CENTRO DE CIENCIAS BSICASDEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICAACADEMIA DE BIOTECNOLOGA

Cultivo de Tejidos Vegetales

Ing. Bioqumica 6 semestre

Profesora Dra. Norma Chvez Vela

Pablo Rodrigo Snchez HernndezClaudia Georgina Dvila ZamoraCristina Aime Aburto SnchezAlicia Alejandra Mier GonzlezCynthia Alejandra Alba ZavalaRuth Mara Rivera AburtoJos Carlos Bon LpezIxchel Campos Avelar

Fecha de entrega: Martes 10 de junio del 2014

1. Explique detalladamente los pasos que se tendran que seguir para conseguir experimentalmente los mejores resultados de organognesis de un cultivo de tejido vegetal (indique paso por paso las variables y tcnicas de cultivo a desarrollar).

1. Desinfeccin del material vegetalEs imprescindible que los inculos empleados en el cultivo de tejidos vegetales sean aspticos ya que la mayora de las especies presentan contaminantes superficiales e incluso patgenos endgenos, por lo que, de no eliminarse, provocan la prdida total de los explantes.Por lo anterior se lleva a cabo lo siguiente: Predesinfeccin de la semillaPara este paso se puede emplear hipoclorito de sodio comercial, en el cual se sumergen las semillas durante 5 minutos para luego enjuagarse con agua de la llave por 5 minutos ms. Desinfeccin de las semillasBajo una campana de flujo laminar las semillas se colocan en una solucin de perxido de hidrgeno durante 45 minutos con el propsito de eliminar el exceso del agente desinfectante. Despus se realizan tres enjuagues con agua bidestilada esterilizada.Posteriormente las semillas se transfieren a etanol al 70% durante 1 minuto y luego se enjuagan con agua destilada por 5 minutos.Finalmente se sumergen las semillas durante 5 minutos en una solucin al 15% de hipoclorito de sodio, adicionado con 0.5 ml de poliexietileno sorbitan monolaurato (Tween-20) seguido de 3 enjuagues por 5 minutos con agua esterilizada.2. Medio de cultivoDepender del tipo de cultivo a utilizar. Usualmente se emplean medios bsicos como el DCR o el GD, a los cuales se les adicionan componentes orgnicos como glicina, glutamina, etc. As como reguladores de crecimiento; preferentemente en una relacin auxina/citocinina baja, para inducir la formacin de la parte area.Una vez preparados y vaciados en frascos de vidrio se deben esterilizar a 121C y 1 atm de presin por 15 minutos.3. Explante o inculoSe emplean embriones maduros como fuente de inculo, de los cuales se disectan los cotiledones y se siembran en forma horizontal con el propsito de que cada uno de los cotiledones est en contacto con el medio de cultivo.4. Condiciones del cultivo in vitroLas unidades experimentales se colocan en un cuarto de incubacin con un fotoperiodo de 16 horas luz e intensidad 2000 lux, con una temperatura de 26C 2C durante 4 o 6 semanas para la etapa de induccin.

5. Induccin y desarrollo de yemas adventiciasSe evala el nmero de cotiledones que respondieron al tratamiento, es decir, aquellos que presenten visiblemente estructuras nodulares en la superficie.6. Alargamiento de yemasLos cotiledones que presenten primordios de yemas deben ser transferidos a medios DCR o GD pero sin reguladores de crecimiento, con el propsito de acelerar el alargamiento. Deben permanecer ah aproximadamente 6 semanas durante las cuales se evale el nmero de cotiledones que presenten brotes, en donde se observen al menos dos primordios foliares bien desarrollados.7. Formacin de brotesUna vez concluida la etapa de alargamiento de yemas, los explantes se transfieren a medios de cultivo DCR o GD sin reguladores de crecimiento, adicionados con 0.1% de carbn activado. En estas condiciones permanecen por 8 semanas y se evalan el nmero de brotes por cotiledn, el nmero de brotes por embrin y el nmero de brotes mayores a 5 mm.8. EnraizamientoEn esta fase se procede a separa los brotes, tomndose en consideracin nicamente aquellos que midan 5mm o ms. Posteriormente los brotes mencionados se colocan por 2.5 horas en una solucin saturada con 1.75 mg de NAA y 0.20 mg de IBA estandarizada a un pH de 4.5; despus se siembran en medios de cultivo DCR y GD con reguladores de crecimiento auxina/citoquinina en relacin alta para favorecer la formacin de races y con 0.1% de carbn activado, permaneciendo 8 semanas en estas condiciones en el cuarto de incubacin con las mismas condiciones de temperatura y fotoperiodo de las etapas anteriores. Fuentes:Tesis: Induccin de organognesis y embriognesis somtica en Pinus cembroides (Zucc) y Pinus halepensis (Mill). Universidad Autnoma de Nuevo Len. http://eprints.uanl.mx/1803/1/1080071706.PDFhttp://www.uam.es/docencia/LAvanFis/CI/CharlaCultinvitro0607.pdf

