Cinetica Inmovilizacion de Enzimas
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8/13/2019 Cinetica Inmovilizacion de Enzimas
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INSTITUTO TECNOLGICO DEMRIDA
ING. BIOQUMICA
CINTICA QUMICA Y BIOLGICA
Q.F.B. GERARDO RIVERA MUOZ3.7 SISTEMAS CON ENZIMAS
INMOVILIZADAS
INTEGRANTES:AZUETA MATA CIELOKU PUC LIDIA
SNCHEZ CUPUL LENNY19/01/2014
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CONTENIDO
3.7.1 Mtodos de inmovilizacin.
3.7.2 Velocidad de reaccin en sistemas con enzimasinmovilizadas.
3.7.2.1 Efecto de la inmovilizacin sobre la actividadcataltica.
3.7.2.2 Limitaciones difusionales en sistemas conenzimas inmovilizadas.
3.7.2.3 Efecto alostrico y electrosttico en sistemas conenzimas inmovilizadas.
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INTRODUCCIN
La inmovilizacin de las enzimaspermite una mejora significativa de suestabilidad, lo que hace posible su
empleo en la produccin industrial deproductos qumicos, farmacuticos yde alimentos; en el tratamiento de
residuos; en el diagnstico ytratamiento de enfermedades, y otrasmuchas aplicaciones.
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3.7 SISTEMAS CON ENZIMASINMOVILIZADAS
Los biocatalizadores inmovilizados sonenzimas, clulas u organelos (o
combinacin de ellos) confinados olocalizados en cierta regin definida delespacio, con retencin de su actividadcataltica y, si es necesario, de su
viabilidad, y que pueden ser usados demodo repetido y continuo.
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VENTAJAS DEL EMPLEO DEENZIMAS INMOVILIZADAS
1.- Se produce un gran aumento de laestabilidad de la enzima o clulainmovilizada.
2.- Se aumenta de gran manera laproductividad enzimtica por la capacidad dereutilizacin.
3.- Se aumenta la facilidad de recuperacin ypurificacin de los productos.
4.- Se puede elegir entre una gran variedadde diseos ingenieriles
5.- Se aumenta la facilidad de operacin y
control del proceso, al trabajar encondiciones ms suaves19/01/2014
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DESVENTAJAS DEL EMPLEODE ENZIMAS INMOVILIZADAS 1.- Generalmente,
se disminuye laactividad enzimtica.
2.- Se aumentan losproblemasdifusionales.
3.- El biocatalizador
es mas caro que laenzima nativa.
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3.7.1 MTODOS DEINMOVILIZACIN
En general, los mtodos deinmovilizacin se suelen clasificar endos grandes categoras:
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AtrapamientoRetencin
Fsica Inclusin en Microencapsulacion
membranas Reactores demembrana
Mtodos
De
Inmovilizacin Unin Absorcin Inica
a
Unin Soporte Unin covalente
Qumica
Reticulado
o Entre- Co-reticulado
cruzamiento19/01/2014
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M TODO DE INMOVILIZACI NDE ENZIMAS POR RETENCIN
FSICAAtrapamiento.Consiste en la retencin fsica de la enzimaen las cavidades interiores de una matrizslida porosa constituida generalmentepor prepolmeros fotoentrucruza-bles opolmeros del tipo poliacrilamida,
colgeno, alginato, carraginato o resinasde poliuretano.
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CONTINUACINATRAPAMIENTO El atrapamiento puede ser en geles o
en fibras, que suelen ser msresistentes que los geles.
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Es de gran sencillez desde el puntode vista experimental
Como ventaja adicional, la enzima nosufre ninguna alteracin en suestructura.
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RETENCIN FSICA MEDIANTE ELUSO DE MEMBRANAS
Se divide en dos tipos
Microencapsulacin
Reactores de membranas
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INCLUSIN EN MEMBRANAS
MicroencapsulacinEn esta tcnica, las enzimas estn
rodeadas de membranas
semipermeables que permiten el pasode molculas de sustrato y producto,pero no de enzima.
Las microcpsulas obtenidas son deforma esfrica, con tamaoscomprendidos entre 1 y 100 mm de
dimetro. 19/01/2014
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Reactores de membranasLos reactores emplean membranas
permeables al producto final,permeables o no al sustrato inicial yobviamente impermeables a laenzima. Mediante una bomba se
establece un flujo lquido de sustratoque atraviesa el reactor.
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Esta adsorcin se puede realizar de dosformas:
1.Mediante el paso de una solucintamponada de enzima a travs de lamembrana;
2. Por contacto continuo de una solucinde enzima con la membrana.
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METODO VENTAJAS DESVENTAJAS
MEMBRANAS Simplicidad. Problemas difusionales debidosa la membrana.
