1. INTRODUCCIÓN

La superficie plantada con cerezos en Chile ha experimentado un fuerte

aumento en los últimos años, al variar de 2.653 hectáreas en 1994 a 6.020

hectáreas el 2001 y 7.200 hectáreas al 2004, con producciones que superan

las 32.000 toneladas (ODEPA, 2005).

Este crecimiento se ha ido generando debido al aumento en tierras

cultivadas con este frutal, las cuales se han realizado en algunas zonas que

anteriormente eran poco tradicionales para el desarrollo de este cultivo,

como la IV, VIII, IX y XI regiones, obteniéndose resultados promisorios en

cuanto a producción. Junto con esto, las regiones tradicionalmente

productoras como la VII región, han realizado notorios incrementos en

superficie (FIA, 2003).

El aumento de plantaciones se ha debido a diversos factores, dentro de los

que se destaca, un buen resultado obtenido en las exportaciones, y también

la introducción de nuevas variedades que permiten alcanzar mayor

precocidad, menor requerimiento de frío y resistencia a partidura de frutos

por lluvias, características que mejoran la calidad y cantidad de fruta para

cosecha, y una ampliación en el período de oferta de esta fruta (FIA, 2003).

Dentro de las principales regiones productoras, la VII es la región líder, con

una superficie de 3.184,5 hectáreas al 2002 (ODEPA, 2005).

Por esto, se ha debido incrementar el estudio en nuestro país de las plagas y

enfermedades que atacan a este frutal, los que afectan en forma directa la

2

cantidad y la calidad de fruta cosechada, haciendo disminuir los ingresos a

los productores. Entre estas enfermedades, destacan los virus, los cuales no

siempre son fáciles de detectar, y que son una de las causales más

importantes de pérdida en la producción de cerezas tanto en Chile como en

el mundo (WEBSTER, 1996).

Existe una amplia variedad de virus descritos para cerezos y guindos en todo

el mundo, los cuales varían en su importancia económica sobre el

hospedero, así como también en sus características epidemiológicas, la

forma de transmisión (material de injertos, polen, semillas, inóculos

artificiales, nemátodos y otros vectores), propiedades físico-químicas y en su

especificidad serológica.

A nivel mundial, se han descrito variados reportes sobre huertos afectados

con virus, los que van desde zonas europeas (Gran Bretaña), Estados

Unidos (Idaho, Montana, Oregon, Washington, etc.), Canadá y Latinoamérica

(Argentina, Chile) (MINK, JONES; 1996), donde no solamente se han

descrito en cerezos, sino que también en durazneros, nectarinos, nogales y

ciruelos (WOOD, 1996; WOOD, TATE, MANKTELLOW, MORTON, KALE.,

1997;; DAL ZOTTO, NOME, Di RIENZO, DOCAMPO, 1999; HERRERA y

MADARIAGA, 2002).

En Chile, se han efectuado estudios a través de organizaciones tanto

estatales como privadas, donde se han desarrollado muestreos sobre la

incidencia de enfermedades provocadas por virus en viveros (HERRERA Y

MADARIAGA, 2002), con fuerte importancia de Prunus necrotic ringspot virus

y Prune dwarf virus y en huertos (MILLET, 1991; MATTÍA, 2001), realizando

diagnósticos y prospecciones de enfermedades virales en la VI y VII

3

regiones, las cuales incluyen no sólo al cerezo, sino que a todos los Prunus,

especialmente en el caso de los virus anteriormente señalados. A través de

los años, se han desarrollado muchos estudios sobre la implicancia que los

virus poseen en la reducción de la producción que desarrollan plantas

infectadas, obteniéndose datos de entre un 10% y 75% de pérdida

productiva, esto acompañado de un menor tamaño de las plantas y de una

reducción del área foliar. Esta situación se complica cuando la infección es

mixta (SCOTT et al., 2001).

El método tradicionalmente empleado para la detección de virus es el uso de

pruebas biológicas, mediante el empleo de plantas herbáceas y/o leñosas,

en donde al inocular tejidos aparentemente contaminados en las plantas

indicadoras, éstas expresarán los síntomas de la enfermedad,

comprobándose la existencia del patógeno.

Otra forma de detectar la presencia de virus en cerezos, es mediante la

realización de pruebas serólogicas, específicamente con el método de

ELISA-DAS, con el cual se detecta el virus, si éste se encuentra en la planta.

La sintomatología que se muestra en plantas que ven su rendimiento

afectado en forma creciente, con anomalías tanto físicas como biológicas

visibles, y la necesidad de hallar los posibles causantes de estos problemas,

han hecho a la ciencia investigar de diferentes formas la incidencia de virus

en estas plantas. Actualmente, la forma más común de estudiar síntomas

asociados a virosis en plantas de cerezo, incluso en infecciones mixtas es la

realización de pruebas biológicas y no así de forma serológica, que puede

ser, si bien un poco más lenta, útil en demostrar fehacientemente la

presencia de un virus.

4

La utilización de pruebas biológicas y serológicas conjuntamente en el

análisis de plantas de cerezo con síntomas asociados a virosis, puede

presentar una alta utilidad en el hallazgo de éstos patógenos, ya que se

obtiene una mayor seguridad y se disminuye la incertidumbre a la hora de

emitir un diagnóstico al contar con ambas técnicas en forma paralela.

Los objetivos principales de la investigación fueron: Analizar en diferentes

huertos de cerezos, plantas con síntomas de estar afectadas por virus,

determinando la presencia de éstos en las plantas, determinar la presencia

de virus en muestras seropositivas, mediante el empleo de prueba biológica

con porta injerto GF 305. Además, se contempló la conservación de éstos

aislados en plantas leñosas.

5

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Antecedentes del cerezo: 2.1.1. Clasificación botánica

Prunus es un nombre nativo del ciruelo silvestre y avium proviene del latín

que significa "de los pájaros", aludiendo al consumo de sus frutos por éstos.

El cerezo (Prunus avium L. (P. silvestris Ray o Cerasus avium L. (Moench)))

pertenece al orden Rosales, familia de las Rosáceas, de la cual también

proceden la mayoría de los frutales de carozo. Presenta flores blancas, las

cuales se presentan en grupos de cuatro o cinco en yemas sobre madera de

un año de edad, y sobre dardos, en yemas agrupadas alrededor de una

yema vegetativa sobre madera de dos años o más. Los frutos formados son

drupas de colores rojos a negros, de forma redondeada y de tamaño

pequeño, llegando su diámetro a los dos centímetros aproximadamente. Las

hojas son largas, de borde aserrado y con glándulas aparentemente

nectarias, cercanas a la lámina (WEBSTER, 1996).

2.1.2. Ubicación geográfica de origen

Se dice que el cerezo es originario de la zona asiática, más específicamente

del norte de Irán, Ucrania, en el Mar Negro y Mar Caspio, y otros lugares

cercanos a las montañas caucásicas. Según WEBSTER (1996), también es

nativo de algunas zonas de Europa, en lugares cercanos a Suecia, Grecia,

España e Italia, lugares donde comenzó a dispersarse mediante el traslado

6

de pájaros, que al comer sus frutos, depositaban las semillas en otros

lugares, junto a sus fecas, lo que le aportaba además una buena fertilización.

El hecho de que este frutal se encuentre en tantos lugares y climas distintos,

muestra su amplia adaptabilidad climática y edáfica, siendo siempre dentro

de los rangos de climas templados (MEDEL, 1998; WEBSTER, 1996).

2.1.3. Otras especies asociadas

Existen otras especies dentro del grupo “cherries”, entre las que destacan el

guindo ácido (Prunus cerasus L.), el cual también es utilizado para

producción de frutos, pero en menor medida que el cerezo dulce, el cerezo

de flor o Mahaleb (Prunus mahaleb L.), el cual se ha utilizado por su madera,

su aroma en flor y además por su popular función de portainjerto tanto de

cerezos como de guindos, Prunus tomentosa, Prunus pseudocerasus,

Prunus pumila, Prunus fruticosa, los cuales han sido multiplicados

principalmente por sus características ornamentales, entre otros (WEBSTER,

1996).

2.1.4. Enfermedades que afectan al cerezo presentes en Chile

El cerezo en Chile es hospedero de una amplia gama de patógenos, los

cuales causan distintas sintomatologías y problemas. Su importancia, radica

en el efecto que tengan sobre la producción y que se pueda traducir en

mermas económicas.

Los agentes infecciosos que causan enfermedades en el cultivo del cerezo

son: hongos, bacterias y virus. Dentro de las enfermedades fungosas

7

destacan: tizón de la flor (Monilinia laxa), corazón negro (Verticillium dahliae,

Kled), pudrición gris (Botrytis cinerea), pudrición del cuello (Phythopthora

cactorum), plateado (Chondostereum purpureum), entre otras. Entre las de

origen bacterial destacan dos que son: Agallas del cuello (Agrobacterium

tumefaciens) y el cáncer bacterial (Pseudomonas syringae pv. syringae).

