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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR
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Proyecto HERPEMOL Caracterización de la situación sanitaria del litoral español relativa a la infección por virus herpes en moluscos bivalvos y evaluación del impacto de la enfermedad. JACUMAR PN 2011-2013
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Índice
1. Introducción 3
2. Objetivos 6
2.1. Objetivo general 6
2.2. Objetivos específicos 6
3. Generalidades de las técnicas 7
3.1. Técnica histológica 7
3.2. Técnica molecular 7
4. Equipos e instrumentos 10
5. Materiales y reactivos 11
6. Material proporcionado por el CIMA 12
7. Preparación de las muestras 13
7.1. Análisis Histológico 12
7.2. Análisis Molecular 15
7.2.1. Condiciones previas de trabajo 15
7.2.2. Extracción de ADN de muestras. 15
7.2.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y ensayo de restricción (RFLPs) empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos comunes para todos los laboratorios participantes.
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7.2.4. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos habituales de cada laboratorio participante.
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7.2.5. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos comunes para todos los laboratorios participantes.
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7.2.6. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos habituales de cada laboratorio participante.
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8. Análisis de resultados. 21
8.1. Interpretación histológica. 21
8.2. Interpretación molecular. 21
8.2.1. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6. 21
8.2.2. PCR empleando los cebadores HerpF -HerpR 21
9. Hoja de Resultados 22
10. Bibliografía citada 23
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1. Introducción
En las últimas décadas, según datos de la Organización Mundial de Sanidad
Animal (OIE), la producción mundial de moluscos se ha visto seriamente afectada por
numerosas enfermedades,. Debido al severo impacto que producen en el desarrollo
socioeconómico en muchos países, algunas de estas enfermedades se han convertido
en una seria restricción primaria para el desarrollo y sostenibilidad del cultivo de
moluscos. Actualmente, se considera que la principal causa asociada a los brotes de
enfermedades y epizootias es la transferencia de agentes infecciosos a través del
transporte de moluscos vivos. La dinámica de libre comercio y el legítimo deseo de los
países de buscar nuevas alternativas para la producción de alimento y de desarrollo
socioeconómico, hacen que se pasen por alto factores sanitarios esenciales que, de
no considerarse en su justo contexto, pueden hacer fracasar los cultivos de moluscos
(Cáceres-Martínez y Vásquez-Yeomans, 2008).
Las infecciones de origen vírico en moluscos se empezaron a estudiar a partir de
los años 60 del siglo pasado, aunque su interés se ha incrementado notablemente con
el desarrollo de la acuicultura. El primer caso de infección por un virus tipo-herpes en
moluscos bivalvos fue registrado por Farley y col. (1972) en Crassostrea virginica. Desde
entonces se han notificado numerosos casos de infecciones por virus,
presumiblemente pertenecientes a la familia Herpesviridae, en diferentes especies de
bivalvos en todo el mundo; entre ellas podemos citar Crassostrea gigas (Hine et al.,
1992), C. angulata (Arzul et al., 2001a), C. rivularis (Arzul et al., 2001a), Ostrea edulis
(Nicolas et al., 1992), O. angasi (Hine y Thorne 1997), Tiostrea chilensis (Hine et al., 1998),
Ruditapes decussatus (Renault and Arzul, 2001), R. philippinarum (Renault, et al 2001a),
y Pecten maximus (Arzul et al., 2001b). También cabe destacar el reciente registro de
mortalidades masivas de semilla de ostra plana O. edulis asociadas a infecciones por
virus herpes en Galicia (Villalba y col. 2010). La mayoría de estas notificaciones están
relacionadas con mortandades elevadas de larvas y juveniles, siendo la población
adulta aparentemente menos sensible a la infección (Arzul et al., 2002; Renault y
Novoa, 2004).
