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Cromatografa

Introduccin

Significa "Escribir en Colores.

Los componentes de una mezcla puedenpresentar una tendencia diferente apermanecer en cualquiera de las fasesinvolucradas.

Es la separacin de dos o mscompuestos qumicos en un medio.

Aspectos histricos de lacromatografa

La tcnica de cromatografa aparece en1850.

El qumico F.F.Runge, que trabajaba con

tintas, descubre que los cationes orgnicos sepodan separar por migracin cuando se

colocaba una solucin que los contena sobreun material poroso, como papel.

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Aspectos histricos de lacromatografa

En 1906 el botnico ruso Tswett utiliz lacromatografa de columna para separar

extractos vegetales coloreados.Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografa.

En 1930 Lederer consigue separar loscolorantes de la yema de huevo.

Los qumicos Khun, Kamer y Ruzuccadesarrollan la cromatografa en el campo de laqumica orgnica e inorgnica.Obtienen el premio Nbel por sus trabajos en 1937,

1938, 1939 respectivamente.

Aspectos histricos de lacromatografa

A partir de 1940 los mtodos cromatogrficosadquieren extensin mundial.En 1940 Tiselius divide los mtodos cromatogrficos en

cromatografa por anlisis frontal, desarrollo por elusiny desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nbelpor sus trabajos en 1948.

Para el mismo tiempo la cromatografacomienza a aplicarse en el campo de labioqumica.Martin consigue separar algunos aminocidos

acetilados.

Conceptos generales

La cromatografa se basa en un conjunto de tcnicasasociadas al principio de retencin selectiva.Permite separar los distintos componentes de una mezcla,

permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichoscomponentes.

Posee: Fase mvil: consiste en un fluido (gas, lquido o fluido

supercrtico). Fase estacionaria: se trata de un slido o un lquido fijado en

un slido.

Los componentes de la mezcla interaccionan en formadiferente con la fase estacionaria y con la fase mvil. Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas

velocidades y se van separando.

Tipos de cromatografa

Cromatografa plana: La fase estacionaria sesita sobre una placa plana o sobre un papel.Las principales tcnicas son:Cromatografa en papel

Cromatografa en capa fina

Cromatografa en columna: La fase estacionariase sita dentro de una columna.Segn el fluido empleado como fase mvil se

distinguen:Cromatografa de lquidosCromatografa de gasesCromatografa de fluidos supercrticos`

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Aspectos histricos de los distintostipos de cromatografa

Cromatografa en papel

Fue desarrolla por Martin.Tiene como soporte un papel de celulosa.

Es una tcnica sencilla y presenta la ventaja depoder utilizar cantidades pequeas de muestra(miligramos y microgramos).

Aspectos histricos de los distintostipos de cromatografa

Cromatografa en capa fina

Fue originada en 1938 por los trabajos de losinvestigadores rusos Izmailov y Schraiberen.

Lograron separar mezclas de tinturas farmacuticas.

En este tipo de cromatografa la faseestacionaria se extiende sobre un soporteinerte (silica).

Stahl estandariz el mtodo para elaborarcapas finas por mtodos mecnicos.

Cromatografa de columna

Consiste en la aplicacin de una muestracompleja a una columna de cristal.Contiene una matriz slida porosa que est inmersa en

el solvente.

Se bombea una gran cantidad de solvente a travs dela columna.

Las diferentes mezclas se van retrasando de maneradistinta segn sus interacciones con la matriz.

Se pueden separar de acuerdo a su carga, suhidrofobicidad, su tamao o su capacidad de unirse agrupos qumicos particulares.

La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobarmediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.

Trminos relacionados con el proceso

Matriz de la columna

Longitud de la columna

Volumen de la columna: volumen totalde gel.

Run Throught: volumen de muestra mas

solvente.

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Aspectos histricos de los distintostipos de cromatografa

Cromatografa de intercambio inico

Esta tcnica apareci durante la II GuerraMundial.

Tena la finalidad de separar los elementos

alcalinotrreos y los elementos de transicin.

En 1938 Taylor y Urey utilizan este mtodopara separar istopos de Litio y Potasioutilizando resinas de zeolita.

En 1939 Samuel logra sintetizar resinas deintercambio inico.

