café, té, chocolate, yoco, cacao y, en bebidas de cola y energéticas. También se encuentran en bebidas que contienen guaraná y a menudo como ingrediente en los suplementos de pérdida de peso y energizantes, las bebidas deportivas, preparaciones herbales y analgésicos.

El café es una de las fuentes de cafeína consumidas con mayor frecuencia aunque los expertos recomiendan generalmente limitar la ingesta en torno a 300 mg al día. La cafeína ha sido consumida durante siglos a pesar de los intentos repetidos de prohibir su uso por motivos morales, económicos, médicos o políticos. El descubrimiento del café tuvo lugar en el siglo IX en Arabia y se cultivó por primera vez en Etiopía. En el siglo XV se desarrolló la técnica de tostar y moler los granos de café y el consumo de los productos con cafeína se expandió rápidamente por todo el mundo.

El Café soluble

El café soluble se obtiene por extracción industrial del café tostado y molido, para fabricar este importante producto de la industria cafetera, se prepara un extracto mezclando con agua caliente el café tostado y molido de forma tosca. Acto seguido se separa el agua del extracto. El producto se envasa al vacío en frascos de vidrio o latas que cerradas al vacío conservarán intactas sus cualidades de aroma y sabor por largos periodos de tiempo. El mayormente consumo es el de la primera variedad: secado o deshidratado. Donde según su

fabricante o procesador le agrega azúcar y otros compuestos para resaltar alguna característica de su sabor.

Para crear el café instantáneo, se selecciona los granos más adecuados, se tuestan, muelen y se infusionan hasta producir un tanque gigante de café tostado y molido recién elaborado. Entonces extraemos las partículas del café, y el líquido restante se evapora mediante el método de secado por congelación o liofilización, que es superior, ya que produce un café de mejor calidad y gusto más suave.

Cafeína

La cafeína es uno de los principales alcaloides del café  cuya fórmula es C8H10O2N4 denominada 1, 3, 7, trimetil  Xantina, y participa en la característica del sabor amargo del café y se encuentra en mayor proporción en los café de Robustas.

Propiedades químicas de la cafeína

La cafeína por ser alcaloide del grupo de las xantinas, concretamente pertenece a la familia de las metilxantinas. Las bases xánticas o púricas son alcaloides derivados de la purina. Concretamente, provienen del anillo de la purina que se forma a través de la condensación de una pirimidina con un imidazol. Poseen una estructura cristalina y su fórmula molecular es C3H4N2. Es soluble en agua y es función directa de la temperatura. A 25 °C se disuelven 22 mg de cafeína en 1 ml de agua, mientras que a 80 °C se diluyen 180 mg/ml y a 100 °C lo hacen 670 mg/ml. Es muy soluble en agua hirviendo en la que cristaliza como monohidrato, ya que va perdiendo progresivamente la molécula de agua, hasta que lo hace totalmente a los 100 °C.

La cafeína puede formar combinaciones estables con sales alcalinas de ácidos débiles, como el benzoato y silicato de sodio, pero su reacción con ácidos da lugar a compuestos muy inestables. Se descompone fácilmente por la acción de álcalis calientes y por cloro. Causa una aglomeración de finos con las gotitas líquidas que convierten los finos en el polvo grueso.

La determinación de cafeína

Esta ha adquirido mucha importancia, debido a su uso en la industria farmacéutica y en la industria de alimentos; ya sea como ingrediente en la elaboración de refrescos y bebidas energéticas o por su presencia en productos como el té, el mate, el cacao y el café. En todos estos casos, el control de calidad del parámetro cafeína es necesario en los productos que la contienen. Por esta razón, se han desarrollado nuevos métodos instrumentales para su determinación en diversas matrices, especialmente en alimentos.

Para elegir una técnica de separación de la cafeína, además de tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad. Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos.

Método Cromatográfico

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se diseña, constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan.

Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). Esta técnica es muy usada en diversos análisis que se aplican al café, a continuación se enuncian dos de las practicas realizadas a nivel industrial más importantes.

La metodología de cromatografía para este análisis, es multiresiduo, determina 14 plaguicidas de manera simultánea, los cuales representan el mayor riesgo y la mayor importancia en el caso del café, ellos tienen un principio activo y generalmente son organofosforados, organoclorados y piretroides en café verde. En el procedimiento como tal se usan tres técnicas cromatográficas, las cuales son selectivas, precisas y exactas (Dallos Corredor & Guerrero Dallas, 2005). La elección de la técnica a usar depende del problema a resolver, el volumen de la muestra y su concentración.

La cromatografía se utiliza en la extracción con diversos fines, se usa entonces la Cromatografía de gases acoplada a un detector selectivo de masas, para la extracción y el análisis cualitativo de los volátiles del aceite de café.