El desarrollo de un método para purificar partículas virales tipo-herpes a partir
de tejido fresco de larvas de C. gigas infectadas, facilitó la extracción del ADN viral y
la caracterización parcial de su genoma (Le Deuff and Renault, 1999). La posterior
secuenciación completa del genoma (GenBank Nº AY509253) reveló una baja
relación con otros herpesvirus. El virus aislado a partir de larvas de C. gigas infectadas
se clasificó formalmente como un miembro de los Herpesviridae, y se bautizó con el
nombre de “Ostreid Herpesvirus 1” (OsHV-1) (Minson et al. 2000). A lo largo de los años
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2008 y 2009 se observaron en Francia mortalidades anómalas que han ido en aumento
y parecen afectar a casi todo el litoral. Estas mortalidades también se detectaron en el
verano del 2008 y 2009 en Irlanda y en el verano del 2009 en las Islas Anglonormandas.
Dado que las mortalidades parecían asociadas a los movimientos comerciales de los
ostiones C. gigas procedentes de Francia, las autoridades competentes de estos
Estados miembro y de las Islas Anglonormandas adoptaron medidas de confinamiento,
evitando los desplazamientos de los ostiones a partir de las zonas afectadas, con el fin
de controlar la situación generada por la enfermedad. Estas mortalidades parecen
estar relacionadas con la presencia de un nuevo genotipo recombinante de virus
herpes, denominado OsHV-1 µvar. Asociado a estas mortalidades también se han
descrito varias especies de vibrios y múltiples factores ambientales. Actualmente, el
virus herpes de los ostreidos tipo 1 µvar, recibe la consideración de enfermedad
emergente por la OIE. En Marzo de 2010, la Comisión Europea aprobó el Reglamento
175/2010 “por el que se aplica la Directiva 2006/88/CE del Consejo en lo referente a las
medidas de lucha contra el aumento de la mortalidad de los ostiones de la especie
Crassostrea gigas en relación con la detección del herpesvirus de los ostreidos tipo 1
µvar (OsHV-1 µvar)”. Dicha Normativa dejo de estar vigente en Abril de 2011.
El diagnóstico de la infección por virus herpes se ha realizado tradicionalmente
mediante microscopía óptica, como una primera aproximación, seguido de un estudio
de microscopía electrónica de transmisión para completar el diagnóstico (Hine and
Thorne 1997). Estos métodos presentan varias limitaciones, ya que requieren un
elevado tiempo de dedicación, no son válidos para realizar estudios epidemiológicos y
tienen una baja sensibilidad. Debido a estas limitaciones, se desarrollaron otros
métodos basados en técnicas inmunohistoquímicas y genómicas. Actualmente los más
empleados son los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) que permite la detección del ADN viral (Renault et al. 2000a; Renault y Arzul
2001a; Batista y col. 2005). La PCR se considera una herramienta adecuada para el
diagnóstico de las infecciones por OsHV-1, debido a su especificidad, alta sensibilidad
en comparación con otros métodos, fácil procesado de las muestras, disponibilidad de
reactivos, eficiencia del tiempo empleado y coste. Sin embargo, dado que la PCR sólo
detecta ácidos nucleicos virales como técnica confirmatoria se debe emplear la
histología, la hibridación in situ o tests de reconocimiento antigénico, especialmente
ante nuevos registros geográficos u hospedador. En aquellas regiones endémicas, el
diagnóstico por PCR se considera suficiente para diagnosticar la presencia de OsHV-1
(Batista et al. 2007).
La pérdida de estandarización en los protocolos a desarrollar así como en su
interpretación es uno de los principales impedimentos para la implantación de
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métodos de diagnóstico efectivos, siendo la reproducibilidad entre los laboratorios un
factor crítico. El procedimiento a ensayar no solo se basa en realizar una prueba
diagnóstica, sino también en reproducir la misma sensibilidad, discernir falsas
interpretaciones y mejorar los procedimientos para controlar la posible contaminación.
Esta pérdida de reproducibilidad es más pronunciada con las técnicas moleculares
debido a la sensibilidad de los reactivos, la complejidad de los equipos y la necesidad
de personal bien formado. Por ello, la validación basada sobre un criterio
consensuado es un prerrequisito para la adopción con éxito de la metodología
diagnóstica. Para realizar una correcta intercalibración de la metodología es
necesario replicar varios grupos de ensayo, tanto para el manejo de las herramientas
moleculares como para el diagnóstico histológico.
