Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch...
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Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia
Pedro Bosch Mendoza13 Feb. 2014
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Introducción
Quimioteca de compuestos catiónicos
Ensayos de intercalación
Intercalantes deADN
Ensayos de selectividad de secuencia
Ensayos de fluorescencia
Compuestos fluorescentes
Bases estructurales
de selectividad
Sondas de ADN
RT-PCR
Tinción celular
Ensayos de actividad
antiproliferativa
Potencial antitumoral
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Introducción
N+
X-N+
X-
N
N+N-MSTS
N+N
Br-
N+
TfO-
NH
N+Br-
N+
NN
I-
N
N+N-MSTS
N+
TfO-
N+TfO-
N+
TfO-
N
N+N-MSTS
N
N+
-MSTS
N
Quinolizinio
Sistemas tri , tetra y pentacíclicos
Variación de forma y tamaño N
N+N
MSTS-
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Síntesis
• Condensación de Westphal
NX
R
R1
R1
CH2R
NXH
O
O
R1
R1
CH2R
NAr
++
R =H, EWG
N-Alkylation or
N-Amination Base
X=NH, CHCO2Et
Westphal, O.; Jahn, K.; Heffe, W. Arch. Pharm. 1961, 294, 37-45.J. J. Vaquero, J. Alvarez-Builla, Adv. Nitrogen Heterocycles, 2000, 159-245
N
Me
OH
N
Me
OO
N
Me
CO2H
RR
O
O
OO
N
R
R
O OH
N
R
RN
R
R
OH
Br_
Br_
Br_
Br_
Br_
2. HBr, 100 oC, 1 h
1.Ethyl bromoacetatenBu4NI, Toluene, reflux
HOBt, DIC
Wang resin
DCM/DMF
++Het Het Het
Base, Solvent, rt
+
-CO2
+
Het
+
Het
+
Het
F. Delgado, L. Linares, R. Alajarín, J. Alvarez-Builla, J.J. Vaquero, Org. Lettt. 2006, 4057-4060
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Síntesis
• Metátesis de cierre de anillo
N N
RuCl
Cl
PhPCY3
N N
RuCl
ClO
Grubbs 2º generaciónHoveyda-Grubbs
Núñez; B. Abarca; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. J. Org. Chem. 74, 4166 – 4176, 2009A. Nuñez, A. M. Cuadro, J. Alvarez-Builla, J. J. Vaquero. Org. Lett. 2007, 9, 2977-2980 A. Núñez; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. Chem. Comm. 3, 2690 – 2692, 2006
N+
X-
N+
X- N+
X-
1. GII ó HG2. Oxidación HG
N+
1. GII ó HG2. Oxidación
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Ensayos
• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN• Curvas de fusión• Oligonucleótidos de secuencia definida• Ligando unido: aumento de temperatura de fusión
Intercalantesde ADN
Ensayo de selectividadde secuencia ADN
(preferencia AT vs GC)
Ensayo deIntercalacióncon el ADN
Selectividadvs estructura
V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling EnviadoA. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010
Quimioteca de compuestos catiónicos
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Ensayos
• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN• Curvas de fusión• Oligonucleótidos de secuencia definida• Ligando unido: aumento de temperatura de fusión
V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling EnviadoA. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010
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Ensayos
• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN
N
N+N-MSTS
N
N+
-MSTS
N
N
N+N-MSTS
N+N
Br-
N+
TfO-
NH
N+Br-
Unión ADN
Selectividad GC ó AT
1 No ---
2 Sí AT
3 Muy débil No existe
4 No ---
5 No ---
6 Sí AT
N+
NN
I-
N
N+N-MSTS
N+
TfO-
N+TfO-
N+
TfO-
N
N+N
MSTS-
Unión ADN
Selectividad GC ó AT
7 No ---
8 No ---
9 Débil AT
10 Débil AT
11 Muy débil AT
12 Sí AT
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Máx. emisión
Eficiencia cuántica
1 442 0,33
2 544 < 0,05
3 464 < 0,05
4 461 0,14
5 361 0,23
6 467 0,15
Ensayos
• Fluorescencia:
N
N+N-MSTS
N
N+
-MSTS
N
N
N+N-MSTS
N+N
Br-
N+
TfO-
NH
N+Br-
Máx. emisión
Eficiencia cuántica
7 353 0,18
8 437 < 0,05
9 419 0,15
10 400 0,35
11 398 0,31
12 450 0,25
N+
NN
I-
N
N+N-MSTS
N+
TfO-
N+TfO-
N+
TfO-
N
N+N
MSTS-
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Ensayos
NH
N+Br-
N
N+N
MSTS-
N
N+N
MSTS-12
1
6
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Valoración Fluorescencia
• Materiales– Cromóforos (5% DMSO, 3,9·10-5M) – DNA Timo bovino (10 µl, 4,1·10-3M)
• Procedimiento– Adición de alicuotas de DNA sobre disolución de cromóforo– Tiempo de intercalación: 10 min– Error correspondiente a dilución menor del 5%– Ratio 1:12 cromóforo/DNA
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Valoración Fluorescencia
• Gráficas
N
N+N
MSTS-
N
N+N
MSTS-
1
12
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Valoración Fluorescencia
• Gráficas– Área bajo la curva– Anisotropía de fluorescencia– Constante de unión al DNA
Kb= (6.92.6) 104 M-1
– Pares de bases por cromóforo (n): 5.90.3
N
N+N
MSTS-
N
N+N
MSTS-
12
1
2 2
0 0 0 0 0 0
0
0
0 0
1+ n K[L] K[M] 1+ nK[L] + K [M] 4 nK [L] [M]=
2K n [L]
+I II
I I
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Dicroísmo circular inducido
• Luz polarizada en un plano• Plano formado por 2 componentes en fase• Dicroísmo circular inducido: Transferencia de asimetría
– Cercanía en el espacio– Molécula capaz absorber
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Dicroísmo circular inducido
• Gráficas– Señal correspondiente al
apilamiento de bases y a helicidad.– CD aumenta en presencia de
cromóforo– Este cambio sugiere intercalación
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Dicroísmo circular inducido
• Gráficas
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Nuevos cromóforos
Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998Dyes and pigments 96 (2013) 554-562
N
NH2
N
NAc. p-toluensulfónico
Anh Acético, 3h,RT
1 2
68%
S OOO
NH2
CH2Cl2, 1hRT
N
N+
N
N+
NH2
MSTS-
O OEt
Br-
3
4
65%
59%
O
O
O
O
AcONa
EtOH, 24h, Reflujo
Et3N
EtOH,5h,Reflujo
N
N+N
MSTS-
N
N+
Br-
5
6 22%
BrO
OAcetona (anh)4h, Reflujo
50%
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Nuevos cromóforos
N
NH2
N
NAc. p-toluensulfónico
Anh Acético, 3h,RT.