Clasificación de los métodos cromatográficos

La cromatografía es un método de separación y análisis basado en el uso de una fase estacionaria y una móvil. Los componentes de una muestra se hacen pasar por una fase estacionaria mediante el flujo de una fase móvil de manera que las sustancias se distribuyen entre las dos fases; aquellos solutos cuya relación de distribución sea favorable a la fase estacionaria quedan retenidos por ésta, mientras que los solutos que se encuentran preferentemente en la fase móvil serán los primeros en arrastrar. De esta forma los solutos serán separados en orden creciente a sus coeficientes de distribución con respecto a la fase estacionaria. El conjunto de técnicas que se valen de una fase móvil que se desplaza a lo largo del sistema y una fase estacionaria que permanece fija reciben el nombre de cromatografía.

1. Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil:

Ø Cromatografía en columna: Consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en cuyo interior hallamos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o aplicación de presión.

 Ø Cromatografía plana: la fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad.

 

2. Según los estados de las fases implicadas, en especial de la fase móvil:

 Ø Cromatografía de gases: En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separación.

 Ø  Cromatografía de líquidos: La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido),o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido). La cromatografía de líquidos (siempre la fase móvil es un líquido) puede realizarse con diferentes arreglos experimentales:

Ø Cromatografía en columna, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido - líquido; en la cromatografía en capa fina, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme.

Ø Cromatografía de fluidos supercríticos(cualquier sustancia que se halle en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico).

La cromatografía líquida

Ø Cromatografía de reparto o partición: se vale de una fase estacionaria líquida que forma una película sobre un soporte sólido. La distribución del soluto vienen dada por el equilibrio entre la fase estacionaria y móvil. Se utiliza para especies poco polares pero no iónicas de masa molecular menor de 104 g/mol.

 Ø Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido: el soluto presente en una fase móvil líquida o gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de la fase estacionaria. La separación de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y móvil. Se utiliza para especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular menor de 104 g/mol.

Ø Cromatografía de intercambio iónico: Consiste en hacer pasar una fase móvil líquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos iónicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedarán retenidos por fuerzas electrostáticas. Se utiliza para especies iónicas de masa molecular menor de 104 g/mol.

 Ø Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en gel: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas. Se utiliza para solutos con masa molecular mayor de 104 g/mol.

Ø Cromatografía de afinidad: Emplea interacciones específicas entre una clase de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente a la fase estacionaria. 

CONCENTRACIÓN

Desde el punto de vista del proceso industrial, el café soluble se obtiene a partir del extracto de café. Para retirar el agua que hace parte del extracto  se requieren fundamentalmente de procesos industriales. Consiste en reducir el contenido de agua en el extracto de café, típicamente desde un 85% a 90% hasta un 55% a 60% de agua. Hay diversos sistemas para retirar agua, y los más utilizados en la industria son la evaporación, realizada al vacío para que el agua se evapore a unos 45°C. En este proceso se usan intercambiadores de calor especiales donde se busca conservar las propiedades del café, calentándolo el menor tiempo posible y en forma muy homogénea. (Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, 2010)

Como producir café soluble sin tener un concentrador?

Tal y como se observó en el artículo anterior, para realizar el proceso de concentración en la producción del café soluble, existen otras dos operaciones diferentes a la concentración que generalmente es realizada por evaporación. Las otras dos operaciones son la Crioconcentración y el uso de tecnología de membranas.

Tecnología de membranas

Esta tecnología está basada en la permeabilidad selectiva de uno o más componentes del sustrato líquido a través de una membrana y gracias a un gradiente de presión hidrostática. Entre estas tecnologías se encuentran: microfiltración (MF), ultrafiltración (UF), nanofiltración (NF), ósmosis inversa (OI) y electrodiálisis (ED). El uso de estas tecnologías en la industria alimentaria, además de mejorar notablemente índices de calidad y productividad, es una herramienta valiosa para los planes de producción más limpia. (Restrepo, M.)

Usando esta técnica, se elimina la mayor parte del contenido en sales del agua:

1. El agua fluye desde una columna con bajo contenido en sólidos disueltos a una columna con alto contenido en sólidos disueltos. 

2. La presión osmótica es la presión necesaria para impedir que el agua fluya a través de la membrana, con el objeto de obtener un equilibrio.

3. Aplicando una presión superior a la presión osmótica, el agua fluirá en sentido inverso; el agua fluye desde la columna con elevado contenido en sólidos disueltos hacia la columna con bajo contenido en sólidos disueltos. (Lenntech, 2015).