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2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general:
El objetivo de esta línea de trabajo se centra en unificar los criterios
diagnósticos y validar, entre los grupos de investigación implicados, las pruebas
diagnósticas (histología y PCR), con el fin de que los resultados de evaluación de la
situación sanitaria (línea de trabajo 3) sean armoniosos y coherentes a nivel nacional.
2.2. Objetivos específicos:
(1) Establecer los criterios comunes para el diagnóstico histológico.
(2) Establecer procedimientos debidamente pormenorizados para una extracción
correcta del ADN, mediante los kits comerciales actualmente disponibles en el
mercado.
(3) Establecer el procedimiento de PCR mediante la descripción de los protocolos
utilizados para el diagnóstico del OsHV-1 y su variante OsHV-1 µvar.
(4) Establecer el procedimiento de RFLPs para el diagnóstico del OsHV-1 y su variante
OsHV-1 µvar.
(5) Validar la sensibilidad y reproducibilidad de los resultados de PCR-RFLPs empleando
los reactivos que se usan habitualmente en cada uno de los laboratorios
participantes.
(6) Validar la sensibilidad y reproducibilidad de los resultados de PCR empleando una
nueva pareja de cebadores (HerpF/R) diseñados durante el desarrollo del
proyecto.
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3. GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS
3.1 Técnica Histológica.
Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados
para poder estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. El
proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. Las
muestras son habitualmente fijadas con unas soluciones líquidas (fijadores), que
mantienen durante el procesado posterior del tejido las estructuras celulares y
moleculares en sus posiciones iniciales.
Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente
obtener secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más
tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con
sustancias líquidas que posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán
consistentes (ceras). Los medios de inclusión son normalmente no hidrosolubles como
la parafina, por lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes
orgánicos liposolubles y posteriormente añadir el medio de inclusión.
Tras la inclusión se procede a cortar los tejidos. Existen diferentes aparatos de
corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanómetros),
semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesos (mayores a 10 µm).
Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas. Normalmente las
secciones se tiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el
medio de inclusión para que los colorantes pueden unirse al tejido. Los tejidos
procesados se observan con los microscopios.
3.2. Técnica Molecular
La técnica de la Reacción en cadena de la Polimerasa, consiste básicamente
en la amplificación de un segmento específico del genoma del virus. Este segmento
específico, como se menciona, debe ser seleccionado como único y característico
para cada tipo de microorganismo que se quiera diagnosticar, de esta manera,
estaremos trabajando con una técnica que contará con una alta sensibilidad y
especificidad para el diagnóstico de una enfermedad.
Una vez identificada esta región o segmento a amplificar, se deben diseñar los
partidores o en inglés primers, que establecerán el marco de acción de esta
amplificación, el desarrollo de este diseño es importantísimo y fundamental para la
obtención de un resultado apropiado.
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El resto de los reactivos que requiere la reacción, consisten básicamente en un
buffer o solución tamponada, presencia de sales de Magnesio, dinucleótidos de los 4
tipos: Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) y Timina (T), agua y la enzima Polimerasa.
La reacción en sí, consiste en tres etapas, desnaturalización de la hebra,
anillamiento con los partidores e hibridización, estas tres etapas ocurren en varios ciclos
(usualmente entre 30 y 40) en tres distintas temperaturas, para este efecto se emplean
equipos que se denominan termocicladores.
Una vez finalizada la reacción, se debe visualizar o detectar si se amplificó el
segmento deseado, esto, en el caso que se trate de PCR convencional, el producto
de la reacción de PCR es sacado del termociclador, cargado en un gel de agarosa,
corrido en una cámara de electroforesis y visualizado en un transiluminador
ultravioleta.
En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los fragmentos
de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a
secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por
las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que
varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones
de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN. Lo que permite diferenciar
entre diferentes individuos de una población, entre cepas o variantes de la misma
especie o entre diferentes especies.
Se debe tener bastante precaución cuando se trabaja con material genético,
con el fin de evitar la presencia de inhibidores de ARN o ADN, principalmente enzimas
que destruyen ácidos nucleicos, es por esta razón que se trabajan con materiales libres
Desnaturalización 95°C
Anillamiento 50-60ºC
Extensión 75ºC
Primer Ciclo
2do Ciclo
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de ARN-ADNasas. Se deben cambiar de guantes con frecuencia y se deben tener
algunos equipos de uso exclusivo para cada etapa, es decir, para la extracción,
amplificación y etapa de post-amplificación (en el caso de la PCR convencional).
