CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE … · 2019-02-23 · Listado de tablas Tabla 1....

CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Peperomia

subspathulata (PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD COMO AGENTE

ANTIMICROBIANO

LUZ MERY FAJARDO RAMOS

27.436.162

[email protected]

RUBEN FERNANDO NAVARRO CARRASCAL

1.091.663.248

[email protected]

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A)

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

BOGOTÁ D.C.

2017

CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Peperomia

subspathulata (PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD COMO AGENTE

ANTIMICROBIANO

LUZ MERY FAJARDO RAMOS

27.436.162

[email protected]

RUBEN FERNANDO NAVARRO CARRASCAL

1.091.663.248

[email protected]

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

Director de tesis

Oca. MSc. DORIS GUTIERREZ HERNANDEZ

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A)

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

BOGOTÁ D.C.

2017

Agradecimientos

Al finalizar un proceso de aprendizaje arduo y lleno de dificultades, como lo es el desarrollo de

la tesis de grado, es un verdadero placer para nosotros reconocer el acompañamiento, aportes y

participaciones de personas que nos facilitaron las cosas para que este trabajo llegue a un feliz

término.

Queremos agradecer a Dios, por guiarnos, fortalecernos espiritualmente y por poner a todas las

personas e instituciones como apoyo en nuestra formación. Debemos agradecer de manera

especial y sincera el apoyo, aporte y acompañamiento a nuestro tutor de proyecto Doris

Gutiérrez, quien con su conocimiento y su guía fue una pieza clave para que pudiéramos gestar

cada etapa de este trabajo, Pero también en nuestra formación como investigadores, con las ideas

propias, siempre enmarcadas en su orientación y rigurosidad.

Muchas gracias a los profesores Wilman Delgado por su colaboración en la parte práctica de la

extracción y caracterización del AE, Andrea Naranjo en la actividad antimicrobiana y Rubén

Torrenegra por apoyarnos con su aporte para la realización del proyecto.

Un agradecimiento, sincero, especial y afectuoso a nuestra familia por sus consejos y apoyo

incondicional y permanente, convirtiéndose en el motor de arranque y nuestra constante

motivación, muchas gracias por su paciencia y comprensión, y sobre todo por su amor.

No cabe duda de que su participación ha enriquecido el trabajo realizado y además ha significado

el surgimiento de un sólido compañerismo. A todos les agradecemos y les dedicamos nuestra

tesis.

TABLA DE CONTENIDO

Contenido

Listado de tablas ..................................................................................................................................... 6

Listado de Graficas ................................................................................................................................. 7

Lista De Abreviaturas ............................................................................................................................. 8

Resumen ................................................................................................................................................. 10

1. Introducción .................................................................................................................................. 11

2. Objetivos ........................................................................................................................................ 13

2.1. Objetivo general ........................................................................................................................ 13

2.2. Objetivos específicos ................................................................................................................. 13

3. Estado del arte .................................................................................................................................... 14

3.1. Generalidades de la familia Piperaceae .......................................................................................... 14

3.2. Generalidades del género Peperomia ....................................................................................... 14

3.3. Estudios fitoquímicos de especies del género Peperomia .............................................................. 17

3.4. Estudios de actividad biológica de especies del género Peperomia ....................................... 18

3.5. Peperomia subspathulata Yunck..................................................................................................... 20

3.6. Métodos de obtención y análisis de los compuestos aislados en aceites esenciales .............. 22

3.5.1. Obtención de AEs por destilación de arrastre con vapor ................................................................. 23

3.5.2. Método de análisis e identificación de los componentes de los AEs ............................................... 24

3.5.2.1. Cromatografía de gases de alta resolución (GC) ............................................................................ 24

3.5.2.2. Cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (GC-MS) ...................................... 25

3.5.2.3 Identificación de los componentes presentes en un aceite esencial ......................................... 26

3.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales ............................................... 27

3.6.1. Difusión en agar ................................................................................................................................ 27

3.6.2 Dilución en caldo ................................................................................................................................ 28

3.7. Escherichia coli E .......................................................................................................................... 28

4. Metodología ................................................................................................................................... 30

4.1. Material vegetal .............................................................................................................................. 31

4.2. Obtención del aceite esencial de Peperomia subsphatulata por destilación de arrastre con

vapor ...................................................................................................................................................... 31

4.3. Análisis de la composición del AE por cromatografía de gases de alta resolución acoplada a

espectrometría de masas (GC- MS) ..................................................................................................... 33

4.4. Evaluación de la actividad biológica del aceite esencial ............................................................. 34

4.4.1. Determinación de la sensibilidad del AE frente a Escherichia Coli ........................................ 34

4.4.2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria de aceite esencial (CMI) en dilución

en caldo .................................................................................................................................................. 36

5. Resultados y análisis de resultados. ............................................................................................. 37

5.1. Determinación taxonómica del material vegetal............................................................................ 37

5.2 Extracción y caracterización química del aceite esencial. ........................................................... 37

5.2. Actividad antimicrobiana del aceite esencial....................................................................................... 43

6. Conclusiones ....................................................................................................................................... 51

7. Recomendaciones ............................................................................................................................. 52

8. Bibliografía ........................................................................................................................................ 53

9. Anexos. .................................................................................................................................................... 60

9.1. Anexo 1. Espectros de masas de la identificación tentativa de la especie Peperomia Subsphatulata 60

9.2. Anexo 2. Actividad antimicrobiana con las diferentes concentraciones del AE frente a E. coli .......... 76

Listado de tablas

Tabla 1. Usos tradicionales de Peperomias .................................................................................. 16

Tabla 2. Estudios de actividad biológica de especies de género Peperomia. ............................... 19

Tabla 3. Volumen aplicado del stock de AE e Hidrolato en sus respectivos pozos. .................... 35

Tabla 4. Determinación taxonómica de la especie Peperomia subspathulata. ............................ 37

Tabla 5. Masa, densidad y rendimiento del AE e hidrolato obtenidas por destilación de arrastre

con vapor. ...................................................................................................................................... 38

Tabla 6. Identificación tentativa de los compuestos presentes en el AE e hidrolato de Peperomia

subsphatulata. ............................................................................................................................... 39

Tabla 7. Porcentaje de inhibición del AE de la especie Peperomia subsphatulata frente

Escherichia coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas. ................................... 44

Tabla 8. Porcentaje de inhibición del hidrolato de la especie Peperomia subsphatulata frente

Escherichia coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas. ................................... 44

Tabla 9. Resultados prueba t comparación efecto inhibitorio del aceite e hidrolato .................... 46

Tabla 10. Evaluación de la CMI del AE de la Peperomia subsphatulata frente a Escherichia coli

a 35 °C 24 horas. ........................................................................................................................... 47

Listado de Figuras

Figura 1. Distribución geográfica del género Peperomia a nivel mundial. ................................................ 16

Figura 2. Estructuras de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales de peperomias. .......... 18

Figura 3. Características morfológicas de la especie Peperomia subspathulata. .................................. 22

Figura 4. Diagrama de un sistema convencional de CG-MS (Grob, & Barry, 2004). ........................ 26

Figura 5. Diagrama de la metodología. ...................................................................................................... 30

Figura 6. Destilador de arrastre con vapor empleado para la obtención del aceite esencial de Peperomia

subsphatulata .............................................................................................................................................. 32

Figura 7. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de la Peperomia subsphatulata

utilizando una columna DB-FFAP de 25 m de largo. ................................................................................. 41

Figura 8. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de Peperomia subsphatulata

utilizando una columna DB- FFAP de 25 m de largo. ........................................................................... 41

Listado de Graficas

Grafica 1. Comparación de % inhibición bacteriana del AE e Hidrolato de la especie Peperomia

subsphatulata frente a Escherichia coli a 35 °C 24 horas……………………………………...46

Lista De Abreviaturas

Abreviatura Término

µm micrómetros

AE Aceite esencial

CMI Concentración mínima inhibitoria

CV Coeficiente de varianza

DMSO Dimetilsulfóxido

GC-MS Cromatografía de gases de alta resolución acoplada a

espectrometría de masas

Ik Índices de Retención de Kovats

mL mililitros

mm milímetro

MS Espectros de Masas

nm nanómetros

ºC Grados centígrados

S Desviación estándar

ufc Unidades formadoras de colonias

μg microgramo

μL Microlitro

Resumen

El género Peperomia perteneciente a la familia Piperácea se caracteriza por presentar un amplio

espectro de actividades biológicas, en Colombia existen muchas especies de este género a las

cuales no se le han realizado estudios investigativos, tal es el caso de la Peperomia subspathulata

la cual es utilizada por la población para el tratamiento de enfermedades como dolor de cabeza

estómago, ansiedad entre otras. Además, posee un agradable aroma es por ello que se obtuvo su

aceite esencial el cual se caracterizó mediante CG-MS y se evaluó frente a la bacteria

Escherichia coli con el propósito de establecer su potencial como agente antimicrobiano. Los

compuestos mayoritarios identificados fueron safrol (69,48%), α-bisabolol (16,13%), miristicina

(3,65%) y xantoxilina (1,01%) en el aceite esencial y safrol (37,95%), α-bisabolol (34,56%),

miristicina (5,77%) y xantoxilina (7,45%) en el hidrolato. El aceite esencial mostró que no tiene

un efecto inhibitorio frente a Escherichia coli y según la CMI la bacteria presenta resistencia al

efecto antimicrobiano del aceite esencial.