Cromatografa de intercambio inico

Se realiza sobre matrices que tienen una carganeta.Carga negativa: intercambio de cationesCarga positiva: intercambio de aniones

La carga de la matriz de la columna as como lacarga de la muestra depender del pH delsolvente y de su fuerza inica (proporcional a laconcentracin de iones).

Se usa en la separacin de molculas grandes(protenas y cidos nucleicos).Cuando las separaciones exigen condiciones qumicas

fuertes se emplean intercambiadores inicosinorgnicos.

Cromatografa de intercambio inico

FuncionamientoEn unas condiciones determinadas sern retenidas

en la columna las muestras que tengan una carga

complementaria a la de la matriz de la gel, siendoeluidas las restantes.

Para eluir las muestras retenidas se puede variar lacarga inica del solvente o su pH de forma que sealcance el punto isoelctrico de la muestra deinters o el de la matriz, neutralizando de estemodo la fuerza que retiene a la muestra en lacolumna.

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Aspectos histricos de los distintostipos de cromatografa

Cromatografa de gel-filtracinFodin y Porath en 1958 descubren que usando como

fase estacionaria geles se puede separar polmerossintticos de alto peso molecular.

Cromatografa de afinidad.Porath en 1967 utiliza un pptido o protena unida

covalentemente a un ligando y la utiliza para laseparacin de molculas proteicas.

Cromatografa de gas.Es una de las tcnicas ms utilizadas e importantes.

Ha revolucionado el campo de la qumica analtica.

Cromatografa de exclusin

La cromatografa de exclusin molecular o de filtracinen gel, separa las muestras en base a su tamao.

La matriz de la columna esta formada por un polmeroentrecruzado con poros de tamaos determinados.

Las muestras de mayor tamao migran a lo largo de lacolumna con mayor velocidad que las de tamaopequeo.

Las muestras de menor tamao, entran en los poros yse mueven a lo largo de la columna lentamente porquetienen que atravesar los laberintos que se encuentran enel interior de las bolas de polmero en su marcha a lolargo de la columna.

Cromatografa de exclusin

Hay diferentes tamaos de partcula paraun gel:

a menor tamao mayor resolucin y menor

gasto en la columna.

Este tcnica se emplea en la separacinde protenas de alimentos, determinacinde glucosa y fructosa en zumos de fruta,etc.

Caractersticas de las matrices

Deben ser estables.

Tener bajo contenido en grupos inicos.

Uniformidad de poro y tamao.

Los compuestos utilizados pueden serderivados de:Dextranos (Sephadex)

Agarosa (Sepharosa)

Acrilamidas (Biogel P)

Esferas de vidrio

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Cromatografa de afinidad

Permite la separacin de mezclas por su afinidad ocapacidad de unin a un determinado ligando.

Las muestras que se retienen en la columna sonaquellas que se unen especficamente a un ligando que

previamente se ha unido covalentemente a la matriz dela columna.

Despus de que las muestra que no se unen al ligandoson lavadas o eludas a travs de la columna, la muestrade inters que ha quedado retenida en la columna seeluye (se libera) mediante el empleo de una solucinque contiene bien ligando libre u otro compuesto querompa la interaccin entre el ligando y la protena

Ligandos de afinidad

Son las molculas bioqumicas que se encuentranancladas qumicamente sobre el soporte slidoinerte, y son las responsables de la adsorcinespecfica de los solutos-analitos.

Se clasifican segn su:Naturaleza - pueden ser macromolculas biolgicas o bien

molculas de bajo peso molecular.

Actuacin - se fundamenta en la selectividad de la retencinque condiciona las caractersticas de la cromatografa deafinidad. Se distinguen dos grandes grupos: Ligandos especficos , como los anticuerpos , que se enlazan

reversiblemente a un solo soluto.

Ligandos generales enlazados con un determinado grupo decompuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos.

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Electroforesis

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Introduccin

La electroforesis fue desarrollada por primera vez por elqumico sueco Arne Tiselius.Gana el Premio Nbel en 1948 por los trabajos realizados.

La electroforesis es una tcnica analtica de separacinde fundamento cintico basada en el movimiento omigracin de las macromolculas disueltas en undeterminado medio a travs de una matriz o soportereticulado como resultado de la aplicacin de un campoelctrico.

El comportamiento de la molcula viene dado por sumovilidad electrofortica: La movilidad depende de la carga, tamao y forma.Cuanto mayor es la relacin carga/tamao ms rpido migra

un in.