Posibilidad de uso simultneo devarios enzimas.
Posible inactivacin de enzimas,sometidos a fuerzas de
cizalla elevadas.
Uso de membranas selectivas:control de sustratos/productos
en mezclas.
Mal funcionamiento a bajasconcentraciones de sustrato
(adsorcin de ste en lamembrana)
Proteccin del enzima anteinhibicin, envenenamiento
Estricto control del tiempo deresidencia para sustratos de
bajo peso molecular.
No hay prdidas.
Adecuado para sustratos de altopeso molecular, buen contacto
enzima-sustrato: altasconversiones.
M TODO DE INMOVILIZACI N
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M TODO DE INMOVILIZACI NDE ENZIMAS POR UNIN
QUMICAUnin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin
ms utilizados y de los que se disponede una mayor informacin.
Se debe procurar que lainmovilizacin incremente la afinidadpor el sustrato, disminuya lainhibicin, ample el intervalo de pHptimo y reduzca las posibles
contaminaciones microbianas.19/01/2014
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La eleccin del soporte y del tipo de enlaceresultan determinantes en el comportamientoposterior del biocatalizador.
Los soportes pueden clasificarse en dos
grandes grupos: 1. Soportes inorgnicos. Dentro de este
grupo tenemos una gran variedad desoportes, que pueden ser naturaleso
materialesmanufacturados 2. Soportes orgnicos. Se pueden clasificar
en: Po lmeros natu rales: a su vez divididosen:polisacridos y en protenas fibrosas
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UNIN A SOPORTE
Las enzimas se pueden unir a estossoportes mediante :
Adsorcin Inica
Unin covalente
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UNIN A SOPORTE PORADSORCIN
En la adsorcin, la enzima se une a unsoporte sin funcionalizar medianteinteracciones inicas,
fuerzas de Van der Waals y por puentesde hidrgeno. Los principales factoresque influyen en la adsorcin, son:
El pH medio
La fuerza inicaEl dimetro de poroLa presencia de iones
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UNIN A SOPORTE: UNINCOVALENTE
Formacin deenlaces covalentesentre enzima ysoporte, mucho msfuertes que en laadsorcin.
La unin covalente
debe afectar agrupos funcionalesdel enzima que nointervengan en elproceso cataltico.
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Mtodos Ventajas Inconvenientes
ADSORCIN Los centros activospermaneceninalterados.
Posible desorcin deenzimas
por cambios en pH,
temperaturaNo se requieren
reactivos y las etapasde activacin son
sencillas
Mtodos no especficospara
cada reaccin/enzima
Mtodo sencillo yeconmico.UNINCOVALENTE
Estabilidad del enzima. Nose desliga.
Mtodo caro y complicado.
Mtodo muy flexible,segn se elija el agenteportador y mtodo de
enlace.
La actividad puede
reducirse si losreactivos usados sontxicos para el enzima.
Los centros activos puedenmodificarse/daarse
durante el proceso.19/01/2014
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UNIN QUMICA :RETICULADO
Tambindenominadoentrecruzamiento o
cross-linking. El mtodo consiste
en uso de reactivosbifuncionales que
originan unionesintermolecularesentre las molculasde enzima
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El resultado del reticulado sonenzimas con enlaces intermolecularesirreversibles capaces de resistir
condiciones extremas de pH ytemperatura.
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mtodo ventajas inconveniente
ENTRECRUZAMIENTOEnzima muy estable,
fuertementeenlazado.
Puede daar los centrosactivos.
Puede usarse encombinacin
con la adsorcin paraprevenir prdida de
catalizador.
Puede haber problemasdifusionales que limiten
el rendimiento.
Prdida de enzimadurante preparacin.
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UNIN QUMICA: CO-RETICULADO
Consiste eninmovilizar la enzimapor adsorcin sobre
una resina deintercambio inico oun soporte polimrico(con lo que se
consigue unaelevada cargaenzimtica) yposteriormente
aadir el reactivo19/01/2014
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3.7.2 VELOCIDAD DE
REACCIN EN SISTEMAS CONENZIMAS INMOVILIZADAS
3.7.2.1 EFECTO DE LAINMOVILIZACION SOBRE LA
ACTIVIDAD CATALITICA
3 7 2 1 EFECTO DE LA
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3.7.2.1 EFECTO DE LAINMOVILIZACION SOBRE LA
ACTIVIDAD CATALITICA Altera significativamente el comportamiento de las
enzimas.