1. Introducción

Colombia es uno de los países más biodiversos del mundo, cuenta con 27.887 especies vegetales

de las cuales 2.404 son de uso medicinal y cerca de 1.656 son especies nativas (Bernal, García,

Quevedo, 2001; Moncada, Tamayo, Cardona, 2016). Este recurso natural ha sido utilizado con

diversos fines por la población como fuente de alimento, para la construcción de vivienda y

algunas son usadas tradicionalmente para el tratamiento de dolencias o enfermedades (Tofiño, et

al., 2016). De estas 1.656 especies, solo el 12,5% tienen estudios químicos y/o biológicos que

permitan conocer sus componentes químicos y/o sus efectos farmacológicos que validen sus usos

medicinales (Bernal, et al., 2001).

La familia Piperaceae la conforman 5 géneros de los cuales Piper, Peperomia son los más

representativos (Wanke, et al., 2006) por poseer mayor cantidad de especies. Las especies

Peperomias se caracterizan por sus aceites esenciales de naturaleza terpénica y presencia de

fenilpropanoides los cuales han mostrado propiedades antimicrobianas, antioxidantes,

antinflamatorias (Mora, et al., 2011; Pinheiro, et al., 2011).

Por lo tanto, los aceites esenciales producidos por estas especies son utilizados como materias

primas en la industria de alimentos, cosméticos e inclusive en la industria farmacéutica

(Delgado, Kato, Vásquez, Minchala & Rojas, 2012).

De acuerdo con lo anterior, este proyecto pretende contribuir con el conocimiento químico de la

especie Peperomia subsphatulata con el análisis de la composición química del aceite esencial y

evaluar el potencial antimicrobiano frente a la bacteria Escherichia coli ya que este

microorganismo es responsable de infecciones en el ser humano y ha mostrado resistencia a los

medicamentos usados para su control.

2. Objetivos

2.1. Objetivo general

Caracterizar el aceite esencial de la especie Peperomia sp (Piperaceae) y evaluar su actividad

antimicrobiana.

2.2.Objetivos específicos

Aislar el aceite esencial de la especie Peperomia sp por destilación de arrastre con vapor.

Identificar y cuantificar los componentes presentes en el aceite esencial con base en el

índice de retención y los espectros de masas de los compuestos individuales obtenidos

por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.

Evaluar la capacidad del aceite esencial de la especie Peperomia sp como agente

antimicrobiano mediante bioensayos con la bacteria Escherichia coli ATCC® 8739.

3. Estado del arte

3.1.Generalidades de la familia Piperaceae

La familia Piperaceae se distribuye en la región pantropical (Trujillo, & Posada, 2015) y en

Latinoamérica es abundante en los bosques andinos de mediana a baja elevación y en menor

proporción se encuentran especies en la selva tropical de la Amazonía. Comprende plantas

herbáceas arbustivas, algunas veces trepadoras y árboles. Piper nigrum o ¨pimienta negra¨ es la

especie más representativa de la familia cuyas semillas son utilizadas como condimento en la

preparación de alimentos y por esto actualmente es la de mayor importancia económica

(Delgado, et al., 2012).

La familia Piperaceae está constituida por cinco géneros, a saber, Piper, Peperomia, Verhuellia,

Zeppelia y Manekia (Wanke, et al., 2006) y cuenta con 3500 especies. Esta se divide en dos

subfamilias Piperae (especies cuyos pistilos poseen tres estigmas) y Peperomiae (especies cuyos

pistilos poseen un solo estigma). A éstas subfamilia pertenecen las especies de Piper y

Peperomia, respectivamente. En Colombia encontramos los géneros Piper, Peperomia y

Manekia (Trujillo, & Posada, 2015) y algunas de ellas son usadas tradicionalmente para el

tratamiento del dolor de estómago, cabeza, vaginitis, trastornos intestinales, la ansiedad y como

repelente de insectos (Scott, Jensen, philogene, &arnason,2008).

3.2. Generalidades del género Peperomia

El género Peperomia es el segundo más biodiverso en la familia Piperaceae con 1600 especies

(Melo, Guimarães, & Alves, 2016) que se caracterizan por ser suculentas, epífitas y geófitos

(Gutierrez, et al., 2016). Los rasgos morfológicos de las Peperomias son bastante variables y

hacen que la identificación taxonómica sea compleja; las plantas se caracterizan por poseer flores

pequeñas, apétaladas, pediceladas, con los pistilos parcialmente inmersos en el raquis, el estigma

fimbriado, solitario, lateral o terminal. Sus frutos son ovoides o cilíndricos con un pericarpio

víscido y a menudo verrugoso. Sus hojas son alternas, opuestas o verticiladas con puntos

glandulares rojos, amarillos o marrón (Martínez, Engleman, & Koch, 2006; Melo, et al., 2016;

Guillermo, 2002; Carvajal & Quintero, 2012).

El género Peperomia tiene distribución pantropical; su mayor diversidad en el neotropico (1420

especies) (Guillermo,2002), seguido por Asia (alrededor de 100 especies), África (alrededor de

20 especies), Madagascar (Alrededor de 40 especies), y Australia y Nueva Zelanda (menos De

20 especies) (Wanke, et al., 2006).

En Colombia según datos del sistema de información sobre biodiversidad de Colombia SIB, el

género Peperomia se distribuye en los departamentos de Cundinamarca, Nariño, Putumayo,

Tolima, Choco, Valle del Cauca, Huila, Meta, Caldas, Risaralda, Quindío, Antioquia, Boyacá,

Santander, Magdalena, Caquetá, Guaviare en mayor proporción y en la zona Córdoba, Sucre,

Atlántica, Casanare y Vaupés se han reportado algunas especies. Son comunes en altitudes

desde los 2600 m.s.n.m.

Figura 1. Distribución geográfica del género Peperomia a nivel mundial.

Fuente. (Judd, et al.,2007).

Las especies del género Peperomia se han caracterizado por sus aplicaciones en la medicina

tradicional para calmar el dolor de cabeza, estómago, otitis, asma y convulsiones. En la Tabla 1

se mencionan algunos de los usos etnobotánicos de las especies de este género:

Tabla 1.

Usos tradicionales de Peperomias.

ESPECIES

PARTE QUE

SE UTILIZA

DE LA

PLANTA

FORMA

DE USO

USO TRADICONAL

Peperomia pellucida.

(Hartati, Angelina,

Dewiyanti &

Meilawati, 2015)

Planta entera o

partes de la

planta

Decocción

para la

aplicación

tópica

Tratar dolores artríticos, úlceras

gástricas y arritmia cardiaca, asma,

tos, inflamación, infecciones

urinarias.

Peperomia

subsphatulata

(Lagos, 2007)

Planta entera Infusión Tratar dolor de estómago, cabeza,

muela, nervios, golpes, y

quemaduras.

Peperomia

subsphatulata

(Angulo, Rosero &

Gonzales, 2012

Planta entera

Emplastos e

Infusión

Aliviar golpes y heridas.

Purga para las mujeres para

postparto.

Peperomia

ineaqualifolia Ruiz &

Pav.

(Carvajal &

Quintero, 2012)

Hojas y tallo

Zumo de

las hojas y

tallos

Infusión de

las hojas

Tratar dolor de oído y la sordera.

Afecciones del corazón estimulante

cardiaco y dolor de cabeza,

combatir la esterilidad.

Peperomia tetraphylla

(Nishanthi, et al.,

2012)

Planta entera

Jugo

Tratar convulsiones, infecciones

microbianas del riñón, la piel y para

la tos.

3.3.Estudios fitoquímicos de especies del género Peperomia

De las especies del género Peperomia se han encontrado metabolitos secundarios como lignanos,

policétidos, flavonoides, amidas y taninos (Mbah, et al., 2012, Batista, et al., 2009, Batista, et al.,

2012; Felippe, al.,2008; Guillermo, R. 2002). Las Peperomias se caracterizan por tener aceites

esenciales de tipo terpénico y con presencia de fenilpropanos entre los que se puede mencionar

pinenos, elemeno, biciclogermacreno, viridiflorol (Verma, Padalia, Goswami, & Chauhan, 2015;

Yang, et al.,2014¸ Pinheiro, et al.,2011), el safrol, eugenol, miristicina, (Rivera, et al., 2015).

Figura 2. Estructuras de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales de

peperomias.

3.4. Estudios de actividad biológica de especies del género Peperomia

Especies del género Peperomia han sido evaluados por ser responsables de actividades

antiinflamatorios, insecticidas, antivirales, antimicrobianos, antifúngicas, anticonceptivo (Tabla

2).