Conceptos generales

La electroforesis es un proceso que se utilizapara separar macromolculas en una solucin.

Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga

neta son colocadas en un campo elctrico, estasexperimentan una fuerza de atraccin hacia el polo queposee carga opuesta.

Las molculas cargadas positivamente se desplazarnhacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadaspositivamente se desplazarn hacia el nodo (el polopositivo).

La friccin con el solvente dificultaran este movimiento originandouna fuerza que se opone , por otro lado, las molculas tienen quemoverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a queposeen energa cintica propia denominado difusin.

Conceptos generales Conceptos generales

Los iones comenzarn a moverse formandoun frente cuya anchura aumentar con eltiempo.

Para reducir la anchura de este frente podemosreducir el movimiento de las molculas empleandoun medio que oponga mas resistencia a dichomovimiento.

Una forma comn de hacer esto es formar un gel.

El gel consiste de un polmero soluble de muy altopeso molecular que atrapa molculas de agua y formaun tamiz que dificulta el movimiento de los solutos.

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Conceptos generales

La velocidad de migracin (v) de lapartcula es directamente proporcional alproducto de su carga efectiva (q) y elgradiente de potencial elctrico (E) einversamente proporcional al coeficientede friccin (f) relativo a la talla y forma dela molcula, o sea, a la resistencia que leofrece el medio.V = q E / f

Mtodos electroforticos zonales

Son los ms comunes, dada su altaaplicabilidad en diferentes campos.

Son tiles para lograr la separacin demezclas complejas.

Se aplican pequeas cantidades de lamuestra a un soporte slido.

Los soportes son en general polmeros yforman un gel poroso que restringe elmovimiento de las molculas a travs delmedio durante la electroforesis y disminuyenlos flujos de conveccin del solvente.

Tipos de soportes

papel (celulosa)

almidn

poliacrilamidaagarosa

acetato de celulosa

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Electroforesis de gel

La electroforesis en gel se utiliza en ladeteccin, control de pureza, caracterizacin,

cuantificacin (por comparacin con controles),preparacin y purificacin (por extraccin debandas desde el gel) de diferentes molculas.

Esta tcnica tiene como ventaja su capacidadde separar macromolculas de inters en laindustria biotecnolgica y qumica.Ha sido un mtodo muy til para la separacin de

protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos (DNAy RNA) con gran resolucin.

Electroforesis de gel

Los geles ms comunes son agarosa ypoliacrilamida.

La electroforesis en gel tiene dosmecanismos de separacin:

por la relacin carga/tamao

por tamao

Electroforesis de agarosa

Permite separar molculas de DNA, cuandostas son sometidas a un campo elctrico yatradas hacia el polo opuesto a su carga neta.

La agarosa es un polisacrido (originalmenteobtenido de algas, como el agar-agar, pero decomposicin homognea), cuyas disoluciones(tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad

de permanecer liquidas por encima de 50grados C y formar un gel, semislido alenfriarse.

Electroforesis de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se forman porla polimerizacin de la acrilamida poraccin de:

Agente entrecruzador ('cross-linking'): bis-

acrilamida

Catalizador: TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina)

Iniciador: in persulfato que se aade en formade persulfato amnico

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Clasificacin

Electroforesis desnaturalizanteLa ms comn: somete a las protenas a migracin

asegurando la completa desnaturalizacin (prdida dela estructura tridimensional).

La migracin es proporcional a la carga y al tamao dela molcula pero no a su forma.

El agente desnaturalizante ms empleado es elsodiododecilsulfato o SDS, un detergente.

Electroforesis nativaEs la que somete a las protenas a migracin sin

desnaturalizacin.

Las protenas migran en funcin de su carga, de sutamao y de su forma.

SDS-PAGE Electroforesis capilar

Es una tcnica alterna a la electroforesis convencional.

Surge debido a que la velocidad de separacin yresolucin de los compuestos mejora a medida queaumenta el campo elctrico aplicado.

Se realiza la electroforesis en un tubo capilar con undimetro interno inferior a 0.1 mm y una longitud de 50cm a 1 m.

El mecanismo de separacin est basado en lasrelaciones carga/masa de los analitos.

Su utilidad est en la separacin de protenas y pptidosentre otras sustancias.

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