A continuación un ejemplo de determinación de Cafeína, algunos equipos y materiales importantes:

Determinación de cafeína en café normal y descafeinado (método cromatografia Hplc)

Equipos y Materiales

Cromatógrafo de fase liquida de alta resolución HPLC Agilent 1260 compuesto de bomba para gradiente con desgasificador en línea , bandejas para solventes, automuestreador ,horno de columnas , detector de arreglo de diodos , detector de flourescencia , software LC Openlab.

· Columna cromatográfíca para HPLC, zorbax, eclipse XDB C18 4.6X150mm, tamaño de partícula 5 m.· Balanza digital analítica con precisión de 0.0001 g.· Molino para café verde ROMER serie RAS.· Molino para café tostado.

· Equipo para purificación de agua.· Equipo para filtración de vacío.· Espátula· Vasos de precipitados de 50 y100 ml· Cilindro graduado de 250 y 500 ml· Embudos de filtración, vástago corto.· Balones volumétricos de 100 ml, y 1 L, clase, CFCA (certificado por lote), fondo plano, cuello ancho esmerilado  y tapa de vidrio.· Jeringas desechables de 5 o 10 ml.· Filtros millex de 0.45 micras tipo durapore.· Papel  filtro de 150 mm· Pipetas volumétricas de 0.5 ,1, 2, 5, 10, 20,  y 50 ml· Viales de virio con zona de escritura de 2 ml.· Reactivos.· Metanol  99.8 % grado HPLC· Cafeína patrón primario para HPLC.· Oxido de magnesio Grado analítico.· Estándar cafeína pura, anhídrida.· Agua, grado Milli –Q.· Membranas de filtración de 0.45 micras.  Variables de Control

 · Tiempo de retención.· Café normal  y descafeinado (HPLC  Agilent 1100)· Cafeína: minutos 10+/- 2· Presión máxima en bombasHPLC Agilent 1100  400 barHPLC Agilent 1260   600 bar · Temperatura del horno: 25°C· Tiempo de corrida 13 min· Flujo : 1.0 ml /min· Volumen de inyección 10ul· Longitud de onda : 273+/- 2nm· Fase móvil H2O: Metanol , A:B 80:20· Peso de la muestra  1 +- 0.1 g .

 Preparación de las curvas

-Prepare 5 puntos para cada curva de calibración.El rango de concentraciones recomendado para café normal es de 25 mg/L a 500 mg /L .-Trasfiera de la solución stock para café normal: 5 mL , 10 mL y 50 mL en balones aforados de 100 mL.-Enrasar a volumen con agua grado Milli-Q.· Las concentraciones finales de las soluciones son de 25 mg/L , 50 mg/L , 100 mg/L , 250mg/L y 500 mg/L .El rango de concentraciones recomendado para café descafeinado es de 5 a 100 mg/L para cafeína.· Trasfiera de la solución stock para café normal: 5 mL , 10 mL 20 ml y 50 mL en balones aforados de 100mL.· Enrasar a volumen con agua grado Milli-Q.· Las concentraciones finales de las soluciones son de 5 mg/L , 10 mg/L , 20 mg/L , 50 mg/L y 100 mg/L. 

Preparación de la muestra

Para café verde

-Pese 1 g +- 0,1 de café verde molido en un beaker o erlenmeyer de vidrio de 250 ml, y adicione 5g de Oxido de magnesio, complete con agua ultrapura hasta 100g .Tenga en cuenta el peso total (p1)-Caliente aproximadamente a 90 °C durante 5 min agitando periódicamente.-deje enfriar y adicione agua ultrapura hasta recuperar el peso total inicial (P1) y filtre la solución con papel filtro.-Filtre a través de una membrana de 0,45 micras o filtro millez en un vial y coloque lo en el inyector automático. 

Para café tostado

-Muela la muestra de café tostado.-Pese 1 g +- 0,1 de café tostado y molido en un beaker o erlenmeyer de vidrio de 250 ml, y adicione 5g de Oxido de magnesio, complete con agua ultrapura hasta 100g .Tenga en cuenta el peso total (p1)-Caliente aproximadamente a 90 °C durante 5 min agitando periodicamente.-Deje enfriar y adicione agua ultrapura hasta recuperar el peso total inicial (P1) y filtre la solución con papel filtro.-Filtre a través de una membrana de 0,45 micras o filtro millez en un vial y coloque lo en el inyector automático. 

Para extractos de café

· Pese en un balón aforado 100 ml , 1g de extracto concentrado , 0 3 gramos de extracto diluido .· Adicione 15 ml de agua ultrapura caliente (90 °C ). Agite y deje enfriar hasta temperatura ambiente y complete el volumen a 100 ml con agua ultrapura .· Filtre a través de una membrana de 0,45 micras o filtro millez en un vial y coloque lo en el inyector automático.Para café soluble .· Pese 1g +- 0,1 g de café soluble en balón aforado 250 ml .· Adicione 50 ml de agua ultrapura caliente (90 °C ). Agite y deje enfriar hasta temperatura ambiente y complete el volumen con agua ultrapura .· Filtre a través de una membrana de 0,45 micras o filtro millez en un vial y coloque lo en el inyector automático.