ϒ-ELEMENO VIRIDIFLOROL Β-ELEMENO EUGENOL

SAFROL

MIRISTICINA

5-DEMETILLTANGERETINA

ESTIGMASTEROL

Tabla 2.

Estudios de actividad biológica de especies de género Peperomia.

ESPECIES

PARTE

EMPLEADA Y

COMPUESTOS

ACTIVIDAD

BIOLOGICA

RESULTADO

Peperomia

Ineaqualifolia.

(Rivera, et al., 2015)

Aceite esencial de

hojas frescas.

Safrol, 11-αH-

himachal-4-en-1-β-ol,

elemicina, viridiflorol

Antimicrobianas

frente a

Estafilococos

áureos,

Streptococcus

mutans

Actividad

antimicótica

frente a Candida.

albicans y

tropicalis

Demostró alta actividad

antimicrobiana y

antimicótica con

respecto al control

positivo aceite esencial

tomillo (T. vulgaris)

Peperomia sui

(Yang, et al.,2014)

Extracto etanólico

planta entera.

Sesamina, sitosterol,

ácido vanílico.

Antiviral frente a

virus H6N1

invitro

Demostró potencial

antiviral.

Peperomia serpens

Pinheiro, et al.,2011).

Aceite esencial toda la

planta.

a-humuleno, (E) –

cariofileo (E) -

nerolidol y (Z) acetato

-nerolidol

Antiinflamatorio

en ensayo

abdominal

inducida por

ácido acético

y

anticonceptiva en

prueba de la

formalina en

ratones

Demostró actividad

significativa

antinflamatoria

y

importante y periférica

anticonceptiva con

respecto a los controles

positivos indometacina

y morfina

Peperomia acuminata

(Mora, et al., 2016).

Aceite esencial de las

hojas

2-E-dodecenal,

dodecanal y

tetradecanal

Antimicrobiana

frente a Gram

positivas

Staphylococcus

aureus

y

Enterococcus

faecalis


antimicrobiana con

respecto al control

positivo Eritromicina

Y

Vancomicina

Peperomia pellucida

(L.) HBK

(Arrigoni-Blank et

al.,2004).

Extracto acuoso parte

aérea secas

Antiinflamatorio

en ensayo

inducido por

carragenina de

edema de pata de

rata y

retorcimiento

abdominal (n=10)

utilizando ácido

acético.

Demostró actividad

significativa

antiinflamatoria y

analgésica con respecto

a los controles positivos

indometacina y morfina

Peperomia pellucida

(L.) HBK.

(Akinnibosun,

Akinnibosun, German,

2008

Extracto acuoso y

etanólico de hojas

secas

Antimicrobiana

frente a E. coli, P.

mirabilis y P.

aeruginosa


antimicrobiana en

extracto acuoso E. coli

y en extracto etanol P.

mirabilis y P.

aeruginosa

3.5. Peperomia subspathulata Yunck

Es un arbusto de tallos erectos, carnosos, de color verde y morado, anillados, débiles, olorosos.

Las hojas son simples, verticiladas, en número de cinco, sin estípulas ni exudado, espatuladas,

emarginadas, carnosas, olorosas, gruesas y uninervadas; pueden llegar a medir 3 a 1.2 cm. La

inflorescencia es terminal de color verde amarillo, carnosa, con flores diminutas y un pedúnculo

corto. Crece hasta 12 por 0.3 cm (Mahecha,G (s.f)).

La especie Peperomia subspathulata es originaria de Colombia y Ecuador (Bernal, Gradstein

Celis, 2015). En Colombia se encuentran en los departamentos en Bogotá D.C, Risaralda,

Boyacá, Tolima, Cundinamarca (Herbario Nacional y el Jardín Botánico José Celestino Mutis de

Bogotá) y es conocida comúnmente como canelón.

Es utilizada en la medicina tradicional para tratar dolor de estómago, infección urinaria, cabeza,

muela, ansiedad, nervios, golpes y quemaduras (Lagos, 2007).

Figura 3. Características morfológicas de la especie Peperomia subspathulata.

3.6.Métodos de obtención y análisis de los compuestos aislados en aceites esenciales

Los aceites esenciales (AEs) o esencias son fracciones liquidas volátiles altamente concentradas

que poseen olores agradables, responsables del aroma de las plantas, están constituidos por

mezclas que puede tener desde 50 hasta 300 componentes volátiles y semivolátiles. Los AEs son

el producto del metabolismo secundario de las plantas; en su composición química se encuentran

hidrocarburos terpénicos, sus derivados oxigenados (alcoholes, aldehídos, cetonas, esteres y

ácidos) y fenilpropanoides (Stashenko,2009; Bandoni, 2003).

Los AEs son conocidos por tener un potencial terapéutico y se utilizan ampliamente para

prevenir y tratar las enfermedades humanas por sus propiedades bactericidas, virucidas, fúngicas,

antinflamatorias, antitumorales entre otras; también son utilizados en los sectores agronómicos,

alimentos, sanitarios, cosmético y perfumería. (Santos, et al., 2014; Stashenko,2009; Bandoni,

2003).

El hidrolato es un subproducto del proceso de destilación y corresponde al agua condensada en la

cual se solubilizan los compuestos más polares del aceite esencial y en muchas ocasiones puede

ser aprovechado por sus características de aroma (Stashenko,2009; Bandoni, 2003).

3.5.1. Obtención de AEs por destilación de arrastre con vapor

Los AEs se extraen por destilación de arrastre con vapor, hidrodestilación o métodos mecánicos

como es el caso de la obtención de cítricos. Los aceites esenciales generalmente están presentes

entre el 0.5 a 2% del material vegetal (Mascret, 2010; Stashenko,2009; Bandoni, 2003).

Destilación por arrastre con vapor es una técnica utilizada en la obtención de aceites esenciales

debido a las características olfativas o de aroma del aceite esencial que se aproximan al aroma de

la planta, además no requiere de tecnologías sofisticadas (Santos, et al., 2014).

En la técnica se utiliza vapor de agua para extraer los compuestos volátiles del material vegetal;

la generación del vapor puede ser local (hervidor), remota (caldera) o interna (base del

recipiente). El vapor transfiere energía al material que va ir ganando temperatura hasta que los

compuestos volátiles pasan a fase vapor y son arrastrados por el vapor que ascenderá hasta

encontrarse con la parte fría del condensador. En el condensador, la mezcla se condensada se

enfría y como resultado se obtiene la mezcla de agua y aceite esencial que al no ser miscibles se

separan por diferencia de densidad. Cuando el aceite esencial está compuesto por sustancias

oxigenadas, éstas pueden distribuirse entre la fase del aceite esencial y la fase acuosa. Los

compuestos volátiles solubles en el agua pueden ser extraídos usando un disolvente (Albarracín

& Gallo, 2003).

3.5.2. Método de análisis e identificación de los componentes de los AEs

3.5.2.1. Cromatografía de gases de alta resolución (GC)

La cromatografía de gases de alta resolución es una técnica de análisis que permite la separación

de mezclas de compuestos volátiles o volatilizables. La separación se da por la interacción de los

analitos con la fase estacionaria y la fase móvil que en este caso es un gas (H2, He) y por el

gradiente de temperatura al que es sometido el sistema de separación. Permitiendo por ello la

separación de compuestos químicamente muy similares, que no es posible realizar por otros

métodos.

En cromatografía de gases, la muestra se inyecta en el puerto de inyección que se encuentra a

una temperatura de 250 °C a la cual la muestra se volatiliza y luego es llevada por el gas de

arrastre hasta la cabeza de la columna cromatográfica. La columna utilizada en esta

cromatografía es capilar, la cual tiene una longitud de 30 m o 60 m; posee una fase estacionaria

con columnas con diferentes polaridades, así como el espesor de la fase estacionaria y el

diámetro interno (Skoog, West y Holler,1996).

La cromatografía de gases es la técnica más empleada en el análisis de aceites esenciales que al

ser mezclas complejas de compuestos químicamente muy relacionados, como el caso de los

terpenos, solo pueden ser separados por esta técnica. La cromatografía de gases emplea

diferentes detectores, el detector de ionización en llama (FID). El detector de ionización en llama

(FID, Flame Ionization Detector) es considerado un detector universal y por lo general se emplea

para llevar a cabo análisis cuantivativo l (Bandoni, 2003; Marriott, Shellie & Cornwell, 2001).

3.5.2.2. Cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (GC-MS)

La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas permite, además de hacer una

separación de los compuestos, permite obtener la información del espectro de masas de los

compuestos presentes en la mezcla y con ello hacer análisis cualitativos y cuantitativos. Este

sistema de GC- MS consta de las tres unidades; cromatógrafo de gases, espectrómetro de masas

y un sistema de datos (McNair y Miller, 2011; McLafferty, y Tureček, 1993).

Durante las dos últimas décadas se ha demostrado que el método de identificación por CG-MS es

el más apropiado para el análisis de AEs debido a que los componentes de este son compuestos

volátiles y de bajo peso molecular (300 Dalton.En CG-MS la muestra se inyecta en el

cromatógrafo, luego, los componentes del AE se separan y a medida que salen de la columna

pasan al espectrómetro de masas y se obtienen los espectros de masas de cada una

de las sustancias (Bandoni, 2003).