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4. EQUIPOS E INSTRUMENTOS
- Uso general
� Cámara de Flujo Laminar Clase II, con luz germicida UV.
� Nevera (2ºC - 6ºC).
� dos juegos completos de pipetas (2 µl, 20 µl, 200 µl y 1 000 µl); el primero para la extracción del ADN y el segundo para la preparación de la mezcla de RCP.
- Extracción de ADN
� Microcentrifuga.
� Vortexer.
� Baño de agua o placa caliente a 56ºC.
� Espectrofotómetro ADN/ARN o nanodrop.
- PCR
� Termociclador
- Electroforesis de agarosa
� Horno microondas o incubador-agitador
� balanza
� un sistema de electroforesis horizontal
� un dispositivo de UV para la lectura de los geles de agarosa
� un sistema de documentación de imágenes
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5. MATERIALES Y REACTIVOS
- Uso general
� Puntas de micropipeta con filtro de diversos calibres.
� Guantes sin talco, ADN/ARNasa Free.
� Tubos eppendorf de 1,5 ml y de 0,5 ml ADN/ARNasa free.
- Extracción de ADN
� Kit de extracción de ADN: QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN).
� Etanol (96-100%), grado Biología Molecular.
� PBS (Phosphate-buffered saline).
- PCR de calibración
� Agua destilada estéril RNAase free, grado Biología Molecular.
� Cebadores (10µm)
� Dideoxinucleótidos dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM) (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec)
� Taq ADN polimerasa (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec).
� Tampón 10 X (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec).
� MgCl 2 (suministrado con Gold Star Mix, Eurogentec) (25 mM)
- Electroforesis de agarosa
� 50 X TAE (puede comprarse listo para usar):
Tris base (40 mM): 242 g
Ácido acético glacial (40 mM): 57,1 ml
Na2EDTA.2H2O (1 mM): 18,61 g
dH2O para 1 litro
Ajustar al pH 8
� Agarosa
� Bromuro de etidio (0,5 µg/ml)
� Colorante azul para carga:
Azul de bromofenol 0,25 %
Xileno cianol FF 0,25 %
Sacarosa 40 %
Mantener a 4 °C.
� Marcador de peso molecular: bandas a intervalos regulares de 100 a 1000 pb.
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6. MATERIAL PROPORCIONADO POR EL CIMA.
� Preparaciones histológicas. Etiquetadas del 1 al 60.
� Tejido en etanol al 96%. Etiquetados del 1 al 60.
� Alícuota de primers HerpF/R (10 micromolar).
� Plásmido control positivo con el fragmento C2-C6 de OsHV-1 µvar.
� Plásmido control positivo con el fragmento HerpF/R de OsHV-1 µvar.
� Plásmido control positivo con el fragmento HerpF/R de OsHV-1.
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7. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El Laboratorio de Patología del Centro de Investigacións Mariñas (CIMA) ha sido
el centro receptor de las ostras (Crassostrea gigas) control e infectadas por virus herpes
que se van a emplear en la prueba de intercalibración. También es el laboratorio
encargado de realizar las preparaciones histológicas que se van a distribuir en la
prueba, así como de conservar tejido de ostra para el análisis molecular. Con esta
finalidad, la vianda de cada ostra se separó de la concha, y se dividió en dos
fragmentos, uno para diagnóstico molecular y otro para histología. De esta forma, de
cada preparación histológica disponemos de su réplica en el análisis molecular. A su
vez, el fragmento de vianda destinada a la extracción de ADN, se dividió en tres
porciones y cada una de ellas se conservó en tubos individuales con etanol 99%.
7.1. Análisis Histológico.
A continuación se detalla el protocolo de preparación de las muestras
histológicas realizado en el laboratorio de Patología del Centro de Investigacións
Mariñas (CIMA).
- Fijación.
Separar un fragmento de vianda, éste se coloca en una cajita perforada
(cassette), convenientemente rotulada. El cassette con el fragmento de vianda se
introduce en disolución de Davidson (disolución de fijación) durante 24h a 4ºC.
