UNIVERSIDAD DE CARTAGENA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALESPROGRAMA DE BIOLOGÍA

CUARTO SEMESTRE

Laboratorio N° 5

Cromatografía de capa delgada, separación de los pigmentos de una planta

ADRIANA QUINTANA CANABALALFREDO MONTES ROBLEDOCARLOS PALMETH PETROVA

DANELA BRITO RUIZJORDAN HERNANDEZ MARTELO

PhD. ALONSO MARRUGO GONZALEZ

12 de marzo de 2014

CROMATOGRAFIA DE CAPA DELGADA, SEPARACIÓN DE LOS PIGMENTOS DE UNA PLANTA

OBJETIVOS GENERALES

Conocer la técnica de cromatografía de capa delgada como criterio para la separación de pigmentos de una planta.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Adiestrarnos en el manejo de la técnica de cromatografía de capa delgada, aplicada en el proceso de separación de los pigmentos de una planta (mataratón)

Observar que tan eficiente es este proceso para la separación de los pigmentos de una planta (mataratón)

INTRODUCCIÓN

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente pequeñas. En la biología celular se utiliza frecuentemente para separar azúcares simples, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, metabolitos, y ocasionalmente para separar cadenas cortas de polipéptidos y ácidos nucleicos. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgánico o una mezcla de ambos.

Podemos distinguir 3 tipos de cromatografía dependiendo si la fase estacionaria/fase móvil es sólido/líquido, líquido/líquido o líquido/gas:

Si es sólido/líquido, cabe distinguir entre:Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals).

Cromatografía de cambio iónico: el sólido es un cambiador de iones (fuerzas electrostáticas).Cromatografía de exclusión (o de geles): el sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.Cromatografía de afinidad: es un tipo especial de cromatografía de adsorción, utilizada especialmente en bioquímica, en la que un sólido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador enzimático o un anticuerpo.

Si es líquido/líquido, cabe distinguir:Cromatografía de partición: el soluto se reparte entra la fase móvil (líquido o gas) y la fase estacionaria.

Si es líquido/gas, cabe distinguir entre:Cromatografía gas-liquido (CGL), que es una cromatografía de partición.Cromatografía gas-sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.

Si es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura crítica, pero simultáneamente comprimido a una presión mayor que su presión critica), se trata de la cromatografía de fluidos supercríticos (CFS), que puede ser de partición o de adsorción.

Las técnicas cromatografías, según el dispositivo utilizado para conseguir la separación entre la fase móvil y la estacionaria, pueden ser: en columna y plana.

Cromatografía en columna: Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil (líquido o gas) a través de la estacionaria se consigue:1) por presión,2) por capilaridad,3) por gravedad.

Cromatografía plana: La fase estacionaria está colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse bidimensional. Se divide en dos tipos generales:

1. -Cromatografía en papel: en la que el papel absorbente actúa como soporte de la fase estacionaria (cromatografía de partición). Una muestra líquida fluye por una tira vertical de papel absorbente, sobre la cual se van depositando los componentes en lugares específicos.

2. -Cromatografía en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografía de partición), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.

El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisión radiactiva.

MATERIALES Y MÉTODOS

Durante el transcurso de la práctica se utilizó los siguientes materiales:

2 Placas de vidrio (3 x 12 cm) 1 Varilla de agitación 1Probeta 1 Cilindro (12 cm, 3,8 cmdiámetro) 1 Cilindro o cubeta para cromatografia 1Pinza para crisol 1 Vaso de 400 ml 1 Estufa de 110 ºC 3 Capilares 1 Espátula 1Gotero 2Erlenmeyer de 50 ml Metanol, Sílica Gel para cromatografia de capa delgada (adsorbente de

tamaño de granulo entre 10 y 40 micrones), Cloroformo. 2 Frascos pequeños con tapas Espinaca, Éter de petróleo, Embudo, Detergente, Lana de vidrio 1 Hoja de papel de filtro (15 x 15 cm)

1. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS

Tomamos dos placas de vidrio del mismo tamaño, aprox. 12 x 3 cm y lavamos muy bien con agua y detergente abundante, se enjuagaron con abundante agua para remover todo el detergente. Enjuagamos con Metanol al 50% y las pusimos a secar en una estufa.