Pasan al espectrómetro de masas proporcionando información estructural de los componentes de

la mezcla a partir de los patrones de fragmentación y el peso molecular de cada compuesto.

Figura 4. Diagrama de un sistema convencional de CG-MS (Grob, & Barry, 2004).

3.5.2.3 Identificación de los componentes presentes en un aceite esencial

La identificación de los compuestos de un aceite esencial analizado por GC-MS se realiza con

base en dos criterios, el primero es el índice de Kovat’s o índice de retención y el segundo por el

espectro de masas del compuesto.

El índice de Kovat’s es un valor que se determina con base en los tiempos de retención de cada

compuesto a identificar y el tiempo de retención de un patrón de n-alcanos corridos en las

mismas condiciones analíticas de la muestra. El índice de retención de un n-alcano es igual a

cien veces el número de carbonos del compuesto. El Ik es un valor característico para cada

compuesto y fase estacionaria usada lo que permite comparar este valor con reportes en la

literatura (Skoog, West y Holler,1996; Stashenko & Martínez, 2010).

3.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales

Una manera de evaluar la actividad antimicrobiana es por medio de los bioensayos de difusión,

dilución y bioautográficos (Ramírez, Stella, & Marín Castaño, 2009) que consisten en valorar la

resistencia y/o susceptibilidad microbiana y la concentración minina inhibitoria (Sánche,

Castillo, García, 2016). Los resultados que se obtienen permiten cuantificar la actividad

antimicrobiana de una sustancia frente al microorganismo en estudio y comparar con lo

reportado por la literatura.

Los métodos más utilizados para determinar la actividad antimicrobiana se describen a

continuación.

3.6.1. Difusión en agar

El método de difusión en agar o el método Kirby-Bauer permite establecer la susceptibilidad

antimicrobiana, es decir, proporciona resultados cualitativos del efecto de la sustancia evaluada

sobre el microorganismo que puede ser susceptibles, intermedio o resistentes. Por lo tanto, este

método se emplea para microorganismos de crecimiento rápido; además presenta la ventaja de

ser reproducible, de bajo costo, no requiere gran cantidad de extracto y/o compuesto tiene

capacidad para probar un gran número de microorganismos, agentes antimicrobianos y la

facilidad para interpretar los resultados proporcionados (Balouiri, et al. 2016).

Sin embargo, una de las desventajas de este método es que no se puede distinguir entre los

efectos bactericidas de los bacteriostáticos, dado que, aunque haya inhibición esto no significa

que se produzca una muerte bacteriana (Balouiri, et al. 2016; Sánche, et al., 2016)

La difusión en agar se puede desarrollar en disco o pozo; las técnicas de discos son más costosas

es inexactas a la hora de impregnar la sustancia en el disco, pero es una técnica muy práctica por

la facilidad del montaje. La técnica de pozos requiere que se perfore el agar con un sacabocados

estéril y es de bajo costo (Sánche, et al., 2016; Balouiri, et al. 2016).

La difusión en agar permite evaluar el grado de inhibición para el crecimiento de los

microorganismos y posiblemente cambios en su morfología provocados por la sustancia

evaluada (Ramírez, et al., 2009). La inhibición se establece con base en la relación entre la

concentración de la sustancia que inhibe el crecimiento del microorganismo y el halo de

inhibición de crecimiento o distancia alrededor del lugar de aplicación de la sustancia que

permite medir la sensibilidad bacteriana (Sánche, et al., 2016).

3.6.2 Dilución en caldo

El método de dilución en caldo es un método que permite definir la sensibilidad de agentes

antimicrobianos potenciales. El objetivo es determinar la concentración mínima inhibitoria

(CMI) que corresponde a la mínima concentración del aceite esencial o compuesto capaz de

inhibir el crecimiento de la bacteria. La ventaja de este método es que es reproducible y fácil de

cuantificar que los basados en los métodos de difusión en disco y en pozo agar que son

cualitativos (Sánche, et al., 2016).

3.7. Escherichia coli E

Escherichia coli es una bacteriana gram-negativa de la familia de las enterobacterias y es

representativa del grupo de los coliformes que está presente en la flora intestinal normal de los

seres humanos y su importancia radica en que puede generar infecciones urinarias, meningitis

entre otras. Es un microorganismo muy utilizado en bioensayos porque es cultivable en un medio

básico con fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo (Baker, 2009).

El microorganismo Escherichia coli, fue seleccionado para ser evaluado frente al aceite esencial

de Peperomia subsphatulata por ser un agente patógeno para humanos que crea resistencia con

mucha facilidad (Bartram, Cotruvo, Exner, Fricker & Glasmacher,2003; Baker, 2009). También

porque esta bacteria fue evaluada por AEs de especies de esta familia (Fidalgo, Parra, Lizama,

Maes, & Wellens, 2012) en los cuales se reportó efecto inhibitorio moderado frente a E. coli .

4. Metodología

El desarrollo experimental de este estudio se llevó a cabo según el esquema que aparece en la

Figura 5.

Figura 5. Diagrama de la metodología.

AE

obtención por destilación de arrastre con

vapor

Material Vegetal

- Selección

- Identificación

Evaluación

Actividad antimicrobiana

Analisis de composición quimica por

GC-MS

Identificación

tentativa de la

composición del

AE

4.1. Material vegetal

La recolección del material vegetal se llevó acabo en de agosto de 2016 en el Jardín Botánico de

José Celestino Mutis, un espécimen se entregó al Herbario del Jardín Botánico para su

clasificación taxonómica. Se trabajó con tallos, hojas frescas e inflorescencia sanas y limpias.

4.2. Obtención del aceite esencial de Peperomia subsphatulata por destilación de arrastre

con vapor

El material fresco (tallos, hojas, e inflorescencias) se pesó 1450 g de Peperomia subsphatulata,

se sometió a destilación por arrastre con vapor; en un destilador semi-industrial de acero

inoxidable y se obtuvo 1.8 mL de aceite esencial. El destilador utilizado consta de una fuente de

vapor (1) que luego pasa al depósito (2) donde se dispone el material vegetal troceado. El vapor

arrastra los componentes volátiles presentes en el material vegetal y la mezcla vapor y aceite

esencial hasta el condensador (3) que enfría el vapor y los componentes volátiles del material

vegetal, el condensado se colecta en un tubo en U (4) (Figura 3). Este procedimiento se realizó

en el laboratorio de productos naturales vegetales del departamento de Química de la

Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.

Figura 6. Destilador de arrastre con vapor empleado para la obtención del aceite esencial

de Peperomia subsphatulata

El rendimiento de la extracción se calculó con la fórmula:

%𝑅 = (𝑃𝐴𝐸

𝑃𝑀𝑉) ∗ 100 (1)

Donde:

%R: es el porcentaje de rendimiento, de la extracción del aceite esencial,

PAE: La cantidad de aceite esencial obtenida en gramo.

PMV: La cantidad de material vegetal sometido a extracción en gramos.

1

2

3 2 4

4.3. Análisis de la composición del AE por cromatografía de gases de alta resolución

acoplada a espectrometría de masas (GC- MS)

La determinación de la composición del AE se realizó por cromatografía de gases de alta

resolución acoplada a espectrometría de masas, se utilizó un cromatógrafo de gases (Agilent

Technologies 7890) acoplado a un detector selectivo de masas (Agilent Technologies 5977A)

con ionización de impacto electrónico (EI, 70 eV), inyector split / splitless con (relación de

división de flujo de 1/30) un sistema de datos MassHunter. Se usó una columna capilar polar tipo

DB- FFAP (Polietilenglicol modificado con ácido nitrotereftálico) de 25 m de longitud, 200 µm

de diámetro interno y 0,3 µm de espesor de la fase estacionaria. Se empleó Helio como gas de

arrastre a un flujo de 1,0 mL/min, con un programa de temperatura desde 40 (2 min) hasta 250

ºC (1min), a una velocidad de 4 ºC/min (10min).

Las temperaturas del puerto de inyección y de la línea de transferencia se fijaron en 250 y 285

ºC respectivamente. La muestra del aceite esencial se diluyó con CH2Cl2 (50 µL/mL) y se

inyecto 1µL de AE.

La identificación tentativa de los componentes presentes en el aceite esencial se realizó mediante

los índices de retención de Kovat’s (IK) para lo cual se corrió una solución patrón de parafinas de

C8 a C24 y su comparación con los reportados en las bases de datos NIST y FLAVORNET y por

el análisis y comparación de los espectros de masas de cada uno de los analitos con la base de

datos y con los reportados en la literatura.