1 2
68%
Dyes and pigments 96 (2013) 554-562
![Page 19: Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014.](https://reader035.fdocumento.com/reader035/viewer/2022062322/5665b45c1a28abb57c90db9c/html5/thumbnails/19.jpg)
Nuevos cromóforos
Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998
N
N
2
S OOO
NH2
CH2Cl2, 1hRT
N
N+NH2
MSTS-
3 65%
O
O
AcONa
EtOH, 5h,Reflujo
N
N+N
MSTS-
5 50%
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Nuevos cromóforos
N
N+
O OEt
Br-
459%
O
O
EtOH, 24h, Reflujo
Et3NN
N+
Br-
6 22%
BrO
O
Acetona (anh)4h, Reflujo
N
N
2
Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998
![Page 21: Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014.](https://reader035.fdocumento.com/reader035/viewer/2022062322/5665b45c1a28abb57c90db9c/html5/thumbnails/21.jpg)
Nuevos cromóforos
• Perspectivas– Cromóforos funcionalizados– Compuestos con un aumento de fluorescencia al estar unidos al DNA
![Page 22: Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014.](https://reader035.fdocumento.com/reader035/viewer/2022062322/5665b45c1a28abb57c90db9c/html5/thumbnails/22.jpg)
Síntesis del Híbrido Losartán-inhibidor de RAS
![Page 23: Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014.](https://reader035.fdocumento.com/reader035/viewer/2022062322/5665b45c1a28abb57c90db9c/html5/thumbnails/23.jpg)
Híbrido de Losartán
• Introducción– Losartán
• Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona• ARAII
– Inhibidor de RAS• Proteína reguladora• Proteína G monomérica• Activación y proliferación
• Objetivo– Estrategia
N
NHN
Cl
NHN
N N
NC8H17
4
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Híbrido de Losartán
• Síntesis del inhibidor de RAS
NH
Br
OH
N
Br
OH
C8H17
NaH 60%1-bromooctano
DMF, 4h, RT
1 297%
N
OH
C8H17
Ac. m-tolilborónicoPd(PPh3)4
Na2CO3 (2M)
DMF, EtOH,5h, reflujo
385%
NC8H17
NOH
H2N-OH.HClpyr
EtOH,2,5h, reflujo
488%
NiCl2.H2ONaBH4
MeOH, 5min,RT
NC8H17
NH2
547%
J. Med. Chem. 2010, 53, 6838–6850
![Page 25: Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014.](https://reader035.fdocumento.com/reader035/viewer/2022062322/5665b45c1a28abb57c90db9c/html5/thumbnails/25.jpg)
Híbrido de Losartán
• Oxidación de Losartán
A. Avenoza et al. Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 949-957
N
N
OH
Cl
NN
NN
N
N
O
Cl
NN
NN
HCloruro deoxaliloDMSOEt3N
CH2Cl2 (anh)17h, -78ºC
1 2 57%
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Híbrido de Losartán
• Síntesis del Híbrido
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
N
N
O
Cl
NN
NN
H
N
NH2
C8H17
CH2Cl2 (anh),24h, RT
N
NHN
Cl
NN
N N
NC8H17NaBH4
(2eq.)
CH2Cl2/MeOH 1:2(anh), 4h, RT
23
25%
![Page 27: Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014.](https://reader035.fdocumento.com/reader035/viewer/2022062322/5665b45c1a28abb57c90db9c/html5/thumbnails/27.jpg)
Híbrido de Losartán
• Desprotección del Híbrido
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
N
NHN
Cl
NN
N N
NC8H17
TFA
CH2Cl2, RT
N
NHN
Cl
NHN
N N
NC8H17
34
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Híbrido de Losartán
• Perspectivas– Desprotección del grupo tritilo utilizando Pt/C 5% – Se evita la deshalogenación.
Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
N
NHN
Cl
NHN
N N
NC8H17
4