Todas estas enfermedades tienen algún grado de control, ya sea mediante el

uso de diversas prácticas culturales de manejo y/o productos químicos. En

cambio, los virus no se pueden controlar una vez establecidos en el huerto.

Entre los más citados que afectan a este frutal destacan: Prunus necrotic

ringspot virus (PNRSV) o anillado necrótico de los Prunus, Prune dwarf virus

(PDV) o enanismo de los Prunus, Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV),

Cherry leaf roll virus (CLRV) y Tomato ringspot virus (TomRSV), y otros

menos comunes como Cherry rasp leaf virus, Cherry necrotic rusty mottle

virus, Cherry short stem virus, Little cherry virus y Green ring mottle virus

(SÁNCHEZ, 2000, VALENZUELA, 1998).

Existen otras enfermedades que afectan al cerezo, pero que no han sido

descritas en Chile, como por ejemplo, el mildiú polvoriento (Podosphaera

clandestina L.), cloca del cerezo (Taphrina cerasi S.), Little cherry virus,

cáncer negro del cerezo, entre otros (GROVE, 1995; HANSEN, 1995;

PSCHEIDT, 1995; WATERWORTH, 1995).

8

2.2. Prunus necrotic ringspot virus:

2.2.1. Características del agente causal

El virus del anillado clorótico, o mancha anular de los Prunus pertenece al

grupo de los Ilarvirus. Varía desde formas isométricas a otras baciliformes,

con radios axiales entre 1,0 a 1,5 nm. Algunos aislados tienen partículas

baciliformes de más de 70 nm de largo. Está compuesto por una hebra

simple de RNA de entre 0,3 a 1,3x106 Da (MINK, 1995). Esta enfermedad se

encuentra ampliamente distribuida entre las especies del género Prunus,

debido a su facilidad para dispersarse en condiciones de campo. En Chile,

este virus fue identificado mediante análisis serológico (ELISA) en el año

1987, en huertos comerciales de duraznos (ASCUI y ALVAREZ, 1988).

Es un virus extensamente distribuido y además uno de los virus

económicamente más importante de los Prunus. El daño depende de la

severidad de ataque en la planta, la variedad cultivada, la agresividad o

virulencia del virus, y de las condiciones ambientales.

Según un estudio realizado por HERRERA Y MADARIAGA (2002), en

viveros de la zona central, de un total de 1510 plantas sintomáticas testeadas

de cerezos, el 10,9% de ellas presentó el virus. Recientemente, HERRERA y

MADARIAGA (2002), demostraron que PNRSV es uno de los virus comunes

a nivel de viveros y sus rangos de infección en material de propagación

fluctuaron entre 3% y 29%. Aún mayores fueron los niveles de infección

encontrados por SANCHEZ, HEPP y VENEGAS (2000) en cerezos de la VII

región, donde en promedio se identificó el virus en el 48% de las muestras.

En ensayos realizados en Estados Unidos, las pérdidas por este virus incluso

9

han llegado a ser del orden de 3,75 toneladas menos por hectárea

(HERRERA, 1993).

2.2.2. Sintomatología

El daño de la infección por PNRSV se puede manifestar como muerte de

brotes y raíces, crecimiento reducido en árboles jóvenes (DAL ZOTTO,

NOME, DI RENZO, DOCAMPO, 1999).

Los síntomas que genera este virus, se pueden comparar al producido por un

hongo, Wilsonomyces carpophillus (Coryneum beijerinckii), que produce tiro

de munición en los frutales de carozo. Se diferencian que en este caso las

manchas necróticas están rodeadas por un halo rojizo, y estas aparecen en

las hojas, en ramillas, flores y frutos. Este tejido necrosado cae y deja a la

lámina con signos de perforación (LATORRE, 2004). También debe

diferenciarse del ataque de una bacteria ausente en Chile, Pseudomonas

morsprunorum la cual induce síntomas parecidos a los causados por

PNRSV, pero las manchas que presenta la lámina son aún más irregulares

(INIA, 2005).

En general, PNRSV se manifiesta con clorosis, necrosis, deformaciones, y

cierto grado de enanismo. Los síntomas se expresan uno o dos años

después de la infección. En los años siguientes, la planta puede o no mostrar

la sintomatología. Se caracteriza por producir en las hojas recién emergidas

anillos o manchas cloróticas difusas o intenso anillado necrótico, que da un

aspecto aperdigonado, dejando a las hojas sólo con nervaduras. Causa un

retardo de la inducción de yemas, muerte de ramillas de la estación anterior y

cancros en la corteza.

10

Según datos del INIA (2005), las pruebas biológicas realizadas a plantas

indicadoras del género Prunus muy susceptibles al virus, muestran dentro de

las cuatro a cinco semanas una excesiva cantidad de gomosis y muerte del

floema y xilema de las plantas.

2.2.3 Transmisión

El virus presenta a lo menos tres vías de diseminación en condiciones de

campo; polen, semillas y material de propagación. Esta característica la

constituye en una de las enfermedades virosas más comunes de los viveros

de frutales de carozo. En la mayoría de las especies de Prunus presentan un

grado de susceptibilidad a uno o más aislamientos. Se transmite

artificialmente mediante transmisión mecánica a plantas de las familias

Cucurbitáceas y Chenopodáceas.

La longevidad máxima que este virus puede tener in vitro es de seis a

dieciocho horas, y su punto de inactivación termal varía en un rango de 55°C

a 62°C (NEMETH, 1986).

Según STEIN et al. (1991), en trabajos realizados con Prunus domestica, la

mejor inhibición de PNRSV se obtiene con termoterapia, mediante la

aplicación por 18 días de temperaturas de 38°C por 16 horas a la luz

alternando con 28°C por ocho horas en oscuridad. Esta combinación fue

aplicada en la variedad Hermosa, obteniéndose un 90% de los brotes libres

de virus. MANGANARIS et al. (2003) se refiere a la eliminación de este virus

y de PPV utilizando termoterapia y cultivo de meristemas apicales en

nectarinos, aplicando durante tres semanas una temperatura máxima de

35ºC, lo que además facilita el crecimiento de los meristemas. Estos

11

tratamientos también están siendo utilizados en la actualidad en cerezos y

guindos.

2.3. Prune dwarf virus:

2.3.1. Características del agente causal

El virus del enanismo del ciruelo, o simplemente enanismo, que es conocido

también en cerezos como "yellow leaf" o "physiological leaf drop”, pertenece

al grupo de los Ilarvirus. Son partículas isométricas de 19-20 nm de diámetro

hasta pequeños baciliformes de más de 73 nm de largo. Están compuestos

por RNA, el cual presumiblemente es de hebra simple (MINK, 1995). La

intensidad de esta enfermedad depende de la variedad, de la raza, de la

temperatura y de la edad de la planta (DAL ZOTTO, 1999). Según HERRERA (2002), un 9,0% de las plantas testeadas en distintos

viveros de Chile central presentaron esta enfermedad.

2.3.2. Sintomatología

Este virus genera una marcada diferencia en el crecimiento de plantas en

huertos comerciales, a diferencia de las plantas sanas, disminuyendo

además el rendimiento. Generalmente, presenta efectos sinérgicos con otros

virus, como los pertenecientes al grupo de los Nepovirus e Ilarvirus,

conformando una enfermedad denominada “Peach stunt disease” al

encontrarse junto a PNRSV, el cual tambén pertenece a éste último grupo

(INTA, 2005).

12

Referencias del INIA (2005) en cerezos y guindos, indican que la enfermedad

se ha caracterizado por tener dos fases; en donde la primera es de infección

severa, ocurriendo uno o dos años después de la infección, y la segunda o

fase crónica, la cual se presenta en los años siguientes. En la infección

severa, las áreas cloróticas del tejido de las hojas son necrosadas dejando

posteriormente un orificio. En los años siguientes la enfermedad entra en su

fase crónica, mostrando síntomas sólo en algunos años y ellos son similares

a los de la fase severa.

DIEKMANN y PUTTER (FAO, 1996), señalan que Prune dwarf virus provoca

en cerezos una marca clorótica y anillos del follaje. Generalmente, las

variedades cultivadas de Prunus salicina y de híbridos de Prunus domestica

así como los portainjertos de cerezo "Mazzard" y Prunus mahaleb, y algunas

variedades de cerezo dulce, presentan la enfermedad, pero en forma

asintomática.

2.3.3. Transmisión

Junto a Prunus necrotic ringspot virus, conforman un grupo de presencia

común en los viveros, esto debido a que su forma de transmisión se produce

mediante el material de injertación, además de semillas y polen, lo que

convierte a los insectos polinizadores en vectores indirectos del virus, por el

hecho de transportar polen de plantas enfermas a otras sanas.