Expresión de los resultados

-Cromatografía de la separación por la técnica HPLC de cafeína.-A partir  de la construcción de las curvas de calibración en los intervalos de concentraciones preparadas, aplique el método de los mínimos cuadrados a los resultados obtenidos y obtenga los valores de la pendiente y de los interceptos.-Utilice las ecuaciones de las rectas para calcular la concentración de cafeína expresadas en mg/L .-el contenido de cafeína en la muestra se expresa como porcentaje en peso (g/100g ) empleo la siguiente ecuación .Wx =Pc V 100= Pc 0,011000 ms msDondePc es la concentración de cafeína obtenida de las curvas de calibración, expresada en mg/L.ms es el peso de la muestra en gramos .V es el volumen del extracto de la muestra, expresado en L como esta (v=0,1 L ).-Tome como resultado la media aritmética de dos determinaciones independientes de la muestra.-Los coeficientes de evaluación de los resultados en base seca de las dos réplicas de cada muestra de café no deben superar el criterio establecido por las buenas prácticas de laboratorio estándar (GPL), que dicho coeficiente debe ser menor o igual a 5%.

CONCLUSIONES

La cafeína es el estimulante leve psicoactivo más consumido en el mundo y se encuentra en bebidas no alcohólicas como el café, Aunque más débil que otros estimulantes, la cafeína puede producir síntomas de intoxicación, tolerancia y abstinencia causados por esta sustancia en algunos individuos.

La determinación de cafeína ha adquirido mucha importancia, debido a su uso en la industria farmacéutica y en la industria de alimentos; ya sea como ingrediente en la elaboración de refrescos y bebidas energéticas o por su presencia en productos como el té, el mate, el cacao y el café. En todos estos casos, el control de calidad del parámetro cafeína es necesario en los productos que la contienen. Por esta razón, se han desarrollado nuevos métodos instrumentales para su determinación en diversas matrices, especialmente en alimentos.

La metodología analítica empleada para cuantificar la cafeína, consiste pues en separar por sistemas tradicionales de extracción líquido-líquido el principio activo y valorarla después por técnicas cromatográficas y espectrofotométricas, teniendo en cuenta la exactitud y precisión de los métodos empleados.

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se diseña, constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan. La determinación de la cafeína se suele llevar a cabo mediante técnicas de separación como HPLC (Cromatografía líquida de alta eficiencia), CE (Electroforesis capilar), TLC (Cromatografía de capa fina) o GC (Cromatografía de gases). Estos métodos realizan la detección mediante técnicas electroquímicas (potencio métricas, conductimétricas, amperométricas, etc.), ópticas (espectrofotométricas, fluorimétricas, etc.) y otras (termoquímicas). La elección de una u otra técnica depende del problema a resolver, del volumen de muestra y de su concentración.

REFERENCIAS

Federación Nacional de Cafeteros de Colombia. Colombia y la industria internacional del café soluble. Recuperado de: http://www.federaciondecafeteros.org/static/files/Gerencia%20Comercial%20-%20Colombia%20y%20la%20industria%20internacional%20del%20cafe%20soluble.pdf

Federación Nacional de Cafeteros de Colombia. (2010). Producción de Café Soluble. Recuperado de: http://www.cafedecolombia.com/particulares/es/sobre_el_cafe/el_cafe/industrializacion/produccion_de_cafe_soluble/

Restrepo, M. (s.f.). Producción más Limpia en la Industria Alimentaria. Recuperado de: http://www.lasallista.edu.co/fxcul/media/pdf/RevistaLimpia/Vol1n1/PL_V1_N1_87_PL_INDUSTRIA_ALIMENTARIA.pdf

International Standard -ISO 10095 -1992- coffee - determination of caffeine content method using high performance liquid chromatography.

NTC 456, café y productos de Cafe , determinación de cafeína usando cromatografía HPLC

Calle Aznar, S. (12 de Junio de 2011). Determinación analítica de la cafeína en diferentes productos comerciales. Obtenido de Universidad Politécnica de Catalunya: http://upcommons.upc.edu/pfc/bitstream/2099.1/11148/2/Mem%C3%B2ria.pdf

Dallos Corredor, D., & Guerrero Dallas, J. A. (2005). Desarrollo y validación de una metodología para la determinación de plaguicidas en café verde por cromatografía de gases. Revista Colombiana de Química, 175-188.

López Fontal, E. M. (Enero de 2007). Extracción de aceite de café. Obtenido de Ingeniería e Investigación. Universidad Nacional de Colombia: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=s0120-56092007000100004&script=sci_arttext