2. Seleccione un cultivo de importancia regional y explique detalladamente que tcnicas de CTV se podran aplicar para mejorar la productividad de este. Justifique su respuestaEl maz es una gramnea de produccin mundial, cuya adaptabilidad permite su cultivo en ms de 113 pases. Entre sus principales usos se encuentran la alimentacin humana, animal y produccin de almidones; por otra parte, es un insumo para la elaboracin de aceites, pinturas, caucho y jabones, entre otros.

En Mxico es el principal cultivo, dada su importancia en la ingesta diaria de la poblacin. No obstante, de los ms de 30 millones de toneladas que se consumen anualmente, solo 21.5 millones son producidas nacionalmente. Es decir, somos deficitarios en cerca de 28.1% del consumo nacional aparente. Por estas razones, sera recomendable modificar el cultivo, agregando un regulador de crecimiento vegetal. Para poder realizarlo se debe tener en cuenta que la respuesta del cultivo depende de su estado fisiolgico, su origen y tipo celular. Tambin se puede realizar una micropropagacin que es una tcnica muy utilizada en cultivos de importancia econmica. Permite cultivar clulas, tejidos, rganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos de forma rpida. As, a partir de una planta madre se obtienen numerosos explantes que, sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darn lugar a nuevas plantas iguales a la planta original, permitiendo su multiplicacin. La creacin de cultivos con resistencia intrnseca al estrs bitico y abitico, ayudara a estabilizar la produccin anual. Se estudiara las principales condiciones que afectan el crecimiento del maz, o los virus ms persistentes y en base a eso se realizaran las modificaciones adecuadas.

3. Investigue y reporte al menos cuatro investigaciones que se estn haciendo o se hayan hecho en la regin y que involucren CTV.NombreObjetivoTipos de RCVConcentraciones de RCV

El cultivo in vitro como herramienta para el aprovechamiento, mejoramiento y conservacin de especies del gnero Agave (2008) MC. Manuel Salvador Domnguez Rosales, Bil. Ma. de la Luz Gonzlez Jimnez ,Citlalli Rosales Gmez, Csar Quiones Valles, Silvestre Delgadillo Daz de Len,Silvia Julieta Mireles Ordaz ,Dr. Eugenio Prez Molphe BalchPropagacin masiva in vitro de varias especies de Agave Cinetina (Cin)1.5 mg/L

Benciladenina (BA)1 mg/L 2.0 mg/L

6-,-Dimetilalilaminopurina (2iP)1.0 mg/L-2.0 mg/L

Tidiazurn (TDZ)0.1 mg/L

Metatopolina (MT)1 mg/L

Estudio de la produccin de Betelainas en cultivos in vitro de cactceas del genero MammillariaLAQB Leticia del Roco Morones Ruiz, Pas. Bil. Axel Flores Serna, TLQ Martha Evelia Prez Reyes, IBQ Hugo J. Lizalde Viramontes, MC Eugenio Prez Molphe Balch.Estudiar la produccin in vitro de betalanas bajo diferentes sistemas de cultivo de tejidos de cactceas del genero Mammillaria , as como estudiar la posibilidad de incrementar dicha produccin mediante la adicin de compuestos orgnicos al medio de cultivo y la seleccin de lneas celulares altamente productoras de pigmentos.Ac. indolactico0.1, 1.0 y 2.0 mg/L

Ac. 2,4.diclorofenoxiactico

Ac. Indobutirico

Desarrollo de sistemas para la propagacin masiva del clavel (Dianthus caryophyllus) y del ave del paraso (Strelitzia reginae) a travs del cultivo de tejidos vegetalesTLQ Martha Evelia Prez Reyes, MC Eugenio Prez Molphe Balch, IBQ Hugo J. Lizalde Viramontes, M.C. Rafael Gutierrez CamposPresentar una alternativa para resolver los problemas que presenta la propagacin del clavel y del ave del paraso.Cinetina2 mg/L