2.3.4. Efectos en diferentes portainjertos

Los portainjertos testeados en campo, dieron como resultado que tanto Colt,

Edabriz, Gisela 6, Gisela 5, Gisela 12, Damil, Maxma 14, Maxma 60, Maxma

13

2, entre otros, poseen cierta tolerancia al PDV, PNRSV y/o su asociación.

Además de éstos, hoy en día existen nuevos patrones como Gisela 3, el cual

también ha sido descrito como tolerante a los Ilarvirus PNRSV y PDV

(FRANKEN-BEMBENEK, 2003; INTA, 2005).

Estudios realizados por LANKES (2003) demuestran que si existe una cierta

respuesta de algunos clones de portainjertos de Prunus, entre los que se

encontraron que: Colt, F 12/1, Gisela 5, Piku 1, Piku 3 y Piku 4, manifiestan

una mejor tolerancia que Gisela 6 y VVa-1, los que fueron clasificados como

parcialmente sensibles; y VSL-2, que fue catalogado como hipersensible al

virus, incluyendo la variación que se presenta entre el injerto y el patrón.

Las pérdidas por rendimiento pueden llegar a cifras de 30 a un 40% (SCOTT

et al., 2000).

2.4. Tomato ringspot virus: 2.4.1. Características del agente causal

Es el virus del anillo del tomate o conocido también como causante de la

enfermedad línea negra (LATORRE, 2004), el cual pertenece al grupo de los

Nepovirus. Posee un genoma bipartito de RNA con un peso molecular entre

2,05 a 2,17 x106 Da. Posee forma esférica con 28 nm de diámetro y una

coraza proteica compuesta por unidades polipéptidas simples (GONSALVES,

D., 1995).

En Chile se identificó por primera vez al ToRSV en 1987 (AUGER y

ESTEREO, 1987; INTA, 2005), aunque las plantas afectadas habían sido

14

observadas desde 1984. Según HERRERA (2002), de las 1510 plantas de

cerezos analizadas en diferentes viveros de la zona central de Chile, de

forma al azar, un 8,7% de estas se encontraba infectada con este Nepovirus.

Se reconocen varios nombres de éste virus, dependiendo de la

sintomatología que las plantas presenten, y de la combinación de patrón y

variedad. Destacan: Brown line, Peach yellow bud mosaic y Prune stem

pitting, entre otros (GONSALVES, 1995).

2.4.2. Sintomatología

Los cerezos afectados se caracterizan por sus ramas con apariencia

desvestida, sin hojas, la cual comienza en las porciones mas bajas del árbol

avanzando lentamente hacia arriba. La enfermedad mata los ramilletes o

dardos, brindillas y pequeñas ramas. Las hojas sobre las ramas afectadas

son más pequeñas con nervaduras secundarias algo blanquecinas y lámina

clorótica. Según DAL ZOTTO (1999), el tamaño de los frutos tiende a ser

menor con adelantamiento de la madurez y bajo sabor, disminuyendo así la

producción.

Los rendimientos comienzan a disminuir considerablemente después del

tercer a quinto año de infección. Una misma rama infectada puede presentar

hojas sanas y enfermas. El ToRSV produce sobre cerezos síntomas iniciales

de estrés con una serie de manchas cloróticas sobre las hojas asociadas a

las nervaduras, junto con presencia de hojas con enrollamiento hacia arriba,

seguidas de necrosis marginal. Según NEMETH (1986), los cerezos sobre

Prunus mahaleb presentan los primeros síntomas a los tres-cinco años,

mientras que sobre P. avium no presenta síntomas por muchos años.

15

2.4.2.1. Brown line

Los árboles del género Prunus al contraer ToRSV, poseen un crecimiento

bajo y follaje disperso. Ciruelos sobre mirobalán (Prunus ceracifera E.)

presentan una marcada disminución del crecimiento en el sector bajo la

unión, con zonas necróticas bajo la corteza, que dan el nombre a esta

enfermedad. Las plantas mueren por falta de transporte de nutrientes hacia

la parte aérea, ya que la respuesta hipersensible de la planta hace que la

zona tenga sólo células muertas.

2.4.2.2. Peach yellow bud mosaic

En cerezo, las hojas de las plantas infectadas presentan una severa

limitación de su crecimiento, muriendo al comienzo del aumento de las

temperaturas. Sus síntomas varían a través de los años, teniendo hojas

amarillas, anillos cloróticos y/o mosaicos al primer año, y yemas amarillas en

los brotes, que generalmente mueren durante la temporada de producción

frutal. Además se puede observar una producción menor a la normal.

2.4.2.3. Prunus stem pitting

Las plantas de cerezo afectadas por esta enfermedad, presentan una

coloración amarilla o rojiza en forma prematura, cayendo tempranamente. La

corteza se torna esponjosa bajo ella se generan acanaladuras, siendo más

notorio sobre y bajo el área cercana a la línea del suelo. P. mahaleb muestra

unas pequeñas y difusas punteaduras, mientras que en Stockton Morello (P.

cerasus) se muestra principalmente una necrosis en la zona cambial

(GONSALVES, 1995).

16

2.4.3. Transmisión

La forma de transmisión de este virus es naturalmente mediante nemátodos

del género Xiphinema por medio de la alimentación de éstos en las raíces de

los hospederos. Por tanto, la dispersión en el huerto está limitada a la

capacidad migratoria de los vectores. Desde las raíces infectadas, el virus se

mueve hacia arriba por el tronco hasta ponerse en contacto con el tejido de

la unión patrón injerto. Debido a la alta susceptibilidad de las variedades se

produce la necrosis del tejido de unión, desencadenándose el proceso

denominado "Brown line", además de la transmisión mediante inoculación

mecánica e injertos de plantas enfermas (INTA, 2005).

2.5. Apple chlorotic leaf spot virus:

2.5.1. Características del agente causal

Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), es uno de los virus de mayor

distribución entre los frutales, afectando no sólo a frutales de carozo sino

también a pomáceas. Inicialmente el virus se identificó en Inglaterra

denominándolo "Platycarpa line pattern virus" y se le caracterizó como

latente en manzanos y perales. Posteriormente, se le detectó en especies de

frutales de carozo asociado a daños en los frutos e incompatibilidades en la

unión variedad portainjerto (DAL ZOTTO, 1999).

Pertenece al grupo de los Closterovirus. Es una hebra simple de RNA con un

peso molecular de 2,5 x106 Dalton (HANSEN, 1995). El peso molecular de la

sub unidad proteica cobertora es de 23,500 Kb. El ACLSV está ampliamente

distribuido en el ámbito mundial habiéndose reportado en Europa, África y

17

América. En Chile, HERRERA (1993) lo ha detectado en durazneros pero no

se posee información sobre su diseminación a nivel de huertos comerciales y

viveros. Sin embargo, ACLSV se encuentra en huertos tanto de manzanos

como de perales.

Su importancia económica está dada por el daño directo que causa en las

plantas afectadas, el cual se muestra como daños en fruto y en la unión

variedad - portainjerto, y además otros daños que son indirectos, como

desórdenes escondidos, los cuales se pueden mostrar como alteraciones en

la traslocación de nutrientes entre las células de conducción y por acción

sinérgica con otros virus (INIA, 2005). La mayoría de los portainjertos

utilizados en Prunus son muy susceptibles a este virus de modo que las

partículas se multiplican abundantemente. En cerezos el virus es

asintomático.

2.5.2. Sintomatología

Los síntomas generalmente aparecen en las hojas, frutas y tronco, su

severidad depende mayoritariamente de la especie del cultivar y de la raza

del virus. Algunas razas pueden causar hendiduras en el tallo o

sintomatología semejante a “Pseudopox” en las frutas de durazno, damasco

y ciruela. En conjunto con un Ilarvirus como PNRSV, la infección puede

causar necrosis y manchas profundas en las frutas, tanto en cerezas dulces

como agrias. La mayoría de los cultivares se infecta latentemente por el virus

(INIA, 2005).

Algunas razas causan en el injerto una incompatibilidad o malformación de

frutas severa.

18

2.5.3. Transmisión

DIEKMANN (1996), asegura que la transmisión de este virus se realiza por

injerto e inoculación artificial en la savia. Los indicadores leñosos principales

usados para el descubrimiento de ACLSV son GF 305, que reacciona con un

verde oscuro y un moteado en las hojas, y Prunus tomentosa .

2.6. Cherry leaf roll virus:

2.6.1. Características del agente causal

Pertenece al grupo de los Nepovirus. Este grupo se caracteriza comúnmente

por tener una morfología poliédrica particular, con un diámetro de 28 nm, y

una hebra simple de RNA con pesos que varían entre los 1,3-2,4 x106 , a 2,6

x106 Dalton. Es un virus raro en cerezos, pero mucho más común en nogales

(Juglans regia L.), en donde la enfermedad es conocida como línea negra o

“Black line” (INIA, 2005).