Transcurrido este periodo, se lava con agua bajo el grifo durante unos 10 min. En caso
de que se prefiera conservar el fragmento de vianda durante un tiempo indefinido
antes de la inclusión en parafina, el cassette con el fragmento se mantiene en etanol
de 70º.
Solución de Davidson (Shaw y Battle 1957)
Glicerina 400 mL
Formaldehído 40% 300 mL
Etanol de 96º 1200 mL
Agua de mar filtrada 1200 mL
Se puede preparar una solución con los compuestos señalados arriba y
mantenerla por tiempo indefinido. Justo antes de la utilización del fijador hay que
mezclar 1 parte de ácido acético glacial con 9 partes de la solución anterior.
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- Inclusión, formación de bloques de parafina y obtención de cortes histológicos.
Para la inclusión en parafina y posterior formación de bloques se procede
siguiendo los pasos de la tabla insertada a continuación, utilizando un procesador
automático LEICA TP 1020. Posteriormente, utilizando una consola Tissue Tek (Miles
Scientific), se forma un bloque de parafina con un molde metálico, del cual se
obtienen cortes de 5 µm de espesor con un micrótomo de rotación. Estos cortes
primero se depositan en un baño de flotación con agua a 40oC para que se estiren y a
continuación se recogen sobre un portaobjetos que se deja secar en estufa a 40º C
para su posterior tinción.
↓ Etanol de 80o 1h Etanol absoluto 1h
Etanol de 96o 2h Xileno y etanol absoluto (1:1) 1h
Etanol de 96o 1h Xileno 1h
Etanol de 96o 1h Xileno 1h
Etanol absoluto 2h Parafina y xileno (1:1) 3h a 65oC
Etanol absoluto 2h→ Parafina (con vacío) 3h a 65oC
- Tinción hematoxilina de Harris-eosina (adaptado de Howard et al. 2004) utilizando
teñidor automático LEICA AUTOSTAINER XL.
Desparafinar Xileno 5 min
Xileno 10 seg
Hidratar Etanol absoluto 6 seg
Etanol absoluto 6 seg
Etanol de 96o 6 seg
Etanol de 70o 6 seg
Etanol de 50o 6 seg
Agua destilada 2 min
Tinción Hematoxilina de Harris 8 min
Lavar Agua bajo el grifo 5 min
Diferenciar Etanol ácido (0,04% HCl en etanol de 70o) 3 min
Lavar Agua bajo el grifo 5 min
Azular
NaHCO3, una cucharada en 250 mL de agua destilada
30 seg
Etanol de 96o 3 min
Contratinción Eosina amarilla 15 seg
Diferenciar Etanol de 96o 6 seg
Etanol de 96o 6 seg
Deshidratar Etanol absoluto 6 seg
Etanol absoluto 6 seg
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Aclarar Xileno 6 seg
Xileno 15 min
Montar Histomount (Montador automático LEICA CV5030)
7.2. Análisis Molecular
7.2.1. Condiciones de trabajo previas.
Antes de comenzar con las extracciones, se deben colocar pipetas “limpias”,
gradillas, puntas, etc. en una cámara de bioseguridad que se haya limpiado
previamente. La exposición a la luz ultravioleta germicida, por varias horas o por toda
la noche puede ser beneficiosa para la degradación de ADN contaminante de las
pipetas y otros equipos.
El manipulador debe llevar bata de laboratorio y guantes durante todas las
fases que se describen a continuación. Preferiblemente, la bata y los guantes deben
cambiarse tras cada paso principal: Extracción de ADN, preparación de la mezcla de
PCR, distribución de las muestras, amplificación y transferencia al gel.
Se recomienda llevar a cabo estas fases en diferentes salas. En particular, la
amplificación y la transferencia al gel/la electroforesis deberían efectuarse en una sala
separada de la extracción del ADN, la preparación de la mezcla de PCR y la
distribución del ADN.