Se calculó con la siguiente ecuación:

𝐼𝐾 = 100𝑛 + 100 [𝑡𝑅𝑥−𝑡𝑅𝑛

𝑡𝑅𝑁−𝑡𝑅𝑛] (2)

Dónde:

Ik: Índice de retención del compuesto de interés x;

N: Números de átomos de carbono del n-alcano que eluye después del compuesto de

interés x;

n: Números de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de

interés x;

tRX: Tiempo de retención del compuesto de interés x;

tRn: Tiempo de retención de n-alcanos que eluye antes del compuesto x;

tRN: Tiempo de retención de n-alcanos que eluye después del compuesto x.

4.4. Evaluación de la actividad biológica del aceite esencial

El aceite esencial se evaluó frente a la cepa de la bacteria Escherichia Coli (ATCC® 8739)

mediante métodos de difusión en agar y dilución en caldo y se realizarón en el laboratorio Laser.

Inicialmente la bacteria fue reconstituida en caldo tripticasa de soya y seguidamente fue aislada

en agar tripticasa de soya por un tiempo de incubación de 24 horas a 35 °C.

La solución del inóculo se preparó empleando agua estéril y se realizaron diluciones hasta

obtener una concentración de 0.5 según la escala Mcfarland; que corresponde a 1,5X108

UFC/mL. La medida de absorbancia se realizó a una longitud de onda de 640 nm en un

espectrofotómetro BDOSCIENT.

4.4.1. Determinación de la sensibilidad del AE frente a Escherichia Coli

Para el desarrollo del bioensayo en difusión en agar para la evaluación de la susceptibilidad y

capacidad microbiana del AE y del hidrolato. Se prepararon las soluciones stock

correspondientes a 9,436 µg/μL del AE y 9,966 µg/μL del hidrolato y se evaluaron las siguientes

cantidades.

Tabla 3.

Volumen aplicado del stock de AE e Hidrolato en sus respectivos pozos.

VOLUMEN DE LA

SOLUCIÓN STOCK (µL)

ACEITE ESENCIAL (µg) HIDROLATO (µg)

10 94.36 99.66

20 188.72 199.32

30 283.08 N.E

50 471.80 N.E

100 943.60 996.60

N.E: No fueron evaluadas

Cada ensayo se evaluó por triplicado, tanto para el método de dilución en caldo y difusión en

agar, se empleó control negativo dimetilsulfóxido (DMSO) y se eligió la gentamicina (10 μg)

como control positivo ya que es aminoglucosido que ingresa a la célula mediante transporte

activo, una vez dentro de la célula se une de manera irreversible a la subunidad 30s del ribosoma

bacteriano; que provoca error de lectura del RNA-mensajero con producción de una proteína

anómala, la cual unido a las alternativas funcionales de la membrana, (induce fuga de sodio,

potasio y otros componentes esenciales) que producen la muerte bacteriana (Lorenzo, et al.,

2008).

Para llevar a cabo la evaluación de la actividad antimicrobiana de ambas muestras se prepararon

cajas plásticas de 90 x 15 mm 15 mL de medio Mueller Hinton y se dejó solidificar.

Seguidamente, se adicionó 10 mL del medio con inóculo (Escherichia coli) y se dejó solidificar

por 30 minutos. Luego se realizaron los micropozos con el sacabocados de 5 mm, El residuo se

retiró con una aguja estéril y se sellaron con 0,1 mL del mismo agar, para evitar la dispersión del

AE dejando el pozo disponible para la aplicación de las muestras a evaluar.

El porcentaje de inhibición se determinó midiendo el diámetro del halo o zona alrededor del

micropozo donde no creció el microorganismo de acuerdo con la siguiente fórmula:

%𝐼 = H.M (mm)

H.C (mm) 𝑥 100 (3)

Dónde:

%I: porcentaje de inhibición.

H.M: promedio de halo de la muestra en (mm)

H.C: promedio de halo del control positivo en (mm)

4.4.2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria de aceite esencial (CMI) en

dilución en caldo

Con el fin de determinar la concentración mínima inhibitoria se prepararon tubos de ensayo con

3 mL de medio de cultivo caldo tripticasa de soya y se les adicionó una alícuota de la solución

stock del aceite esencial (10, 20, 30, 50, 80, 100, 150, 200 μL). Los tubos se incubaron se 35 °C

por 24 horas y se analizaron en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 640 nm con lo

cual se determinó el valor de absorbancia de cada ensayo y se realizó la curva de calibración para

determinar la concentración mínima inhibitoria.

5. Resultados y análisis de resultados.

5.1. Determinación taxonómica del material vegetal.

El material Vegetal estudiado en la presente investigación fue identificado por el Botánico

Carlos Suarez como Peperomia subsphatulata y un espécimen reposa en el Herbario del Jardín

Botánico de Bogotá (JBB) con el código CISB 699 y el Voucher C.I. Suarez 699. La

clasificación taxonómica aparece en la Tabla 4.

Tabla 4.

Determinación taxonómica de la especie Peperomia subspathulata.

Reino Plantae

División Angiospermas

Orden Piperales

Familia Piperaceae

Género Peperomia

Epíteto específico Subspathulata

Autor del epíteto específico Yunck.

Nombre científico Peperomia subspathulata Yunck.

5.2 Extracción y caracterización química del aceite esencial.

A partir de 1450 g de material fresco se obtuvo 1,8 mL del AE por destilación de arrastre con

vapor con un rendimiento 0.11% p/p y además el hidrolato fue sometido a extracción con éter y

se obtuvo 0.498 g con un rendimiento 0.03% p/p.

Tabla 5.

Masa, densidad y rendimiento del AE e hidrolato obtenidas por destilación de arrastre con

vapor.

AE HIDROLATO

Masa (g) 1.6890 0.4986

Densidad (g/mL) 0,9383 0,9936

% Rendimiento(p/p) 0.1164 0.0343

Para el análisis por CG-MS se preparó una dilución del AE y del hidrolato (1 μL en 1 mL de

DCM). El análisis de las muestras se realizó en un equipo acoplado a un detector selectivo de

masas con ionización de impacto electrónico. Y los perfiles cromatográficos obtenidos

corresponden a la Figuras 7.

Los compuestos químicos presentes en mayor proporción fueron identificados por medio de la

determinación de los Ik y su comparación; así como la comparación de los espectros de masas de

los compuestos individuales con las bases de datos (las que aparecen en los reportes) e inclusive

con las bases de datos Nist, Flavornet. Anexo.1 espectros de masas

En total se identificaron tentativamente 23 en AE y 27 en el hidrolato que representan el 98.6 %

del AE y 99.3% de la composición del hidrolato. Los compuestos identificados aparecen

numerados en el perfil cromatográfico de acuerdo con el tiempo de retención y coincide con la

numeración en la identificación tentativa de los componentes que se presenta en la Tabla 6.

Además, se incluye la composición relativa con base en las familias de compuestos identificados.

Los porcentajes corresponden al valor del área relativa de los picos cromatográficos de cada una

de las muestras.

Tabla 6.

Identificación tentativa de los compuestos presentes en el AE e hidrolato de Peperomia

subsphatulata.

No.

PICO

IK

IK

DB-FFAP

calculado

COMPUESTO CANTIDAD RELATIVA (%)

BASE DE

DATOS

AE HIDROLATO

1 1145 1140 1-β-Mirceno 0,15 N.D

2 1201 1209 Limoneno 0,09 N.D

3 1213 1218 1,8-Cineol 0,19 1.18

4 1220 1237 Hexanoato de etilo 0.09 0.08

5 1386 1404 NI 0,07 0.18

6 1458 1457 Octanoato de etilo 0,11 N.D

7 1535 1562 NI 0,44 2.76

8 1638 1633 β-Cariofileno 1,42 0.57

9 1650 1651 Aromandendreno 0,10 N.D

10 1671 1707 E- β-Farneseno 0,24 0.19

11 1660 1710 NI 1,44 0.86

12 1700 1724 α-Humuleno 1,16 0.69

13 1718 1737 α-Terpineol N.D 0.86

14 1736 1742 Ledeno 0,93 0.55

15 1772 1793 Trans-α-Bisaboleno 0,02 0.04

16 1903 1931 Safrol 69,48 37.95

17 1919 1948 Ionol N.D 0.60

18 2033 2042 Metileugenol 0,60 1.23

19 2053 2056 Trans-Nerolidol 0,70 1.00

20 2110 2118 NI N.D 0.12

21 2129 2160 Espatulenol N.D 0.21

22 2118 2171 Cinamato de etilo 0,24 0.32

23 2163 2175 Oxido de α-

Bisabolol β

N.D 0.73

24 2081 2183 NI 0,10 0.19

25 2198 2198 NI N.D 0.42

26 2227 2231 α-Bisabolol 16,13 34.56

27 - 2243 NI 0,23 0.59

28 - 2251 NI N.D 0.14

Composición por familias de compuestos

Monoterpenos 0,24 N.D

Monoterpenoides 0,19 2,04

Sesquiterpenos 3,47 2,04

Sesquiterpenoides 16,83 37,1

Fenilpropanos 73,73 44,95

Policetidos 1,01 7,45

Otros 0,44 0,40

N.I: No identificado,

N.D: No detectado.