2.6.2. Sintomatología

Los síntomas aparecen generalmente en hojas y en troncos, en donde la

severidad depende generalmente de la especie cultivada y de la raza del

virus. Según NEMETH (1986), el virus puede inducir retraso en la floración,

pedicelos cortos, hojas enrolladas y muerte de la planta. En otras especies

puede producir anillos cloróticos, y amarillamiento de venas.

19

En la mayoría de los casos, el virus causa la muerte de la planta a los cinco

años, pero en sinergia con otros virus, como PDV y PNRSV, el proceso de

deterioro se acelera (NEMETH, 1986).

2.6.3. Transmisión

El virus es transmitido por material de injertación, polen y semillas.

Xiphinema coxi, X. diversicaudatum y X. vuittenezi han sido reportados como

vectores transmisores de CLRV (DIEKMANN, 1996).

Tiene como hospedero a varias especies de nogal, a olivos (Olea europea),

ciruelos (Prunus cerasifera), durazneros (Prunus persica) y cerezos (Prunus

avium).

En nogal, que es la especie que más comúnmente presenta esta

enfermedad, la principal forma de transmisión es mediante la injertación de

material infectado, aunque su traslocación dentro de la planta suele ser

errática y muy lenta. Incluso existen reportes de que luego de tres años de

inoculado el virus, no se ha presentado uniformidad ni respuesta

(ARAMBURU, NINOT y ALETÀ, 1997).

En este caso, la detección de CLRV en nogal, que comúnmente se realiza en

hojas, también puede realizarse tomando muestras de semillas posiblemente

infectadas, debido a que se ha comprobado la existencia de virus en estas

estructuras (TOPCHIINKA, 1993).

Según LANKES (2003), los portainjertos Colt, F 12/1, Gisela 5 y los clones

Piku 1, 3 y 4 se presentarían como tolerantes a estos virus, y los portainjertos

20

Gisela 6 y VVA – 1 fueron declarados medianamente sensibles, debido a una

reducción en el crecimiento de los brotes y en el tamaño de sus láminas

foliares.

Su translocación dentro de plantas nuevas de carozo es comparativamente

más lenta, puesto que conforme a estudios realizados por CAMBRA et al.

(1986) en durazneros, a los 15 días de inoculado, el virus no presentó

translocación en la planta, no así PNRSV, que a la misma fecha mostró una

traslocación casi total.

2.7. Plum pox virus: 2.7.1. Características del agente causal

El virus del “Plum pox” o Sharka, pertenece al género Potyvirus, y es uno de

los más diseminados a nivel mundial en frutales de carozo. Existen diferentes

razas, entre los que destaca el tipo C, que es agresivo principalmente para

cerezos y guindos ácidos (CAMBRA et al., 2005).

2.7.2. Sintomatología

El virus de la Sharka, fue descrito entre 1915 y 1918 en ciruelos, en Bulgaria.

Su sintomatología se basa en la aparición de anillos tanto cloróticos como

necróticos, al igual que bandas cloróticas en el hueso, piel del fruto, flores y

hojas. La severidad del daño causado a plantas varía de acuerdo a la

especie del cultivar, la raza del virus, la época y el lugar en que este se

encuentre (LEVY, 2000).

21

Las hojas también pueden caer, o sólo presentar los síntomas durante la

etapa de crecimiento. Los frutos se pueden presentar deformes.

HERRERA y MADARIAGA (2002), realizaron un estudio en diversos viveros

de la zona central, y entre 1510 plantas de cerezo, no hubo ningún resultado

positivo. Tampoco existen muchos registros de PPV en cerezos.

2.7.3. Transmisión

Su transmisión se produce por injerto, multiplicación vegetativa y

diseminación de forma natural por pulgones de modo no persistente (LEVY,

2000).

22

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Ubicación del experimento:

Esta investigación se realizó en el Laboratorio y en el invernadero de

Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad

Católica de Valparaíso.

3.2. Obtención de muestras de cerezo: La obtención de las muestras de Prunus avium aparentemente infectadas

con virus, se realizó de forma dirigida, ya que se buscaban plantas con

síntomas virales en los huertos que se visitaron, para asegurar la

recopilación de material enfermo, y establecer también una relación entre los

síntomas que presenta la planta y la posible enfermedad que ella padezca.

Éstas plantas fueron obtenidas desde huertos productivos, con jardines de

variedades, los cuales se encuentran ubicados en Quillota, Los Andes, San

Francisco de Mostazal (región Metropolitana), Morza (VI región), y predios

ubicados en Curicó (VII región).

Además, se recolectó material asintomático de partes de plantas que

presentaban síntomas en otros sectores, y plantas que no presentaban

síntomas aparentes.

23

3.3. Análisis serológico:

Para la realización de los exámenes serológicos a las muestras recolectadas,

se debió conocer previamente qué virus son los que serían buscados, ya que

el género Prunus es atacado por muchos virus y enfermedades, por lo que la

decisión fue buscar los que se encuentran en mayor incidencia tanto en

literatura como en otros estudios realizados en Chile, y considerando la lista

que fijó el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) para producir material

certificado. Es por esto que se analizó en las muestras de cerezo los

siguientes virus:

- Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV).

- Prune dwarf virus (PDV).

- Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV).

- Cherry leaf roll virus (CLRV).

- Tomato ringspot virus (ToRSV).

Los anticuerpos con los que se realizaron los exámenes serológicos en el

laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Agronomía son de marca

Bioreba, y son específicos para los virus buscados.

La lectura de las placas con las muestras tratadas, fueron realizadas con un

espectrofotómetro con un filtro de 405 nm., marca Bio-rad modelo 550, el

cual también se encuentra en el laboratorio antes mencionado. Se consideró

como positivas a todas aquellas muestras que superaron el doble de la

media de los controles negativos, y se realizó una vez obtenido los valores

de densidad óptica (DO) que entregó el instrumento.

24

3.4. Análisis biológicos:

Las plantas indicadoras utilizadas para inocular material con posible

infección, fueron plantas GF 305, portainjerto franco de Prunus persica, el

cual es susceptible a todos los virus señalados (BARBA, 1998), este material

fue obtenido de semillas certificadas importadas desde Francia (Res. N° 350

de SAG, 1981).

Cabe destacar que con anterioridad, estos portainjertos GF 305

permanecieron en el invernadero ubicado en la misma Facultad, con

temperaturas oscilantes entre los 15ºC y los 25°C, por lo que posteriormente,

presentaron un problema de brotación, ya que no alcanzaron a acumular las

horas frío necesarias. Posteriormente, estas plantas se mantuvieron bajo

invernadero, ubicado en la Facultad de Agronomía.

Para el caso de la injertación de yemas de cerezos sobre GF 305, se utilizó

material obtenido desde el huerto de cerezos de la Facultad de Agronomía, a

los que previamente se les realizó test de ELISA-DAS con los seis diferentes

anticuerpos antes mencionados para verificar su sanidad, y también de las

plantas traídas de la estación experimental El Guindal, ubicada en la ciudad

de Los Andes.

Con el propósito de hacer análisis fitopatológicos, se obtuvieron cerezos

variedad Rainier, las cuales llegaron a la Universidad en estado de

dormancia, sin hojas.

25

3.5. Conservación de muestras y aislados: En cada prueba de ELISA-DAS que se realizó durante el período de

ensayos, se obtuvieron extractos de todas las plantas analizadas,

independientemente que luego de la lectura se comprobara que tenían o no

virus. Estos extractos, fueron almacenados a –20°C en el laboratorio de

Fitopatología de la Universidad, para efectos de estudios posteriores, o para

ser utilizados como futuros controles positivos (en caso de presentar virus) o

como controles negativos, si la planta se encontraba sana.

Para la conservación de aislados de virus presentes en plantas de cerezo, se

procedió a inocular plantas de GF 305, previamente analizados de estar

libres de virus, empleándose para este efecto un injerto parche (sin yema) de

la muestra a conservar, la que era introducida a la planta indicadora

mediante una incisión en forma de T, haciendo dos injertos en cada planta,

dejándose dos plantas por virus como repeticiones de cada material

infectado.

3.6. Análisis efectuados:

La inoculación de los portainjertos de GF 305, se realizó al igual que la toma

de muestras de los cerezos obtenidos en la estación experimental El Guindal

(Los Andes), en un invernadero ubicado en la Facultad de Agronomía.

Se realizaron siete análisis serológicos en laboratorio, comenzando el 11 de

marzo, y luego el día 1 de abril, 20 de mayo, 28 de octubre y 3 de noviembre

del año 2005, mientras que el año 2006 se realizaron los restantes el día 3

de enero y 19 de enero.

26

El primer examen de ELISA-DAS efectuado se realizó con plantas ubicadas

en el huerto de cerezos que se encuentra en la Facultad de Agronomía de la

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, incluyendo variedades como

Van, Bing, Brooks y Lapins. Durante el segundo procedimiento, se utilizaron

muestras obtenidas de una colección de variedades y portainjertos de la

Estación Experimental El Guindal, de Los Andes, las que incluían variedades

como Bing, Van, Santina, y patrones como Maxma 14, Gisela 6, Prunus

mahaleb, entre otros.