7.2.2. Extracción de ADN de muestras (método QIAamp® DNA Mini Kit, QIAGEN).
La extracción del ADN se efectuará utilizando el kit QIAamp® DNA Mini Kit
(QIAGEN) siguiendo las instrucciones del protocolo de ensayo con tejidos, en el
siguiente orden:
(1) Poner entre 10 y 50 mg de tejidos en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml, y
añadir 180 µl de tampón ATL.
(2) Añadir 20 µl de proteinasa K, mezclar con agitador vortex e incubar a 56 °C hasta
que el tejido quede completamente lisado (hasta el día siguiente). Agitar con
vortex ocasionalmente durante la incubación para dispersar la muestra.
Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las
gotas de la tapa.
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(3) Añadir 200 µl de tampón AL a la muestra, mezclar con agitador vortex con
sacudidas durante 15 s e incubar a 70 °C durante 10 minutos. Centrifugar
brevemente el tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para retirar las gotas de la
tapa.
(4) Añadir 200 µl de etanol (96-100 %) a la muestra y mezclar con agitador vortex con
sacudidas durante 15 s. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrifugación
de 1,5 ml para retirar las gotas de la tapa.
(5) Aplicar cuidadosamente la mezcla del paso 4 a la columna QIAamp (en un tubo
de recogida de 2 ml) sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10.000
rpm durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de
recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo que contiene
el filtrado.
(6) Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de
tampón AW1 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a 10.000 rpm
durante 1 min. Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de
recogida limpio de 2 ml (suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida
que contiene el filtrado.
(7) Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y añadir 500 µl de
tampón AW2 sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a toda velocidad
(14.000 rpm) durante 3 min.
(8) (Optativo) Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida
nuevo de 2 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que
contiene el filtrado. Centrifugar a toda velocidad (14.000 rpm) durante 1 min.
(9) Poner la columna de centrifugación QIAamp en un tubo de microcentrifugación
limpio de 1,5 ml (no suministrado en el kit) y desechar el tubo de recogida que
contiene el filtrado. Abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp y
añadir 100 µl de agua destilada. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y
centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min.
(10) Controlar la calidad y la eficacia de la extracción [por ejemplo, midiendo la DO
(260 nm) bajo el espectrofotómetro o tras la electroforesis en gel de agarosa].
(11) Preparar la dilución de las muestras para tener una concentración final de ADN
de 50-100 ng/µl.
(12) Las soluciones de ADN se guardan a 4 °C hasta que se efectúen los análisis por
PCR.
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7.2.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y ensayo de restricción (RFLPs)
empleando los cebadores C2-C6 y reactivos comunes para todos los laboratorios
participantes.
- Mezcla de reacción.
(1) Descongelar el vial, mezclar y dejar en hielo.
(2) A 25 µl de Gold Star Mix, añadir 0,01 nmoles de primers, 100 ng de ADN molde y
enrasar con H2O a un volumen final de 50 µl.
Tabla 1. Mezcla de reacción para la PCR.
Volumen por tubo
2X PCR MIx 25µl
MgCl2 (25 mM) 2µl
C2 (10 µM) 1 µl
C6 (10 µM) 1 µl
ADN -
dH2O Enrasar a 50µl
- Controles. Se emplearán dos tipos de controles:
(1) Controles negativos. Se añadirá a la mezcla de reacción (49 µl) 1 µl de dH2O.
Tienen por objeto detectar una posible contaminación reactiva del entorno de
trabajo. Debería incluirse un control negativo por cada diez muestras o después de
cada lote de muestras. ES L 52/8 Diario Oficial de la Unión Europea 3.3.2010.
(2) Controles positivos consistirán en ADN plasmídico que contiene la región objetivo
del genoma C2-C6 del OsHV-1. Su objetivo es comprobar la eficacia de la PCR.
Debe incluirse un control positivo por cada análisis por PCR.
- Amplificación. El protocolo de amplificación se detalla a continuación:
� Desnaturalización inicial: 2 min a 94 °C.
� 35 ciclos:
� desnaturalización 1 min a 94 °,
� amplificación 1 min a 58 °,
� elongación 1 min a 72 °C
� Elongación final: 5 min a 72 °C.
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- Electroforesis
(1) Pesar 1,5 g de agarosa, añadir 100 ml de 1X TAE y calentar hasta que se funda la
mezcla.