Ac. Naftalenactico0.2 mg/L

Ac. Indolactico0.5 mg/L

Seleccin de un medio de cultivo adecuado para producir pigmentos al cultivar races normales de Betabel (Beta vulgaris)Seleccionar un medio adecuado para cultivar races normales y poder posteriormente compararlo con los de produccin por races trasformadas.ANA (cido naftalenactico)0.1 mg/L

4. Indique y explique los principales problemas que se asocian a CTV, cmo pueden corregirse estos?a. Contaminacin: sucede con mucha frecuencia porque los medios que se utilizan son muy ricos, en los cuales puede crecer una amplia gama de microorganismos. Entre estos se encuentran los inmediatos: virus, bacterias, micoplasmas y hongos, que se manifiestan al poco tiempo de montar el cultivo y los crpticos o subliminales para los que el medio no es tan adecuado y su crecimiento se nota mucho tiempo despus de establecido el cultivo.Las fuentes de contaminacin suelen ser dos, externa cuando proviene del material y el ambiente en el que se manipulan los tejidos e interna cuando los mismos microorganismos presentes de forma natural en la planta crecen con ella al cultivarla in vitro.Para evitar contaminacin externa se debe trabajar en un rea axnica, idealmente una campana de flujo laminar todas las manipulaciones que impliquen la exposicin de los tejidos o del medio de cultivo; esterilizar todos los instrumento utilizados para la manipulacin de los tejidos antes de hacer uso de ellos, en autoclave y con alcohol al 70% para pasarlos despus por la flama; guardar los frascos en un ambiente libre de polvo y de corrientes de aire durante el periodo de incubacin, perfectamente cerrados o con una membrana en la tapa tan delgada que permita el intercambio de aire con el exterior, impidiendo la entrada de agentes externos.Dentro de la contaminacin interna tambin existe una subdivisin entre los microorganismos endofticos cuyo hbitat se encuentra dentro de los tejidos vegetales y aquellos organismos que habitan en el exterior de la planta. Para los primeros se cuenta con la opcin de utilizar antibiticos o aislar y cultivar meristemos sometidos a quimioterapia o termoterapia. Para los segundos se aplican mtodos de esterilizacin superficial del tejido, usando compuestos qumicos capaces de eliminar a los microorganismos, aplicados uno tras otro con el fin de potencializar su efecto disminuyendo el tiempo de exposicin, dando un lavado previo con agua y jabn a los explantes, usando vaco o un detergente suave para que penetre ms fcilmente, pretratar a las plantas madre con fungicidas y tenindolas en un ambiente lo ms limpio posible; otra alternativa es la utilizacipon de cultivos axnicos, estos se obtienen esterilizando semillas y germinndolas en condiciones aspticas para obtener plntulas de las que a su vez se obtienen explantes y si algn explante es muy proclive a la contaminacin entonces se inocula con 1 o 2 explantes por recipiente para que la contaminacin no afecte al resto del cultivo. b. Vitrificacin: la planta adquiere un aspecto vtreo, con una pared celular delgada y poco lignificada, grandes espacios intercelulares llenos de agua, deformaciones en la cutcula y atrofia de los estomas. Se cree que el proceso es favorecido por el exceso de nutrientes, especialmente los carbohidratos, altos niveles de RCV, baja intensidad luminosa, alta humedad relativa y alta disponibilidad de agua en el medio. Las plantas pueden prosperar in vitro, pero no in vivo. Se puede evitar parcialmente utilizando altas concentraciones de agar en el medio, aadiendo polietilenglicol, reduciendo la concentracin de RCVs y utilizando algunos compuestos como el floroglucinol. c. Oxidacin: al herir la planta para obtener un explante, el tejido herido excreta gran cantidad de compuestos fenlicos que intervienen en el proceso de cicatrizacin y que son oxidados, creando quinonas que son txicas y pueden provocar la necrosis de todo el explante. Hay cinco medidas que pueden tomarse: la primera, cortar los explantes y colocarlos en agua estril que se cambiara peridicamente, el agua puede estar adicionada o no con un antioxidante; segunda, agregar antioxidantes al medio de cultivo; tercera, usar en el medio de cultivo agentes que absorben los compuestos fenlicos excretados; cuarta, incubar a bajas temperaturas los primeros das y sub-cultivar con frecuencia y quinta, dar un pre-tratamiento con fro a los explantes antes de inocular.Fuente:Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes: Editorial de la UAA.