Por agitación con una varilla se hizo una suspensión lo más homogénea posible de 35 gr de sílica gel para capa fina, en 100 ml de cloroformo: Metanol (2:1 V/V). Colocamos la suspensión en un cilindro hasta casi llenarlo (unos 2 cm por debajo de su borde superior). Colocando las placas una sobre la otra y soportándolas con los dedos sobre su parte superior se sumergió lentamente en el cilindro con la suspensión dejando que penetrara en la suspensión unas 4/5 partes de su longitud. Luego retiramos suavemente; después dejamos que el solvente se evaporara y se las separo con mucho cuidado. Se puso a activar las placas en una estufa a 110 º C por 10 min. Colocándolas dentro de un vaso. Después se dejó secar a temperatura ambiente.

2. EXTRACCIÓN DE MATARATON

En un mortero se molieron unos 65 gr de mataratón con 50 ml de metanol. Decantamos la s/n de metanol haciendo presión sobre el mataratón tratando de sacar la mayor parte del solvente. Botamos la s/n de metanol. Molimos el mataratón con una mezcla de 65ml de metanol y 35 ml de éter de petróleo (p. de e. de 30 a 60 ºC). Se filtró la mezcla a través de un embudo tapado con un poco de lana de vidrio en un embudo de decantación de 125 ml. Se repitió la molición del mataratón con 25 ml de metanol y 75 ml de éter de petróleo y se procedió a filtrar la mezcla en el embudo de separación. Se seco la fase inferior de Metanol y la botamos, se agregaron 50 ml de agua a la fase de éter de petróleo tape el embudo y se agito. Dejamos que se separaran las fases y luego sacamos la fase acuosa inferior y se desechó. Se repitió este mismo procedimiento pero esta ver con una porción de agua de 50 ml.

Vertimos la s/n de éter de petróleo en un Erlenmeyer de 125 y al agregar sulfato de Na anhidro la secamos y luego agitamos. Decantamos la s/n en otro Erlenmeyer agregándole unos trozos de vidrio y esperamos a que evaporara la mayoría del solvente en una plancha hasta que el volumen de la s/n se redujo a unos 20 ml. Guardamos esta s/n para los siguientes experimentos.

3. APLICACIÓN DE LA MUESTRA

Se introdujo la punta de un capilar en la s/n de los pigmentos. Luego que la s/n haya ascendido en el capilar lo retiramos. Se tocó momentáneamente con la punta del capilar lleno, un punto de la placa (aproximadamente a unos 2 cm del borde inferior). Con el fin lograr una mancha que contenga los pigmentos. Dejamos que el solvente se evaporara en la placa.

4. CROMATOGRAFÍA

Se agregó cloroformo al cilindro hasta una altura de unos 5 mm y se tapó con un vidrio de reloj dejándolo en reposo unos 5 min. Luego con una pinza se sostuvo la placa por su parte superior limpia y se introdujo verticalmente con cuidado (mancha hacia abajo) en el cilindro volviendo luego a taparlo.

5. REVELADO DE LAS PLACAS

Para poder ver la posición de manchas incoloras en la placa se introdujo está en un recipiente cerrado de 2 litros con un gramo de 12 en el fondo y se deja un rato. Una mancha ocre apareció donde hay compuestos orgánicos producto de un complejo formado entre el 12 gaseoso y el compuesto.se fotografió y tomo los datos.

Figura 1. Montaje de separación de fases

.

Los pigmentos verdes consisten principalmente de clorofila A y B.

RESULTADOS

Al finalizar la cromatografía de ambas muestras ascendió totalmente hasta la parte superior de la placa y obtuvo un color amarillo fuerte en el recorrido y al final un verde oscuro de lo que podemos decir siguiendo la tabla mostrada en la guía que fue posible observar Lutein y Clorofila B de la muestra de mata ratón.