(2) Tras enfriar la solución, añadir bromuro de etidio (5 µl para 100 ml de gel de
agarosa) y poner la solución en un molde específico equipado con peines.
(3) Cuando el gel se polimeriza, se retiran los peines y el gel se dispone en un sistema
de electroforesis horizontal que contiene 1X TAE suficiente para cubrir el gel de
agarosa.
(4) Mezclar 10 µl de productos de PCR con 2 µl de colorante azul (6X) y disponer en las
ranuras.
(5) Reservar una ranura para el marcador de peso molecular (5 µl).
(6) Aplicar un voltaje de 5-10 V/cm entre 30 min y 1 hora hasta que el colorante azul
haya recorrido la distancia adecuada a través del gel.
(7) Observar el gel con luz UV y documentar.
- Ensayo de enzimas de restricción (RFLPs).
Para discriminar entre la infección por el herpesvirus OsHV-1 o su variante OsHV-
1 µvar, se realizará un ensayo de restricción con la enzima MfeI (NBE). Las reacciones
de restricción se realizarán en un volumen final de 50 µl conteniendo 1 µg de ADN, 5 µl
de tampón de la enzima y 1 U de la enzima de restricción MfeI. Las digestiones se
realizarán durante 1h a 37 ºC, seguido de una incubación de 10 min a 65 ºC para
inactivar la enzima. Para visualizar los patrones de restricción, 15 µl del ADN digerido se
mezclará con 1 µl de colorante azul para carga. Las condiciones de electroforesis
serán las indicadas en el apartado anterior.
7.2.4. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6 y los reactivos habituales de cada
laboratorio participante.
Los apartados relativos a controles, amplificación y electroforesis se
corresponden con lo descrito previamente en el apartado 7.2.3. El apartado de
mezcla de reacción queda sujeto a las condiciones de los reactivos que cada
laboratorio use de forma rutinaria. La enzima Taq polimerasa que se use definirá las
condiciones de concentración apropiadas para los dNTPs y los cebadores Sería
necesario tener en cuenta la concentración incrementada de MgCl2. Indicar lo mismo
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en el uso de la restrictasa en los RFLPs. Señalar que en la PCR cantidad de ADN molde
es 100 ng y en los RFLPs la cantidad de ADN molde es 1 µµµµg.
7.2.5. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos comunes para todos
los laboratorios participantes.
Los primers HerpF y HerpR se han diseñado con el objetivo de disponer de unos
primers de secuencia conocida que permitan la identificación inequívoca del virus
herpes OsHV-1 y a variante OsHV-1 µvar, evitando análisis complementarios como
RFLPs o secuenciación. La secuencia de estos primers es la siguiente:
HerpF: 5’- CCC CGG GGA AAA AGT ATA AA- 3’
HerpR: 5’- GTG ATG GCT TTG GTC AAG GT -3’
- Los apartados relativos a mezcla de reacción, control negativo y electroforesis se
corresponden con lo descrito previamente en el apartado 7.2.3.
- Como control positivo se empleará ADN plasmídico que contiene la región objetivo
del genoma HerpF y HerpR del OsHV-1. Su objetivo es comprobar la eficacia de la
PCR. Debe incluirse un control positivo por cada análisis por PCR.
- El protocolo de amplificación se detalla a continuación:
� Desnaturalización inicial: 2 min a 94 °C.
� 35 ciclos:
- desnaturalización 1 min a 94 °C,
- amplificación 1 min a 52 °C,
- elongación 1 min a 72 °C
� Elongación final: 5 min a 72 °C.
- Electroforesis. Se seguirá el protocolo descrito en el apartado 7.2.3, pero con la
siguiente modificación en el paso (1) del protocolo descrito.
(1) Pesar 3 g de agarosa, añadir 100 ml de 1X TAE y calentar hasta que se funda
la mezcla. Los geles se realizarán al 3%.
7.2.6. PCR empleando los cebadores HerpF-HerpR y los reactivos habituales de cada
laboratorio participante.