* (No se encontraron reportes en la columna DB-FFAP)

29 - 2269 NI N.D 0.05

30 2272 2279 Miristicina 3,65 5.77

31 - - Xantoxilina * 1.01 7.45

Figura 8. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de Peperomia

subsphatulata utilizando una columna DB- FFAP de 25 m de largo.

El AE e hidrolato presentan semejansas en composicion; para el AE se establecieron la presencia

a

b

Figura 7. Perfiles cromatográficos del aceite esencial (a) e hidrolato (b) de la Peperomia subsphatulata

utilizando una columna DB-FFAP de 25 m de largo.

a

b

El safrol (69,48 %), el α-bisabolol (16,13 %), la miristicina (3,65 %) y la xantoxilina (1,01%),

como los componentes mayoritarios del AE que corresponden al 90 % en el caso del hidrolato el

safrol (37,95 %), el α-bisabolol (34,56 %), la miristicina (5,77%) y la xantoxilina (7,45%)

representan el 86 %. Otros compuestos como el β-cariofileno (1,42%), el α-humuleno (1,16%) y

el metileugenol( 1,23%) se encuentran en menor proporcion.

La composición relativa de acuerdo con las familias de compuestos (Tabla 6) demuestra que los

fenilpropanos son los componentes de mayor proporción tanto en el AE como en el hidrolato

siendo el 73,73% y 44,95% respectivamente.

Este análisis corresponde al primer reporte científico de la composición del AE de la especie

Peperomia subspathulata con lo cual se contribuye al estudio químico de los compuestos safrol,

miristicina, α-bisabolol, α-humuleno que son comunes en el AE de especies de los géneros

Peperomia y Piper (Gutiérrez, 2016; Rivera, et al., 2015; Guerrini, 2009; Andrés, et al., 2017;

Conde, L., Espinosa, J., & Guerrero, J. 2017).

La identificación química tentativa del AE de Peperomia subspathulata realizada en este trabajo

de investigación solo se puede comparar con otros reportes de especies de la familia Piperaceae

por ser esta la primera caracterización química que se realiza a esta especie. En los reportes

encontrados en la literatura se puede observar que los componentes identificados safrol, α-

bisabolol y miristicina son representativos de la familia Piperaceae, pero en la identificación

tentativa se encontró la presencia de xantoxilina (7,45%), que no es un componente común de

esta familia; sería interesante confirmar la presencia de esta molécula ya que está se encuentra en

pocas especies de otras familias y puede ser un indicador quimiotaxonomíco de la especie

Peperomia subspathulata. Este componente es muy importante porque se utiliza actualmente en

la industria farmacéutica y cosmética como compuesto bioactivo contra el virus de la hepatitis B

(Yoon, Chung & Chung, 2000), pero a un mayor por su utilización como molécula cabeza de

serie para el diseño de nuevos fármacos.

El α-bisabolol (34,56 %), presente en el AE se caracteriza por ser un agente antinflamatorio

(Barreto, et al., 2016); esta sustancia posee un potencial uso en la utilización para el tratamiento

de procesos inflamatorios por ende el AE de esta especie puede ser fuente de este componente.

Entre los principales componentes responsables de la acción antimicrobiana del AE encontramos

la miristicina y el safrol. La miristicina es una molécula activa frente a la bacteria E. coli

(Pavlović, et al., 2012; Sadgrove, et al., 2014) acción que puede estar en sinergia con el safrol.

El safrol 69,48 %), es un agente antimicrobiano con estudios de posibles mecanismos de

inhibición sobre enterobacterias; este actúa inhibiendo la producción de enzimas intracelulares,

como las amilasas y proteasas, lo que provoca el deterioro de la pared celular y un alto grado de

lisis celular, posiblemente debido a un efecto sinérgico entre ellos (Avello, et al.,2012).

5.2. Actividad antimicrobiana del aceite esencial

El aceite esencial y el hidrolato se evaluaron frente a Escherichia coli por el método de difusión

en agar, se determinaron los halos de inhibición y a las mediciones obtenidas para el bioensayo

se consignan en las Tablas 7 y 8.

Tabla 7.

Porcentaje de inhibición del AE de la especie Peperomia subsphatulata frente Escherichia

coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas.

AE

μg/ POZO

HALOS

(mm)

INHIBICIÓN

(% )

PROMEDIO

INHIBICIÓN

(% )

S

CV

94.4 0,1 0,5 0,2 0,3 173,2

0 0,0

0 0,0

188.7 6,9 36,1 35,6 0,5 1,3

6,5 35,3

7,1 35,3

283,1 8,5 44,5 43,1 2,8 6,4

8,8 44,9

8,1 39,9

471,8 11,1 55,0 53,8 1,2 2,2

10,2 52-6

10,8 53,7

943,6 13,2 69,1 68,6 1,6 2,3

14,1 69.8

13,5 66,8

Control positivo (gentamicina) 19,7 mm y control negativo (DMSO) 0,0 mm.

Tabla 8.

Porcentaje de inhibición del hidrolato de la especie Peperomia subsphatulata frente

Escherichia coli mediante método de difusión en agar a 35 °C 24 horas.

HIDROLATO

μg/ Pozo

HIDROLATO

HALOS (mm)

INHIBICIÓN

(%)

PROMEDIO DE

INHIBICIÓN

(%)

S

CV

99.6 0,0 0,0 0,0 0,0 173,2

0,0 0,0

0,0 0,0

199.3 5,5 28,8 28,4 3,9 13,6

Control positivo (gentamicina)19,7 mm y control negativo (DMSO) 0,0 mm.

Según los estándares de sensibilidad microbiana para el método de difusión o Kirby-Bauer para

clasificar un agente antimicrobiano como sensibilidad frente a un microrganismo se tiene en

cuenta el diámetro del halo este debe ser mayor de 20 mm, para intermedio 15-19 mm y

resistente menor o igual a 14 mm (corso, Pasteran, & Antimicrobianos, 2012); por esta razón se

determinó que el microrganismo E. coli presenta resistencia bacteriana al efecto inhibitorio del

AE de la especie Peperomia subsphatulata ya que presentó un halo de inhibición con un

diámetro de 13.6 mm.

La desviación estándar de las mediciones realizadas indica que los ensayos son reproducibles y

no se encontró diferencias estadísticamente significativas de una prueba a otra; los coeficientes

de variación calculados para cada una de las cantidades inyectadas se encuentran en un

porcentaje menor al 15%, lo cual demuestra que el método de difusión en agar es reproducible.

También, se comparó el porcentaje de inhibición del hidrolato para observar la sensibilidad

bacteriana frente a Escherichia Coli y compararla con la sensibilidad bacteriana del AE.

5,9 32,1

4,9 24,1

996.6 12,1 63,4 61,9 2,6 4,6

12,9 63,4

11,8 58,9

Grafica 1. Comparación de % inhibición bacteriana del AE e Hidrolato de la especie

Peperomia subsphatulata frente a Escherichia coli a 35 °C 24 horas.

En la Gráfica 1 se puedo analizar que el AE e hidrolato la desviación estándar muestra que no

hay diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de inhibición de los dos

compuestos frente a E. coli, ya que en la prueba t es de 0,7; para que haya diferencias

significativas debe ser inferior de a 0,05 por esta razón su efectividad de sensibilidad frente a

esta bacteria es similar.

Tabla 9.

Resultados prueba t comparación efecto inhibitorio del aceite e hidrolato.

PRUEBA T PARA DOS MUESTRAS SUPONIENDO VARIANZAS IGUALES

Variable 1 Variable 2

Media 30,07 34,76

Varianza 725,86 878,28

Observaciones 9,00 9,00

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

94,4 943,6

% d

e in

hib

icio

n

Cantidad μg

aceite esencial

hidrolato

Varianza agrupada 802,07

Diferencia hipotética de las medias 0,00

Grados de libertad 16,00

Estadístico t -0,35

P(T<=t) una cola 0,36

Valor crítico de t (una cola) 1,74

P(T<=t) dos colas 0,73

Valor crítico de t (dos colas) 2,11

La concentración mínima inhibitoria (CMI) del AE frente a E. coli, se determinó mediante el

método de dilución en caldo, al graficar los datos obtenidos para las diferentes concentraciones

evaluadas en este método se determinó la CMI que corresponde a 283,08 μg/mL a esta

concentración del aceite esencial no se observó crecimiento bacteriano por lo cual este valor

representa la concentración mínima inhibitoria. Los datos de este ensayo se presentan en la

Tabla 10.

Tabla 10.

Evaluación de la CMI del AE de la Peperomia subsphatulata frente a Escherichia coli a 35

°C 24 horas.

Cantidad

( μg/ mL)

Absorbancia

Replica1 Replica2 Replica3 Promedio

Blanco del Caldo 0,021 0,021 0,019 0,020

Control Blanco TSB 1,051 1,053 1,051 1,052

Control + 1,125 1,126 1,125 1,125

Gentamicina + E. coli

10

0,044 0,043 0,045 0,044

Gentamicina + E. coli

20

0,046 0,048 0,045 0,046

Stock AE + E. coli

47,18

1,024 1,029 1,031 1,028

Control positivo (E. coli)1.125, control blanco TSB 1.052, Blanco del Caldo 0.020

Para visualizar más claramente la concentración mínima inhibitoria (CMI) del AE de la especie

Peperomia subspathulata frente a Escherichia coli lo representamos en el sistema de

coordenadas absorbancia Vs. concentración.