Con las muestras de esta última experiencia, se inocularon seis plantas del

portainjerto franco GF 305, dos plantas por cada virus detectado. El material

injertado corresponde a corteza de árboles de cerezo testeados, de madera

de un año, realizando dos injertos en T en cada planta.

El tercer procedimiento de ELISA-DAS efectuado se realizó con muestras

obtenidas de cerezos var. Sunana, de un huerto ubicado en la zona de San

Francisco de Mostazal, VI región. Junto con esto, se realizó la inoculación a

las plantas indicadoras con este material.

El cuarto análisis efectuado se realizó con las plantas GF 305 que habían

sido inoculadas con parches de material infectado obtenido luego de realizar

el primer, segundo y tercer análisis. Para el quinto, se analizaron las plantas

de cerezo variedad Rainier, sobre portainjerto Prunus mahaleb, que habían

sido obtenidas desde El Guindal, en Los Andes, y que permanecían en un

invernadero acondicionado en la Facultad de Agronomía de la PUCV.

El sexto análisis, se hizo con la intención de encontrar plantas sanas y libres

de virus en el huerto que se encuentra en la Facultad, para poder injertar

27

yemas de éstas en las plantas indicadoras GF 305, y poder realizar estudios

en forma posterior. Las variedades utilizadas fueron Van, Cristalina, Rainier,

Garnet, Newstar, Bing, Lapins, Brooks y Tulare. El séptimo análisis, fue

realizado con las muestras de plantas GF 305 que fueron inoculadas con

plantas enfermas obtenidas del quinto examen, para verificar nuevamente el

traspaso de virus de plantas enfermas a otras sanas, más las muestras

obtenidas en huertos de la VI y VII regiones de variedades Sunana, Bing y

Van.

Todos los extractos que se obtuvieron de estos análisis, fueron guardados y

congelados a -20ºC en el Laboratorio de Fitopatología de la Facultad.

28

4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1. Sintomatología observada: En los cuatro huertos en que fueron analizadas plantas de cerezo, pudieron

ser observados las siguientes sintomatologías.

4.1.1. Enanismo

Reducción en el tamaño total de las plantas, las que fueron identificadas a

simple vista por la clara diferencia de tamaño que presentaban con respecto

a otras plantas vecinas, existiendo asociación con PNRSV y PDV, los que

posteriormente fueron detectados en éstas plantas. 4.1.2. Mosaico La presencia de mosaico clorótico en láminas foliares, presente en forma

aleatoria dentro de las plantas sintomáticas, fueron identificadas por la

variación de colores que presentaban las láminas, las que mostraron una

directa asociación con PNRSV, el cual fue encontrado en ellas.

4.1.3. Anillos y deformaciones

Los anillos irregulares, similares al tiro de munición, se encontraron

presentes tanto en hojas adultas como jóvenes, en forma aleatoria dentro de

la planta, del mismo modo que el mosaico. Las plantas que presentaron ésta

sintomatología, dieron como resultado la presencia de PNRSV y PDV.

29

En cuanto a las hojas deformadas, éstas se encontraron principalmente en

brotes de la temporada, y, al igual que la sintomatología anterior, las plantas

que presentaron deformaciones estaban con presencia de los mismos virus

antes mencionados.

4.1.4. Brotes arrosetados.

Ésta sintomatología, que principalmente se encontró en forma apical en

plantas de cerezo, tiene una clara asociación con el virus del enanismo,

aunque las plantas analizadas dieron como resultado no sólo este virus, sino

que en sinergia con PNRSV.

4.2. Resultados obtenidos mediante ELISA-DAS: En total se recolectaron 137 muestras que incluyeron cerezos (65 muestras),

portainjertos GF 305 (71 muestras) y Prunus mahaleb (una muestra), las

cuales se encuentran ordenadas cronológicamente según la fecha en que se

les realizó el test ELISA (Cuadro 1), obteniéndose plantas con distintos virus,

y algunas plantas con la presencia de más de un virus.

30

CUADRO 1. Virus presentes en muestras de cerezo extraídas durante otoño y primavera 2005 y verano 2006, analizadas mediante test ELISA-DAS.

Muestras positivas Región Fecha

examen Especie/patrón

Total plantas

analizadas

Total plantas positiva PNRSV PDV CLRV ToRSV ACLSV

PNRSV+PDV

V 11-03-05

Cerezo (1)

8 2 2 0 0 0 0 0

V 01-04-05

Cerezo (2)

7 4 1 2 1* 0 0 0

VI 20-05-05

Cerezo (3)

3 0 0 0 0 0 0 0

V 28-10-05

Cerezo var.

rainier 23 22 21 12 0 0 0 11

V 03-01-06

Cerezo (5)

18 13 8 4 0 0 0 0

V 03-01-06

Prunus mahaleb

1 1 1 0 0 0 0 0

VI y VII 19-01-06

Cerezo (6)

5 0 0 0 0 0 0 0

TOTAL 65 42 33 18 1* 0 0 11

(1) Van, Bing, Brooks y Lapins, (2) Bing, Van y Santina, (3) Sunana, (4) Rainier, (5) Van, Cristalina, Rainier, Garnet, Newstar, Bing, Lapins, Brooks y Tulare, (6) Sunana, Bing y Van.

Del total de muestras analizadas, incluyendo aquellas que fueron inoculadas

con material infectado, el virus de mayor incidencia fue PNRSV, con un

50,76%, seguido por PDV, el cual se encontró en un 27,69% de las muestras

examinadas. CLRV fue encontrado en un 1,53% del material recolectado.

CLRV (con * en el cuadro) se encontró en una de las plantas inoculadas con

este virus, sin embargo; este resultado es dudoso, puesto que tanto en el

control positivo como el negativo, se encontraron problemas, ya que al

momento de la lectura no marcaron una diferencia notoria entre uno y otro, y

tampoco se pudo diferenciar el positivo de la muestra, la que fue mayor al

31

control, además de esto, se obtuvo un 42% de lectura de DO superior al

control negativo, por lo que técnicamente se confirma que es un resultado

negativo.

Para el caso de ToRSV y ACLSV, no se encontraron muestras que

presentaran ninguno de estos virus.

En el caso de los análisis realizados a plantas establecidas en huertos, el

virus predominante fue PNRSV, con una presencia en 33 de las 41 muestras

colectadas. A continuación se encuentra PDV (Figura 1), con 18 de las

muestras colectadas. Cabe destacar, que en un buen número de las

muestras en que se encontró PNRSV (11 de 18), estaba actuando

sinérgicamente con PDV, lo que se confirma con estudios realizados por

LANKES (2003); MANGANARIS et al.(2003); WOOD, TATE, MANKTELOW,

MORTON, KALE.(1997); ANDERSONE et al.(2002) y SILVA et al.(2003),

donde se señala que es común encontrarse con estos Ilarvirus afectando una

planta en forma conjunta.

32

05

10152025303540

Nº Muestras positivas

Muestras positivas

VIRUS

PNRSV

PDV

ACLSV

CLRV

ToRSV

PNRSV+PDV

FIGURA 1. Incidencia de cada virus por número de muestra positiva del total de análisis.

En este gráfico demuestra la dominancia del Ilarvirus Prunus necrotic

ringspot virus por sobre los demás, lo cual no debiera sorprender, ya que

este virus, junto a PDV, son unos de los más comunes de encontrar en

Prunus, tanto en viveros de frutales como en huertos establecidos, lo cual

concuerda con lo señalado por HERRERA y MADARIAGA (2002), sobre el

problema que existe con viveros de la zona central que, si bien traen material

varietal desde centros de producción europeos y que cuentan con

certificación, los portainjertos son formados en Chile. Es así como el ejemplar

analizado de P. mahaleb (Cuadro 1), que aunque pueda ser tolerante, la

partícula viral es transmitida a la variedad injertada, y una vez establecidas

en el huerto, diseminan el inóculo vía polen, teniendo como vector

secundario a abejas y otros agentes polinizadores.

33

4.3. Pruebas biológicas con GF 305: Las plantas utilizadas para la inoculación de los virus encontrados en plantas

de cerezos, fueron obtenidas a partir de semillas traídas de Francia, las

cuales eran certificadas, por lo que se asumió que éstas se encontraban

libres de virus. De todas formas, y a manera de asegurar su sanidad, se les

realizó un análisis mediante test de ELISA-DAS, el que arrojó resultados

negativos para todos los virus analizados.

El material inoculado provino de muestras de plantas de cerezo que

resultaron positivas en el análisis serológico con Prunus necrotic ringspot

virus y Prune dwarf virus. Además, se añadieron a éstas inoculaciones

muestras de cerezos que no presentaron resultados positivos en los análisis

serológicos, pero que se sospechaba de la presencia de alguno de los virus

estudiados, como ToRSV, ACLSV y CLRV.