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Los apartados relativos a controles, amplificación y electroforesis se corresponden con
lo descrito previamente en el apartado 7.2.3. El apartado de mezcla de reacción
queda sujeto a lo descrito en el apartado 7.2.4. El empleo del control positivo, el
protocolo de amplificación y las condiciones de electroforesis se describen en el
apartado 7.2.5.
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8. ANÁLISIS DE RESULTADOS.
8.1. Interpretación histológica.
De acuerdo con Renault et al. (2000), el cambio histológico más destacado en
semilla de ostras (Crassostrea gigas y Ostrea edulis) como consecuencia de la
infección por OsHV-1es la presencia de núcleos anormales en el tejido conjuntivo,
principalmente en el manto, los palpos labiales y la glándula digestiva. La anormalidad
de los núcleos consiste en que hay células de tipo fibroblasto con núcleos de tamaño
mayor que el normal y en ellos la cromatina está depositada en la periferia; además,
en células ovoides que probablemente son hemocitos el núcleo está muy
condensado. La infección no está asociada con una reacción inflamatoria masiva y
no es frecuente detectar necrosis en las áreas con núcleos anormales.
Por tanto, debemos considerar como signo de la infección la presencia en el
tejido conjuntivo de núcleos grandes con cromatina formando un anillo (Fig. 1, en op.
cit.). Los núcleos muy condensados son menos orientativos, pues se trata de un signo
de apoptosis.
8.2. Interpretación molecular.
8.2.1. PCR-RFLPs empleando los cebadores C2-C6.
� PCR: En aquellos geles de agarosa al 1,5 % con resultado negativo de todos
los controles negativos y resultado positivo de todos los controles positivos,
la presencia de una banda de aproximadamente 700 pb es indicativo de
infección por OsHV-1 (710 pb) o OsHV-1 µµµµvar (696 pb).
� RFLPs: Tras el ensayo de restricción, la presencia en los geles de agarosa al
1,5 % de una banda de 710 pb es indicativo de infección por OsHv-1. La
presencia de dos bandas, una de 192 pb y otra de 504 pb es indicativo de
infección por OsHV-1 µµµµvar.
8.2.2. PCR empleando los cebadores HerpF y HerpR.
� PCR: En aquellos geles de agarosa al 3 % con resultado negativo de todos
los controles negativos y resultado positivo de todos los controles positivos,
la presencia de una banda de 173 pb es indicativo de infección por OsHV-1
y una banda de 157 pb es indicativo de infección por OsHV-1 µµµµvar.
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9. HOJA DE RESULTADOS
En cada una de las hojas de resultados se debe identificar el laboratorio que ha
realizado el ensayo de intercalibración, cubriendo para ello el apartado
“LABORATORIO”. Una vez finalizados los análisis, las tablas correctamente cubiertas con
los resultados se enviarán via e-mail a CETMAR.
Los resultados obtenidos en la prueba de intercalibración quedarán reflejados en
las tablas que se anexan, cubriéndolas de la forma que se indica en las siguientes
instrucciones:
RESULTADOS HISTOLÓGICOS
� Las preparaciones histológicas en las que se observen signos de infección por
herpesvirus se indicará en la tabla correspondiente con el signo + en la
columna “resultado”.
� La ausencia de signos de infección se indicará con el signo -.
� Cualquier otra particularidad digna de ser reseñada se indicará en la
columna de observaciones.
RESULTADOS MOLECULARES
� Los casos positivos de amplificación por PCR se indicará con el signo + en la
columna “PCR”.
� Los casos de amplificación negativos por PCR se indicarán con el signo - en
la columna “PCR”.
� La identificación positiva por RFLPs del virus herpes OsHV-1 o la variante OsHV-
1 µvar se indicará con el signo + en la columna de “RFLPs” que corresponda.
� La identificación negativa por RFLPs del virus herpes OsHV-1 o la variante
OsHV-1 µvar se indicará con el signo - en la columna de “RFLPs” que
corresponda.
� En la columna de observaciones se indicará aquellas muestras que siendo
positivas por PCR no pudieron ser analizadas por RFLPs, debido a la baja
concentración de ADN en el producto de PCR, señalándolo como “No
analizables”. Cualquier otra particularidad digna de ser reseñada se indicará
en la columna de observaciones.
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10. BIBLIOGRAFIA CITADA
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