Se producen cambios en su estabilidad.
La enzima inmovilizada es un sistema heterogneoen el cual todos los componentes que intervienen enel proceso cataltico se encuentran en interfase: en el
medio de reaccin y en la fase constituida por elsoporte con la enzima.
Como consecuencia, la actividad enzimtica se veafectada por efectos de tipo difusional, estrico y del
microentorno. 19/01/2014
3 7 2 1 EFECTO DE LA
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3.7.2.1 EFECTO DE LAINMOVILIZACIN SOBRE LA
ACTIVIDAD CATALTICA.La actividad enzimtica puede disminuir eincluso perderse. Si se pierde totalmentepuede ser debido:
1. La unin al soporte se produce de tal formaque el paso del sustrato al centro activo estimpedido.
2. Los grupos reactivos del soporte reaccionancon algn aminocido que forme parte delcentro activo o que sea esencial para laactividad cataltica de la enzima.
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3. Cuando se pueda originar un cambioconformacional que da lugar a una formainactiva.
4. Las condiciones experimentales causan ladesnaturalizacin o desactivacin de laenzima.
Si la prdida de actividad no es total loscambios se debern principalmente efectos :
difusionales, electrostticos, estricos y/o del19/01/2014
3 7 2 2 LIMITACIONES
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3.7.2.2 LIMITACIONESDIFUSIONALES EN SISTEMAS CONENZIMAS INMOVILIZADAS. La difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima
puede estar impedida por resistencias de tipo :externo einterno.
a) resistenc ias difu sion ales externas:
Si el soporte es insoluble en el medio de reaccin, el sustratodeber atravesar la pelcula lquida estacionaria que rodea elsoporte.
En las proximidades de un soporte no cargado, laconcentracin de sustrato es menor que en el resto de ladisolucin.
Los valores de km para las enzimas inmovilizadas sonsiempre aparentes (km).
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3.7.2.2 LIMITACIONESDIFUSIONALES EN SISTEMAS CONENZIMAS INMOVILIZADASb) res is tenc ias d i fus ionales in ternas:
Debida a que los sustratos tienen que atravesar elinterior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte
donde se encuentra la enzima inmovilizada.
Diversas maneras de minimizar estos efectosdifusionales como:
disminuir el tamao del biocatalizador, aumentar la
concentracin de sustrato, incrementar la agitacin o elflujo en el reactor, etc.
Se consigue reducir el grosor de la capa de Nernst, ycomo consecuencia, el valor de km disminuye.
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3 7 2 3 EFECTO ALOST RICO Y
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3.7.2.3 EFECTO ALOST RICO YELECTROSTTICO EN SISTEMAS
CON ENZIMAS INMOVILIZADAS. Efectos electrostticosentre el sustrato y elsoporte Si tienen la misma carga existe una repulsin
mutua, mientras que si las cargas son opuestashay atraccin.
Cuando tienen cargas opuestas, el valor de kmaparente puede verse reducido hasta variasveces por debajo del obtenido en disolucin.
Hornby y cols. desarrollaron una expresinmatemtica que permite calcular la actividad de
las enzimas inmovilizadas.19/01/2014
3 7 2 3 EFECTO ALOSTRICO Y
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3.7.2.3 EFECTO ALOSTRICO YELECTROSTTICO EN SISTEMAS
CON ENZIMAS INMOVILIZADAS. La expresin de Michaelis-Menten en estecaso es:
donde x=espesor de la capa de Nernst;D=coeficiente de difusin;
T=temperatura (K); z=valencia del sustrato; F=constante de Faraday; R=constante universal de los gases V=gradiente de potencial en el soporte.19/01/2014
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APLICACIONES DE LA ENZIMASINMOVILIZADAS
Las aplicaciones ms importantes delas enzimas inmovilizadas se puedenclasificar en:
1. Aplicaciones analticas:biosensores
2. Aplicaciones mdicas: tratamientos
con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la
industria qumica, farmacutica,
alimentaria y de tratamiento de19/01/2014
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BIOSENSORES
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OBTENCIN DEANTIINFLAMATORIOS
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TRATAMIENTO DERESIDUOS
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BIBLIOGRAFA
- Inmovilizacin de enzimas, Prof.J.M.Snchez-Montero, Grupo deBiotransformaciones, Departamento deQumica Orgnica y Farmacutica. Fac.
Farmacia- Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos,
mtodos y aplicaciones, DR. MIGUELARROYO, Departamento de Bioqumica yBiologa Molecular I Facultad de CienciasBiolgicas, Universidad Complutense deMadrid 28040 Madrid