En total, se inocularon 31 plantas GF 305, de las cuales siete fueron

inoculadas el día cuatro de Mayo del 2005, y 24 fueron inoculadas el día 11

de Noviembre del 2005. Las plantas indicadoras que resultaron positivas en

la detección de virus a través de ELISA-DAS, presentaron los siguientes

síntomas:

-Anillos en las hojas, presentes en plantas inoculadas con PNRSV ó PDV.

-Brotes arrosetados, los que se presenciaron el las plantas inoculadas con

PDV.

34

-Mosaicos cloróticos, que fueron encontrados en plantas indicadoras

inoculadas con PNRSV y PDV juntas, y en plantas inoculadas con PNRSV.

En ninguna ocasión se presentó una exudación de goma, lo que difiere de lo

expuesto por los datos obtenidos de INIA (2005), donde se hace mención a

esta exudación, más la muerte de floema y xilema, que hasta las últimas

revisiones de las plantas, en donde ya habían pasado cinco semanas de

inoculado el virus, no mostraron muerte de tejidos vasculares.

Tampoco se evidenciaron muertes de brotes, ni cancros en la corteza de las

plantas inoculadas con PNRSV, lo cual contrasta con lo expuesto por DAL

ZOTTO (1999) y referencias de INIA (2005).

Se obtuvo un nivel de eficiencia en la inoculación de un 19,35%, ya que de

las 31 plantas inoculadas, sólo seis de éstas presentaron virus al realizar

ELISA-DAS, de las cuales cinco se obtuvieron a partir de la primera

inoculación, y sólo una de la segunda. Si bien el material enfermo que se

inoculó a las plantas indicadoras tuvo un buen prendimiento, y se esperó el

tiempo mínimo dado por literatura, que corresponde de cuatro a cinco

semanas (INIA, 2005), 23 de las 24 plantas inoculadas no dieron positivo en

el examen realizado en laboratorio, esto dado posiblemente por las

temperaturas elevadas que se generaron dentro del invernadero en donde se

encontraban las plantas inoculadas, lo cual se confirmaría con lo mencionado

por STEIN et al. (1991), sobre la inhibición de PNRSV con termoterapia

aplicada a plantas de Prunus domestica.

35

FIGURA 2. Síntomas presentados por plantas de cerezo (Prunus avium L.) infectadas con Ilarvirus, en colección de variedades en la V región (PUCV). A: Intenso anillado necrótico, con necrosis en borde de las hojas de cerezo, naturalmente infectado con PNRSV, B: Hojas deformes, dañadas, con clorosis y con crecimiento arrosetado de sus brotes, C: Daño en hoja, con borde necrótico y fuerte mosaico clorótico, tras ella, hojas con anillos necróticos, asociado a PNRSV y PDV, D: Anillamiento y deformación en hojas de cerezo variedad Rainier, asociado a PNRSV.

36

Para las plantas GF 305 inoculadas con material infectado proveniente de

cerezos, la mayor incidencia de infección se obtuvo con la primera

inoculación, realizada en mayo del año 2005, en el cual se encontraron tres

de los cinco virus analizados. Nuevamente, en los análisis realizados, el

Ilarvirus PDV se encontró actuando en forma sinérgica con PNRSV.

Por otra parte, los análisis biológicos también mostraron evidencia de

síntomas asociados a virosis en las plantas indicadoras (Figura 3). Estos

síntomas consistieron en un menor crecimiento de las plantas inoculadas con

respecto a su testigo correspondiente, brotación desuniforme y arrosetada,

aparición de anillos en las hojas y mosaico clorótico.

Las plantas de cerezo variedad Rainier obtenidas en la estación experimental

El Guindal de Los Andes, presentaron en su brotación claros síntomas que

indicaban la presencia de virosis (mosaicos cloróticos, muerte de brotes,

arrosetamiento, perforaciones en las hojas), los cuales fueron ratificados una

vez realizado el análisis serológico (Figura 1, Figura 2).

37

FIGURA 3. Síntomas presentes en plantas indicadoras, inoculadas con

material vegetal infectado con virus. A. Diferencia de crecimiento luego de siete meses desde la inoculación de PNRSV en plantas GF 305 (izq.), con respecto de otro GF 305, pero sin inocular (der.), B. Anillos cloróticos en las hojas de GF 305 inoculadas con PNRSV y PDV. C. Formación de anillos en hojas nuevas, al inicio de la brotación, en plantas inoculadas con PNRSV. D. Brote de GF 305 con forma de roseta, por causa de PDV inoculado.

38

Las plantas de cerezo variedad Rainier, que llegaron en estado de dormancia

a la Facultad, no presentaban indicios de estar enfermas. Sin embargo, una

vez comenzada la brotación, los síntomas de posibles virosis fueron cada vez

más claros, ya que las hojas aparecieron con perforaciones (Figura 2 D) y los

brotes presentaron crecimientos limitados, coincidiendo con las descripciones

señaladas por MINK (1995), y por lo señalado por DAL ZOTTO (1999),

referido a la muerte de brotes, causado por PNRSV.

La idea central de la utilización de éstas plantas, radicaba en la necesidad de

realizar y comprobar los postulados de Koch, transfiriendo el virus obtenido

en plantas de cerezo de huertos a estas plantas de dos años variedad

Rainier, pero al obtener los resultados del test de ELISA-DAS, se desestimó

esta posibilidad, ya que la gran mayoría de las plantas estaban infectadas

con PNRSV, PDV e incluso en algunas plantas se encontraron ambos virus.

Debido a esto, sólo se pudo realizar inoculaciones a plantas indicadoras.

39

CUADRO 3. Infección viral presente en plantas GF 305 artificialmente

inoculadas con material infectado proveniente de cerezos.

Prueba biológica en GF 305

Región Fecha de

inoculación/ detección

Tipo de virus

inoculados

Virus detectadospor ELISA-

DAS Mosaico AnillosDeformación de hojas Arrosetado

Absición prematura de

hojas

V PNRSV PNRSV Pos Pos Neg Neg Neg V P+P PDV Pos Pos Neg Pos Pos V P+P P+P Pos Neg Neg Neg Neg V PNRSV PNRSV Pos Pos Neg Pos Pos V CLRV? Neg Neg Neg Neg Neg V

04/05/05 03/11/05

PNRSV PNRSV Neg Neg Neg Pos Neg V PDV PDV Neg Pos Neg Pos Neg V PDV Neg Neg Neg Neg Neg V PDV Neg Neg Neg Neg Neg V PDV Neg Neg Neg Pos Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Pos Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Pos Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Pos Neg Neg Neg V P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg V

11/11/05 19/01/06

P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg Neg: negativo; Pos: positivo; P+P PNRSV+PDV. Las abreviaciones en negrita, indican presencia del virus en la muestra, o síntomas vistos en plantas indicadoras.

40

4.4. Análisis global de los resultados obtenidos:

Queda de manifiesto que existen virus asociados a huertos de cerezos que

son capaces de atacar e infectar a plantas del género Prunus, sin haber cura

para ellas una vez que adquieren el patógeno. Las medidas culturales

preventivas pasan a ser de una importancia total a la hora de prevenir el

contagio de más plantas, ya que utilizando variedades comerciales sanas,

con material puro de injertación, herramientas limpias, suelos libres de

nemátodos vectores del género Xiphinema, y portainjertos testeados y libres

de virus, es posible mantener producciones estables, con altos rendimientos,

y en una planta capaz de llevar a cabo un ciclo de crecimiento completo y sin

problemas.

Uno de los lugares que mayor importancia adquiere a la hora de llevar a cabo

estas medidas, son los viveros, en donde se producen la gran mayoría de

plantas con destino a huertos comerciales, y donde los virus, en especial

PNRSV y PDV que son los más recurrentes, suelen contagiar a plantas

sanas, dispersándose en forma masiva.

En la región, el cultivo del cerezo se encuentra en una clara fase de

crecimiento, dado esto por los retornos monetarios que incentivan a los

agricultores a invertir en él, a variedades de bajo requerimiento de frío, o a la

posibilidad de utilizar productos químicos que sustituyan parcialmente las

horas de frío requeridas por mejores variedades. Es por esto que la

información sobre variedades y patrones que se encuentren libres de virus, y

los viveros que las ofrezcan, es crucial a la hora de pensar en instaurar un

nuevo huerto, y la comunicación con otros agricultores que tengan estos

41

cultivos aledaños para saber si es que han sido atacados por virus, para así

poder tomar medidas preventivas.

La cuantificación sobre la incidencia de virus en cerezo (Prunus avium L.), ya

sea en forma serológica como biológica, es factible en etapas del desarrollo

vegetativo de éstas, utilizando como material de muestra hojas nuevas y

adultas, obtenidas en forma aleatoria de las plantas analizadas.