Fig 3. Obtención de los pigmentos de la planta

DISCUSIÓN

Durante la práctica de laboratorio dada se puede inferir que el proceso de la mezcla química analizada disuelta en el disolvente y que al colocar una gota de la misma sobre la tira de papel filtro y una en la placa de sílica gel, se observaron resultados como una pigmentación amarilla Gliricidiasepium (mataratón) poseía luteina (carotenoide) que es un compuesto químico que contienen muchas plantas en sus hojas cabe resaltar que la luteina tiene propiedades antioxidantes y reducen la sensibilidad de la piel frente a los rayos UV, además se presenció un color verde en la cromatografía el cual era clorofila b la cual es un pigmento accesorio presente en vegetales y otras células fotosintéticas complejas; absorbe luz de una longitud de onda diferente y transfiere la energía a la clorofila A, que se encarga de transformarla en energía química y está compuesta principalmente por carbono, hidrogeno y una molécula de magnesio. Se puede inferir que se realizó de manera correcta la práctica de laboratorio ya que se obtuvo la coloración de la cromatografía esperada comparado con los resultado de Guzmán.

CONCLUSIÓN

Esta práctica de laboratorio se culminó con éxito y con los resultados obtenidos evidenciamos que nos adiestramos en el manejo de la técnica de separación descrita en este informe, en donde se aprendió a utilizar los materiales o instrumentos necesario para la realización de esta práctica de nivel básico de química orgánica. Al realizar este informe de laboratorio referente a la separación de compuestos por medio de una cromatografía de capa delgada de una hoja, tuvimos como conclusión la separación de los pigmentos de la hoja al realizar el respectivo procedimiento planteado en la guía, además de un buen entendimiento al comprender y adiestrarse en el manejo de la técnica descrita. Al realizar esta práctica de laboratorio concluimos que la técnica es apropiada y bien fundamentada para la separación de compuestos orgánicos la cual al aplicarse a nuestra hoja (árbol de mata ratón) problema evidenciamos la extracción de los pigmentos en la placa o lamina porta objetos y al finalizar pudimos darnos cuenta que la técnica es muy eficiente.

ANEXOS

1. Analizar y explicar los resultados de sus cromatogramas. Dibujar o fotografiar las placas y la posición de las manchas antes y después de la cromatografía.

Las placas que se muestran en la figura podemos evidenciar que la placa la cual tienen un mayor extendido de la muestra la cual esta placa delgada de sílica gel la de al lado es una lámina cromatografía, la comparar la y relacionando con la teoría es muy probable que la placa delgada de silica gel

tienen mayor fase de estacionaria y las muestra más atraídas quedaron más arriba y las menos atraídas abajo teniendo así el extendido que se ve en la figura:

2. ¿En la cromatografía de capa delgada cual es la fase estacionaria y cual la fase móvil?

Fase estacionaria: es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de la cromatografía. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografía en capa fina.

Cromatografía plana; La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son:

Cromatografía en papel

Cromatografía en capa fina

Cromatografía columna; La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:

Cromatografía de líquidos

Cromatografía de gases

Cromatografía de fluidos supercríticos

Fase móvil: es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos o CEC). Un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La fase móvil consiste en la muestra que está siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna.

3. Explique cómo y por qué se separan los componentes de la mezcla de pigmentos.

La separación se debe a que los distintos componentes de la muestra son atraídos con distintas fuerza por la fase estacionaria a medida que fluyen a través de ella. Aquel componente que por sus características es atraído con mayor fuerza por fase estacionaria va quedando atrás mientras el que no es atraído demasiado fuerte va desplazándose hasta más delante de la práctica.

4. Si posee un compuesto impuro y quisiera saber cuántas sustancias están contaminando su compuesto. Explique como lo haría usando cromatografía de capa delgada.

Al realizar el procedimiento respectivo para una cromatografía de capa delgada la cual separa compuestos orgánicos de una muestra sirve para determinar si el compuesto orgánico esta impuro y que sustancias lo están contaminando. Por consiguiente en la placa cromatografía de capa delgada al mirar el extendido de las sustancias en la placa se mostraran puntos o manchas al ser absorbida o atraídas con mayor fuerza por la capa estacionaria, por ende entre menos manchas allá en el extendido menos impura será esas manchas corresponderán a las sustancias que contaminan.

BIBLIOGRAFÍA

Práctica Nº 5. Cromatografía de capa delgada, separación de los pigmentos de una planta. Alonso Marrugo González Profesor Químico-MsC-PhD. Universidad de Cartagena.

Guzmán, D. 2010. Cromatografía en papel. Laboratorio de química orgánica. Universidad Nacional de Colombia. 23-29 Pp.

Chang R.2007.Química.McGrawHill.9 edición.1063Pp.

Morrys R. Boynd R.1998.Química orgánica. Pearson.5 edición.1446Pp.