5. Seleccione un cultivo de inters nacional e indique las mejoras genticas que se estn haciendo o que se le hayan hecho, aclarando que sistema de transformacin gentica se utiliz.6. Importancia, aplicacin, ventajas y desventajas del cultivo de races.Importancia: las races son rganos muy importantes para la suprvivencia de la planta, ya que realizan funciones como la absorcin y el transporte de agua y nutrientes, adems de tener valor comercial porque algunas de ellas son consumidas por los humanos. Representan tambin uno de los primeros logros importantes dentro del cultivo de tejidos vegetales, con amplias posibilidades de aumentar su importancia econmica gracias a las nuevas tcnicas que involucran a Agrobacterium rhizogenes.Aplicaciones: Estudio de los procesos metablicos qu se relaconan con el metabolismo de carbohidratos, vitaminas, reguladores del crecimiento y absorcin y translocacin de nutrientes. Estudios de diferenciacin y desarrollo de las races y en laninteraccin de estas con otros organismos como Rhizobium y nematodos parasitos. Estudio de sntesis de compuestos secundarios de inters para la posible produccin masiva in vitro de los mismos. Transformacin gentica con A. rhizogenes.Ventajas: Algunos tipos de races pueden mantenerse in vitro por tiempo indefinido o por periodos muy largos de tiempo. Cuando se transforma con Agrobacterium hay estabilidad gentica y bioqumica, crecimiento rpido, capacidad biosinttica similar a las races de la planta completa, se puede establecer cultivo en fermentadores y es posible la manipulacin gentica.Desventajas: Se deben regular los RCV exgenos para evitqr que la raz se diferencie. Agrobacterium nicamente transforma dicotiledneas. Para la produccin y obtencin de metabolitos secundarios en biofermentadores est limitado nicamente a aquellos que se sintetizan en la raz.Fuente:Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes: Editorial de la UAA.

7. Importancia, aplicacin, ventajas y desventajas del cultivo de embriones somticos.Importancia: los embriones somticos demuestran la pluripotencialidad de las clulas vegetales, ya que ciertas clulas, bajo ciertas condiciones de cultivo in vitro tienen la capacidad de formar embriones mediante un proceso muy similar a la embriognesis cigtica, teniendo tambin la capacidad de formar una nueva planta despus de un proceso de germinacin.Aplicaciones: Semillas artificiales en las que el embrin est envuelto en una matriz de nutrientes, con cido abscsico como retardador. Obtencin de clones de la planta madre.Ventajas: Mayor productividad respecto al nmero de plantas producidas. No hay variabilidad se pueden realizar estudios de gentica Origen unicelular, es una va de regeneracin aplicable a la transformacin gentica.Desventajas: Se puede hacer en un menor nmero de especies que la organognesis, porque es un fenmeno en apariencia ms complicado. Su germinacin slo ocurre in vitro o cuando se les proporcionan depsitos artificiales de nutrientes. No todas las especies tienen clulas inducibles que se puedan transformar a prioembriognicas. Se debe mantener un cuidadoso control de los RCVs durante todo el proceso.Fuente:Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes: Editorial de la UAA.

8. Importancia, aplicacin, ventajas y desventajas del cultivo de tejido calloso.Importancia: Se le denomina as a una masa amorfa de clulas vegetales poco diferenciadas y de rpida proliferacin. Se obtiene y mantiene con facilidad in vitro, con la posibilidad de usarlo para obtener clulas de cultivo en suspensin o para la regeneracin de plantas.Aplicaciones: Modelo para estudios de metabolismo celular, produccin de compuestos secundarios, fitotoxicologa y ultraestructura celular. Estudio de mecanismos celulares de respuesta a condiciones de estrs. Cultivo de donde se obtienen las clulas en suspensin. Paso intermedio en la regeneracin de plantas por organognesis o embriognesis somtica.Ventajas: Es inducible en casi cualquier tejido vegetal. Alta friabilidad (tendencia de las clulas a separarse unas de otras). Puede mantenerse tiempo indefinido si se subcultiva con frecuencia. Debido a las variaciones genticas es posible regenerar plantas fenotpicamente diferentes a la original, sirve para programas de mejoramiento gentico en los que la variabilidad gentica natural est muy reducida.Desventajas: Demanda subcultivos frecuentes, de lo contrario se presenta agotamiento de los nutrientes, desecacin del medio e incluso la necrosis. Difcil determinacin de la tasa del crecimiento, lo que dificulta conocer las efectos de los RCVs aadidos, dificultando tambin el saber la concentracin ptima de los mismos. Aparicin de cambios genticos y epigenticos que causan una prdida progresiva de la capacidad morfognica de los tejidos, afectando los estudios genticos y la capacidad de regeneracin de plantas a partir del mismo. Fuente:Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes: Editorial de la UAA.