42

5. CONCLUSIONES

En las muestras provenientes de cerezos con síntomas de estar afectadas

por virosis, se detectaron dos virus principalmente: Prunus necrotic ringspot

virus y Prune dwarf virus en plantas de cerezos, con una incidencia de

50,76% para el primero y un 27,69% de las muestras examinadas para el

segundo. Para el caso de CLRV, ToRSV y ACLSV, no se encontraron

muestras que presentaran ninguno de estos virus.

Los principales síntomas que se encontraron en las plantas tanto de cerezos

establecidos en huerto como en plantas indicadoras GF 305 inoculadas con

material infectado fueron: Anillos cloróticos, necrosis en borde de las hojas,

anillos necróticos y mosaico clorótico, para el caso de PNRSV, mientras que

para PDV, los síntomas encontrados fueron reducción de crecimiento en

plantas, mosaico clorótico en hojas, anillos cloróticos y presencia de brotes

arrosetados.

Se determinó la presencia de virus en muestras seropositivas, mediante el

uso de plantas indicadoras GF 305, las que en algunos casos mostraron

síntomas de presencia de virus en forma previa a la prueba serológica

empleada.

43

RESUMEN

Las plantaciones de cerezos (Prunus avium L.) han ido aumentando en nuestro país los últimos 12 años, con un crecimiento de más de 4.547 hectáreas desde el año 2001. El ingreso de nuevas variedades capaces de adaptarse a los diferentes climas del país, con características apropiadas para obtener más y mejores producciones, ha generado también el ingreso de virus, los cuales componen un punto importante en el segmento de enfermedades que atacan al cerezo, ya que su presencia en los campos y viveros ha sido muy difícil de erradicar, debido a que no existen herramientas para eliminarlos, sólo hay manejos culturales preventivos. Los objetivos que se plantearon en el presente estudio fueron analizar huertos de cerezos, buscando cuantificar serológica y biológicamente la incidencia de virus en plantas sintomáticas que pudieran estar afectadas por virus. De la misma forma, conservar estos aislados en plantas leñosas, para ser utilizadas en estudios posteriores. Esta investigación fue realizada en el invernadero y en el laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. La recolección de muestras fue en forma dirigida, en diferentes huertos y jardines de variedades de cerezos, ubicados en Quillota, Los Andes, San Francisco de Mostazal, Morza y huertos cercanos a Curicó. Se analizaron virus que comúnmente atacan al cerezo como son PNRSV, PDV, CLRV, ToRSV y ACLSV. Para esto se realizaron pruebas serológicas mediante el test ELISA-DAS, y pruebas biológicas, con inoculación de material infectado con virus en plantas indicadoras GF 305. En huertos muestreados, se obtuvo que la mayor incidencia viral estaba dada por PNRSV, con un 50,76% seguido de PDV 27,69%, encontrándose además en las inoculaciones a plantas indicadoras, en donde se obtuvo un notorio sinergismo entre ambos Ilarvirus.

44

ABSTRACT

The amount of land occupied by cherry (Prunus avium L.) orchards in Chile has been increasing for the last 12 years, with a growth of 4,547 hectares since 2001. This has caused an increase in the number of new varieties arriving in Chile that are able to adapt to different climatic zones, capable of obtaining higher quality and levels of production, earlier harvests, and higher post-harvest fruit quality, among other characteristics. There is no doubt that viruses constitute an important part of the diseases that attack cherry trees, and that once present in fields and nurseries they have been very difficult to eradicate, mainly because there are no existing tools for eliminating them except for preventative cultural management. The objectives proposed for this study were to analyze cherry orchards, with the aim of quantifying viruses, both biologically and serologically, on possibly- infected symptomatic trees. And in the same way, to preserve the isolates in woody plants for use in future studies. The research was done in the phytopathology greenhouse and laboratory of the Agronomy faculty of the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Samples were collected with specific direction, from different cherry varieties in orchards and gardens located in Quillota, Los Andes, San Francisco de Mostazal, Morza and near Curicó. An analysis of viruses that commonly attack cherry trees such as PNRSV, PDV, CLRV, ToRSV and ACLSV was done. For this analysis, serological trials were done using an ELISA-DAS test, and biological trials using inoculation of GF 305 indicator plants with virus-infected material. In the orchards that were sampled, the highest viral incidence obtained was PNRSV at 50.76%, followed by PDV at 27.69%, the same was found for the inoculated indicator plants, where a notable synergism between both ilarviruses was also observed.

45

7. LITERATURA CITADA

ANDERSONE, D.; WUSTENBERGHS, H.; COOK, N.; KEULEMANS, J.

2002. Effects of infection by viruses on vegetative and reproductive

growth of sweet cherry on Damil and Inmil rootstocks. Horticultural

science 29 (3): 99-104.

ARAMBURU, J; NINOT, A.; ALETÀ, N. 1997. Translocation of Cherry leaf

roll virus (CLRV) in Juglans regia. Acta Horticulturae. 442: 393-397.

ASCUI, L. y ALVAREZ, A.M. 1988. Identificación del anillado necrótico de

los Prunus mediante ELISA. Agricultura Técnica. 48: 71-74.

AUGER, S. J., ESTEREO, M. 1987. Identificación del virus de la mancha

anular del tomate (Tomato ringspot virus) en ciruelo europeo Prunus

domestica var. D'agen con síntomas de enrollamiento del tipo

brown line. Simiente 57: 96.

BARBA, M. 1998. Virus certification of fruit tree propagative material in

Western Europe. In: Hadidi, A.; Khetarpal, R.; Koganezawa, H. eds.

Plant virus disease control. Pp 288-293.

BROWN, D., HALBRENDT, J., JONES, A., VRAIN, T. and ROBBINS, R.

1994. Transmission of three North American Nepoviruses by

populations of four distinct species of the Xiphinema americanum

group. Phytopathology. 84 (6): 646-649.

46

CAMBRA, M.; LLÁCER, C.; ARAMBURU, J. and CAVINA, A. 1986.

Translocation of Chlorotic leaf spot and Prunus necrotic ringspot

viruses in apricot and peach seedlings. Acta Horticulturae. 193: 233-

240.

CAMBRA, M.; GORRIS, M.; ESTEBAN, O.; OLMOS, A. y MARTÍNEZ, M.

2005. El virus de la sharka tipo M (MARCUS) agresivo en

melocotonero, (on line).

http://www.ivia.es/deps/otri/Documentos/FT_FRU_2.pdf

DAL ZOTTO, A.; NOME, S.; Di RIENZO, J. A.; DOCAMPO, D. M. 1999.

Fluctuations of Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) at various

phenological stages in peach cultivars. Plant Disease. 83 (11):

1055-1057.

DEOGRITAS, J.; DOSBA, F.; LUTZ, A. 1989. Eradication of Prune dwarf

virus, Prunus necrotic ringspot virus, and Apple chlorotic leaf spot virus

in tissue cultured sweet cherry. Canadian Journal of Plant Pathology.

11 (4): 332-336.

DIEKMANN, M. and PUTTER C.A.J. 1996. FAO/IPGRI Technical

Guidelines for the Safe Movement of Germplasm. No. 16. Stone

Fruits. Roma. Food and Agriculture Organization of the United

Nations, Rome/International Plant Genetic Resources Institute. 111 p.

FRANKEN-BEMBENEK, S. 2003. “Gisela 3” (209/1) Un nuevo patrón clonal

de cerezo de la serie Giessen. ITEA. 99 (1): 63-66.

47

FUNDACIÓN PARA LA INNOVACIÓN AGRARIA. 2003 a. Frutales de Hoja

Caduca en Chile: Situación actual y perspectivas. Santiago. Ed. FIA.

188 p.

_______________________________________. 2003 b. Estrategia de

innovación agraria para la producción de frutales de hoja caduca.

Santiago. Ed. FIA. 76 p.

GONSALVES, D. 1995. Tomato ringspot virus. In: Ogawa, J.; Zehr, E.; Bird,

G.; Ritchie, D.; Uriu K. y Uyemoto, J. eds. Compendium of Stone fruit

diseases. Minnesota. APS press. The American Phytopathology

Society. pp. 70-71.

GROVE, G. 1995. Powdery Mildew. In: Ogawa, J.; Zehr, E.; Bird, G.;

Ritchie, D.; Uriu K. y Uyemoto, J. eds. Compendium of Stone fruit

diseases. Minnesota. APS press. The American Phytopathology

Society. pp. 12-14.

HANSEN, A. 1995 a. Apple chlorotic ringspot virus. In: Ogawa, J.; Zehr, E.;

Bird, G.; Ritchie, D.; Uriu K. y Uyemoto, J. eds. Compendium of Stone

fruit diseases. Minnesota. APS press. The American Phytopathology

Society. pp. 73.

48

__________. 1995 b. Little cherry. In: Ogawa, J.; Zehr, E.; Bird, G.; Ritchie,

D.; Uriu K. y Uyemoto, J. eds. Compendium of Stone fruit diseases.