Stock AE + E. coli

94,36

0,915 0,914 0,913 0,914

Stock AE+ E. coli

188,72

0,712 0,711 0,712 0,712

Stock AE+ E. coli

283,08

0,454 0,452 0,449 0,452

Stock AE + E. coli

471,80

0,323 0,324 0,323 0,441

Stock AE + E. coli

754,88

0,224 0,225 0,225 0,419

Stock AE + E. coli

943,60

0,197 0,199 0,198 0,409

Stock AE + E. coli

1415,40

0,112 0,111 0,110 0,409

Stock AE + E. coli

1887,20

0,108 0,109 0,107 0,409

Grafica 2. Determinación de la CMI del AE de Peperomia subsphatulata frente a

Escherichia coli a 35 °C 24 horas.

De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad antimicrobiana y de

concentración mínima inhibitoria se puede decir que el AE e hidrolato de Peperomia

subsphatulata no presenta una actividad según los estándares clínicos de laboratorio (Jorgensen,

2012). Estos resultados pueden ser comparados o contrastados con lo que se han reportado para

aceites esenciales de especies de la familia Piperaceae, como por ejemplo el aceite esencial

obtenido de la parte área de la planta Piper auritum obtenido por destilación el cual presenta el

70% de safrol (Fidalgo, et al 2012; Avello, et al., 2012) este mostró una actividad antimicrobiana

moderada frente a E. coli y alta a Plasmodium falciparum.

El AE obtenido de las hojas por destilación de arrastre con vapor de la especie Peperomia

ineaqualifolia (Rivera, et al., 2015) presentó baja inhibición a la bacteria E. coli y alta a

Pseudomonas aeruginosa y en ésta especie se identificaron compuestos como safrol y miristicina

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 500 1000 1500 2000

AB

SOR

BA

NC

IA

CONCENTRACION μg / mL

CMI

como los mayoritarios; la composición de éste AE es muy similar al de la especie en estudio

Peperomia subsphatulata que también no presenta actividad.

De acuerdo con lo anterior, se puede inferir que entre los componentes químicos presentes en el

AE; la principal acción antimicrobiana frente a E. coli se le atribuye a la alta presencia de safrol

(Khayyat, & Al-Zahrani, 2014). El safrol y sus derivados en cepas de distintas bacterias gram-

positivas y negativas reportan un efecto efectivo frente a E. coli. pese a la alta presencia de safrol

y miristicina (Pavlović, et al., 2012; Sadgrove, et al., 2014); la baja actividad del AE en estudio

puede ser explicada por la presencia de otros componentes que induzcan un efecto antagonista en

el AE de la especie Peperomia subspathulata disminuyendo el potencial inhibitorio bacteriano

del safrol y miristicina.

6. Conclusiones

El AE y el hidrolato de la especie Peperomia subsphatulata obtenido por destilación de

arrastre con vapor mostró un mayor contenido de fenilpropanos, sesquiterpenos y

policetidos siendo los más representativos el safrol, α-bisabolol, xantoxilina y miristicina

ya que estos corresponden al 88%.

La identificación tentativa del AE realizada bajo criterios de índice de Kovat’s (IK) y los

espectros de masas de los compuestos individuales (MS) corresponden al primer reporte

de la composición aceite esencial de la especie Peperomia subsphatulata.

Los ensayos de actividad antimicrobiana mostraron que el microorganismo Escherichia

coli presenta resistencia al efecto inhibitorio del aceite esencial de la especie Peperomia

subsphatulata.

Con base a la identificación tentativa la presencia de α-bisabolol (34,56 %), y xantoxilina

(7,45 %), tienen un uso potencial en la industria farmacéutica ya que estas se caracterizan

por presentar propiedades antinflamatorias y antivirales respectivamente.

7. Recomendaciones

Se recomienda realizar la confirmación de los compuestos identificados mediante el uso

de estándares y/o el aislamiento por ejemplo de la xantoxilina que es un compuesto que

por primera vez se identifica en una especie de la familia Piperaceae.

Con base a la composición AE es posible que este tenga actividad antimicrobiana frente a

otros microorganismos, por lo tanto, se recomienda evaluar su actividad frente a otras

bacterias ya que puede ser más efectivo.

8. Bibliografía

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9. Anexos.

9.1. Anexo 1. Espectros de masas de la identificación tentativa de la especie

Peperomia Subsphatulata

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

4 5 0 0

5 0 0 0

5 5 0 0

6 0 0 0

6 5 0 0

7 0 0 0

m / z - ->

A b u n d a n c e

S c a n 9 8 2 (1 5 . 8 6 8 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( -9 4 5 ) ( - )

9 3 . 1

6 9 . 04 1 . 0

7 7 . 05 3 . 0

1 2 1 . 11 0 5 . 0 1 3 6 . 0

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

1 4 0 0

1 6 0 0

1 8 0 0

2 0 0 0

2 2 0 0

2 4 0 0

2 6 0 0

2 8 0 0

3 0 0 0

3 2 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 1 2 7 5 ( 1 7 . 2 6 3 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 1 2 4 6 ) ( - )

6 8 . 1

9 3 . 1

7 9 . 0

1 2 1 . 1

1 3 6 . 1

1 0 7 . 15 3 . 04 1 . 0

1

2 Limoneno

1-β-Mirceno

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

9 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 1 3 4 7 ( 1 7 . 6 0 6 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 1 3 1 5 ) ( - )4 3 . 0

8 1 . 1

1 0 8 . 1

1 5 4 . 1

1 3 9 . 1

6 7 . 0

9 5 . 1

1 2 5 . 1

2 0 6 . 9

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

9 0 0 0

1 0 0 0 0

1 1 0 0 0

1 2 0 0 0

1 3 0 0 0

m / z -->

A b u n d a n c e

S c a n 1 5 1 6 (1 8 .4 1 1 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-1 4 8 4 ) (-)

8 8 .0

9 9 .0

4 3 .0

6 0 .0

7 3 .0

1 1 5 .0

1 5 3 .91 3 1 .0 1 4 4 .0

4

3

Hexanoato de etilo

1,8-Cineol

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

4 5 0 0

5 0 0 0

5 5 0 0

6 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e


8 8 . 0

1 2 7 . 0

5 7 . 0

1 0 9 . 0 1 7 2 . 12 0 7 . 0 2 8 1 . 0

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

1 0 0 0 0

1 2 0 0 0

1 4 0 0 0

1 6 0 0 0

1 8 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 3 5 4 4 ( 2 8 . 0 6 8 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 3 6 0 2 ) ( - )

4 5 . 0

6 9 . 0

9 8 . 1

1 2 9 . 11 9 3 . 0 2 8 0 . 9

6

5

Octanoato de etilo

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0

1 6 0 0 0 0

1 8 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

2 2 0 0 0 0

2 4 0 0 0 0

2 6 0 0 0 0

2 8 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 3 7 0 3 ( 2 8 . 8 2 5 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s

7 1 . 1

9 3 . 1

4 3 . 0

1 2 1 . 1

1 3 9 . 12 0 7 . 01 6 2 . 0 2 8 1 . 0

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

4 0 0 0 0

4 5 0 0 0

5 0 0 0 0

5 5 0 0 0

6 0 0 0 0

6 5 0 0 0

7 0 0 0 0

7 5 0 0 0

8 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 4 1 5 4 ( 3 0 . 9 7 3 m i n ) : C a n e l o n _ 1 . D \ d a t a . m s ( - 4 1 2 6 ) ( - )9 3 . 0

1 3 3 . 0

4 1 . 0

6 9 . 0

1 0 7 . 1

1 2 0 . 1

5 5 . 0

1 6 1 . 1

1 4 7 . 0

1 8 9 . 1

1 7 5 . 1

2 0 4 . 2

7

8 β-Cariofileno

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

1 4 0 0

1 6 0 0

1 8 0 0

2 0 0 0

2 2 0 0

2 4 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

A v e r a g e o f 3 1 . 2 7 3 t o 3 1 . 2 7 8 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )

4 1 . 0

9 1 . 0

6 7 . 0

1 6 1 . 1

1 1 9 . 1

2 0 4 . 2

2 8 1 . 0

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

1 0 0 0 0

1 2 0 0 0

1 4 0 0 0

1 6 0 0 0

1 8 0 0 0

2 0 0 0 0

2 2 0 0 0

2 4 0 0 0

2 6 0 0 0

2 8 0 0 0

3 0 0 0 0

3 2 0 0 0

3 4 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 4 4 8 0 ( 3 2 . 5 2 5 m i n ) : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 4 4 5 4 ) ( - )6 9 . 0