Minnesota. The American Phytopathology Society. pp. 68-69.

HERRERA, G. 1993. Enfermedades virosas en durazneros, guindos y

cerezos en Chile. In: Herrera, G.; Sepúlveda, P. eds. Seminario

Internacional : Virus en frutales de carozo, pomáceas y vides.

Santiago. pp. 17-24.

HERRERA, M. G. y MADARIAGA, M. 2002. Incidencia de los virus Prunus

necrotic ringspot virus (PNRSV), Prune dwarf virus (PDV), Tomato

ringspot virus (TomRSV) y Plum Pox virus (PPV) en viveros de frutales

de carozo de la zona central de Chile. Agricultura Técnica. 62 (1): 38-

45.

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS. 2005. Virus del

anillado clorótico de los Prunus, (on line).

http://www.inia.cl/virologia/enfermedades/carozo_pnrsv.htm

INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA. 2005.

Importancia de los virus que atacan los cerezos. Criterios de

Clasificación, (on line).

http://www.inta.gov.ar/mendoza/info/documentos/TemasFruti/importan

cia%20de%20los%20virus%20que%20atacan%20los%20cerezos.pdf

49

_________________________________________________. 2005.

Tomato ringspot virus. “Virus de la mancha anular del tomate”, (on

line).

http://www.inta.gov.ar/mendoza/info/documentos/TemasFruti/Tomato

%20ringspot.pdf

LATORRE, B. 2004. Enfermedades de las plantas cultivadas. Santiago. Ed.

Universidad Católica de Chile. 638 p.

LANKES, C. 2003. Response of selected Prunus rootstock clones to

infection by Prune dwarf virus and Prunus necrotic ringspot virus.

Europ. J. Hort. Sci. 68 (1): 45-49.

LEVY, L.; DAMSTEEGT, V.; SCORZA, R.; KÖLBER, M. 2000. Plum Pox

Potyvirus Disease of Stone Fruits, (on line).

http://www.apsnet.org/online/feature/PlumPox/

MANGANARIS, G.; ECONOMOU, A.; BOUBOURAKAS, I; KATIS, N. 2003.

Elimination of PPV and PNRSV through thermotherapy and meristem

. tip culture in nectarine. Plant Cell Reports. 22: 195-200.

MEDEL, L. 1998. Potencial productivo del cerezo en el sur de Chile. Rev.

Frutícola 19 (2): 69 - 78.

MILLET, I. 1991. Prospección de Prunus necrotic ringspot virus y de Prune

dwarf virus en hurtos y viveros de cerezos de la provincia de Ñuble.

Chillan. Chile. Tesis de grado Ing. Agrónomo. Chillán. Universidad

de Concepción. Departamento de Agronomía, 79 p.

50

MINK, G. .1995. Prunus necrotic ringspot virus, Prune dwarf virus, Plum line

pattern Ilarvirus. In: Ogawa, J.; Zehr, E.; Bird, G.; Ritchie, D.; Uriu K. y

Uyemoto, J. eds. Compendium of Stone fruit diseases. Minnesota.

The American Phytopathology Society. pp. 64-65.

MINK, G., JONES, A. 1996. Cherry diseases: Their prevention and control.

In: Webster, A.; Looney, N. eds. Cherries: Crop physiology,

production and uses. Wallingford, CAB International. pp. 347-366.

NEMETH, M. 1986. Virus, mycoplasm and rickettsias diseases of fruit trees.

Budapest. Akademiai Kiado. 840 p.

OFICINA DE ESTUDIOS Y POLITICAS AGRARIAS. 2005. Estadísticas

productivas de frutales 1990-2004, (on line).

www.odepa.cl/Content.IE5\8VLJI6F1\frutales1990-2004[1].zip

PSCHEIDT, J. 1995. Leaf curl. In: Ogawa, J.; Zehr, E.; Bird, G.; Ritchie, D.;

Uriu K. and Uyemoto, J. eds Compendium of Stone fruit diseases.

Minnesota. The American Phytopathology Society. pp. 22.

REYES, F.; REYES, M.; SEPÚLVEDA, P.; HERRERA, G.; PAREDES, V.;

HINRICHSEN, P.; PRIETO, H. 2000. Nuevos antecedentes sobre el

Plum Pox Virus en Chile. X Congreso Nacional de Fitopatología:

Resúmenes – Presentaciones orales, (on line).

http://www.fitopatologiachile.cl/trabajos02/X.html#Articulo_01

ROSSINI, M. 2004. Presencia de algunos virus en frutales de carozo de Río

Negro, Argentina. RIA. 33 (2): 89-102.

51

SANCHEZ, C. R.; HEPP, R y VENEGAS, A. 2000. Evaluación del estado

sanitario viral de huertos de cerezos (Prunus avium L.) de la VIII

región. 51° Congreso Agronómico de Chile. Resumen pág.: 148.

(Original no consultado)

SCOTT, S.; ZIMMERMAN, M.; BACHMAN, E.; YILMAZ, S.; ZERHR, E.

2000. The interaction between Prunus necrotic ringspot virus and

Prune dwarf virus in Peach stunt disease. Acta Horticulturae 550: 229-

235.

SILVA, C.; TERESO, S.; NOLASCO, G. and OLIVEIRA, M. 2003. Cellular

location of Prune dwarf virus in almond sections by In situ reverse

transcription-polymerase chain reaction. Phytopathology. 93 (3): 278-

285.

STEIN, A.; SPIEGEL, S; FAINGERSH, G.; LEVY, S. 1991. Responses of

micropropagated peach cultivars to thermotherapy for the elimination

of Prunus necrotic ringspot virus. Annals of applied Biology.

119 (2): 265-271.

TOPCHIINKA, M. 1993. Detection of Cherry leaf roll virus – CLRV in seeds

of Juglans regia by ELISA. Acta Horticulturae 311: 290-294.

VALENZUELA, L. 1998. El Cultivo del Cerezo en Chile; Aspectos Técnicos.

Rev. Frutícola 19 (2): 55 - 68.

52

WATERWORTH, H. 1995. Cherry black canker. In: Ogawa, J.; Zehr, E.;

Bird, G.; Ritchie, D.; Uriu K. y Uyemoto, J. eds. Compendium of Stone

fruit diseases. Minnesota. The American Phytopathology Society.

pp. 74.

WEBSTER, A. 1996. The taxonomic classification of sweet and sour

cherries and a brief history of their cultivation. In: Webster, A.;

Looney, N. eds. Cherries: Crop physiology, production and uses.

Wallingford, CAB International. pp. 3-24.

WOOD, G. 1997 a. Contribution of plum and cherry rootstocks to virus

incidence in New Zealand stone fruit trees. New Zealand Journal of

Crop and Horticultural Science. 25: 131-139.

_________, TATE, K., MANKTELOW, D., MORTON, J., KALE, A. 1997 b.

Spread of Prune dwarf and Prunus necrotic ringspot viruses in Golden

Queen peach in Hawke´s Bay and effects on fruit yields. Plant

Diseases. 101-106.

53

ANEXO

54

ANEXO 1

El análisis serológico se realizó mediante test de ELISA-DAS, cuyo

procedimiento se describe a continuación:

1. Cobertura: Se aplicó el anticuerpo específico a la superficie, previa dilución

de 10 :l en 90 ul y de esta se extrajo dos ul y se agregó 200 ul de tampón,

por muestra (dos repeticiones), en donde se instaló el antígeno. Luego se

incubó en estufa a 30EC por cuatro horas.

2. Lavado: Se vaciaron los recipientes de los excesos, y se lavó tres veces

con el tampón de lavado (PBS con Tween 20), donde pasado esto se

esperaron tres minutos entre cada repetición, removiendo todo líquido de

este con toallas de papel.

3. Antígeno: el antígeno, o extracto de la planta a analizar, se debió

homogeneizar en el tampón de extracción a una relación 1:20 (un gramo en

20 ml de buffer), para luego aplicarlo sobre la cobertura en cantidades de 100

ul por celdilla, en la placa, e incubarlo a 4-6°C durante la noche.

4. Lavado: este lavado se realizó siempre de la misma forma que el realizado

en el punto número dos.

5. Conjugado: se diluyó el conjugado enzimático a una relación 1:1000 en el

buffer conjugado. El conjugado presenta tanto enzimas como anticuerpos,

dejando 100 ul de conjugado en cada celdilla, donde se debió incubar en

estufa a 30°C por cinco horas.

55

6. Lavado: al igual que los lavados anteriores, se eliminan los excesos de las

celdillas, y se lavan con un tampón especial para lavado, esperando 3

minutos entre cada repetición.

7. Sustrato: se disolvió el compuesto fosfatado (P-nitrofenil fosfato) en el

tampón de sustrato, en una relación de un miligramo de pNPP por mililitro de

búffer. Este fue el que reaccionó y entregó una lectura en color, la que se

debió medir fotométricamente a 405 nm luego de 45 minutos.