4 1 . 0

9 3 . 0

1 3 3 . 0

1 2 0 . 15 5 . 0

1 6 1 . 1

1 0 7 . 0

2 0 4 . 21 4 8 . 01 8 9 . 1

1 7 5 . 1

10

Aromandendreno

9

E- β-Farneseno

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

4 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e


1 0 5 . 1

2 0 4 . 2

1 2 3 . 1

1 4 8 . 18 1 . 1

4 1 . 1

1 7 5 . 1

6 3 . 02 6 6 . 9

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

4 0 0 0 0

4 5 0 0 0

5 0 0 0 0

5 5 0 0 0

6 0 0 0 0

6 5 0 0 0

7 0 0 0 0

7 5 0 0 0

8 0 0 0 0

8 5 0 0 0

9 0 0 0 0

9 5 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

A v e r a g e o f 3 3 . 1 8 3 t o 3 3 . 1 8 7 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )9 3 . 0

8 0 . 0

1 2 1 . 1

1 4 7 . 14 1 . 0

6 7 . 0 1 0 7 . 1

2 0 4 . 2

1 6 1 . 11 8 9 . 11 3 4 . 0

5 4 . 0 1 7 5 . 1

12

11

α-Humuleno

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 00

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

9 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

A v e r a g e o f 3 3 . 6 4 9 t o 3 3 . 6 5 9 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )5 9 . 0

9 3 . 0

1 2 1 . 1

1 3 6 . 1

4 3 . 0

7 9 . 0

1 0 7 . 1

1 6 3 . 0 1 9 3 . 01 7 7 . 0 2 0 9 . 0

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 4 7 6 0 ( 3 3 . 8 5 9 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 4 7 4 0 ) ( - )

1 0 7 . 1

1 6 1 . 1

4 1 . 1 1 3 5 . 07 9 . 0

1 8 9 . 1

6 1 . 0 2 8 1 . 02 0 7 . 0

14

13 α-Terpineol

Ledeno

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

9 0 0 0

1 0 0 0 0

1 1 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

A v e r a g e o f 3 5 . 0 3 0 t o 3 5 . 0 4 0 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )

1 2 1 . 1

9 3 . 0

4 1 . 0

6 7 . 1

1 6 1 . 1

2 0 4 . 1

1 3 9 . 1

2 8 1 . 0

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00

2 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0 0

1 6 0 0 0 0 0

1 8 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

2 2 0 0 0 0 0

2 4 0 0 0 0 0

2 6 0 0 0 0 0

2 8 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

3 2 0 0 0 0 0

m / z -->

A b u n d a n c e

A v e ra g e o f 3 8 . 9 6 8 t o 3 9 . 0 1 1 m in . : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )1 6 2 . 0

1 0 4 . 0

1 3 1 . 0

7 7 . 0

5 1 . 0

2 0 7 . 0 2 8 2 . 0 3 5 4 . 9

15

16 Safrol

Trans-α-Bisaboleno

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 3400

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

m/ z-->

Abundance

Scan 5952 (39.535 min): Canelon_2.D\ data.ms (-5938) (-)205.1

57.0145.0

177.191.0 115.0355.0281.9

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0

1 6 0 0 0 0

1 8 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

2 2 0 0 0 0

m / z -->

A b u n d a n c e

S c a n 6 5 2 1 (4 2 .2 4 5 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-6 5 5 4 ) (-)

1 7 8 .1

9 1 .1

1 4 7 .0

6 5 .0 1 1 5 .0

4 1 .0

2 0 7 .9 2 6 6 .9

17

18 Metileugenol

Ionol

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

9 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

m / z - ->

A b u n d a n c e

S c a n 6 5 8 5 (4 2 . 5 4 9 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( -6 5 5 9 ) ( - )

6 9 . 0

9 3 . 0

4 1 . 0

1 3 6 . 1

1 6 1 . 1

1 8 9 . 11 1 1 . 12 0 7 . 0 2 8 0 . 9

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

4 5 0 0

5 0 0 0

5 5 0 0

m / z -->

A b u n d a n c e

S c a n 6 8 8 4 (4 3 .9 7 3 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-)4 3 .0

1 0 9 .1

1 6 1 .16 9 .0

1 8 9 .1

1 3 5 .0

2 2 2 .2 3 4 0 .92 8 1 .0

20

19 Trans-Nerolidol

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

9 0 0 0

1 0 0 0 0

1 1 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e


4 3 . 0

9 1 . 0 2 0 5 . 1

1 1 9 . 0

1 5 9 . 1

6 9 . 0

1 8 7 . 1

1 3 7 . 0

2 8 1 . 0

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

m / z -->

A b u n d a n c e

S c a n 7 1 9 0 (4 5 .4 3 0 m in ): C a n e lo n _ 2 .D \ d a ta .m s (-7 1 6 6 ) (-)1 3 1 .0

1 0 3 .0

7 7 .0

1 7 6 .1

5 1 .0

2 0 8 .9 3 5 5 .12 6 6 .9

21

22 Cinamato de etilo

Espatulenol

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

1 0 0 0 0

1 2 0 0 0

1 4 0 0 0

1 6 0 0 0

1 8 0 0 0

2 0 0 0 0

2 2 0 0 0

2 4 0 0 0

m / z - ->

A b u n d a n c e

S c a n 7 2 1 2 (4 5 . 5 3 5 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( -7 1 9 9 ) ( - )1 4 3 . 0

4 3 . 0

8 5 . 0

1 2 1 . 1

1 7 9 . 1

2 2 0 . 1

2 8 1 . 9 3 4 0 . 9

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 3400

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

m/ z-->

Abundance

Average of 45.726 to 45.764 min.: Canelon_2.D\ data.ms (-)59.0

82.1

107.1149.1

189.1222.2

266.9 340.9

24

23

oxido de α-bisabolol β

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 00

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

1 0 0 0 0

1 2 0 0 0

1 4 0 0 0

1 6 0 0 0

1 8 0 0 0

2 0 0 0 0

2 2 0 0 0

2 4 0 0 0

2 6 0 0 0

2 8 0 0 0

3 0 0 0 0

3 2 0 0 0

3 4 0 0 0

3 6 0 0 0

3 8 0 0 0

4 0 0 0 0

4 2 0 0 0

4 4 0 0 0

4 6 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

A v e r a g e o f 4 6 . 1 2 1 t o 4 6 . 1 6 4 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )1 6 4 . 1

7 7 . 01 4 9 . 0

1 0 3 . 0

1 3 1 . 0

5 5 . 0

1 8 9 . 12 0 4 . 2

2 2 2 . 1

3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 00

2 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0 0

1 6 0 0 0 0 0

1 8 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

2 2 0 0 0 0 0

2 4 0 0 0 0 0

2 6 0 0 0 0 0

2 8 0 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

A v e r a g e o f 4 7 . 1 1 1 t o 4 7 . 1 3 0 m i n . : C a n e l o n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - )1 0 9 . 1

6 9 . 1

4 3 . 0

9 3 . 0

2 0 4 . 2

1 6 1 . 11 3 4 . 1

1 8 9 . 1

2 2 2 . 2 2 4 8 . 9

25

26 α-Bisabolol

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

9 0 0 0

1 0 0 0 0

1 1 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e


5 9 . 0

1 4 9 . 1

1 8 9 . 1

9 1 . 0

1 2 3 . 0

2 2 2 . 2

2 6 4 . 9 2 8 3 . 0

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 00

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

9 0 0 0

1 0 0 0 0

1 1 0 0 0

m / z -->

A b u n d a n c e

S c a n 7 6 6 5 (4 7 . 6 9 2 m in ): C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s (-7 6 4 7 ) (-)5 9 . 0

1 4 9 . 0

1 0 8 . 1

8 2 . 0

1 8 9 . 12 2 2 . 1

2 4 8 . 9 3 4 1 . 02 8 3 . 0

27

28

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

4 5 0 0

5 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e


6 9 . 14 1 . 1

9 3 . 0

1 2 1 . 1

1 8 7 . 1

2 4 3 . 1

1 6 1 . 1

2 2 2 . 12 8 1 . 0

1 3 9 . 9

4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 00

1 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 7 8 3 6 ( 4 8 . 5 0 7 m in ) : C a n e lo n _ 2 . D \ d a t a . m s ( - 7 8 1 8 ) ( - )1 9 2 . 1

9 1 . 0

1 6 5 . 01 1 9 . 0

6 5 . 0

1 4 7 . 0

5 0 . 0

2 0 7 . 9

29

30 Miristicina

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0

0

1 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0 0

1 3 0 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0 0

1 6 0 0 0 0 0

1 7 0 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e


1 8 1 . 0

9 5 . 04 3 . 01 3 8 . 0

2 0 8 . 0 2 8 1 . 0 4 1 4 . 92 4 9 . 9 3 5 5 . 03 2 7 . 0

31 XANTOXILINA

9.2. Anexo 2. Actividad antimicrobiana con las diferentes concentraciones del AE

frente a E. coli

6,8mm

8,1mm

13,6mm 10,7mm

19,7mm

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