CURSO FISIOLOGÍA GENERAL

MANTENCIÓN DE LOS GRADIENTES IONICOS

Daniel Wolff 2008

TRANSPORTE ACTIVO

 

TRANSPORTE ACTIVOIntroducción.Origen del concepto: fue creado por Rosenberg y Ussing (1948, 1949) para explicar dos procesos fisiológicos que se dan a distinto nivel:

a.- Regulación del medio interno (homeostasis iónica) en animales acuáticos.

Los anfibios y peces de agua dulce viven en un medio hipotónico. Están constantemente perdiendo sales y ganando agua. Por lo tanto, poseen mecanismos activos para captar sales a través de las branquias o la piel.

Los peces de agua de mar se ven enfrentados a una situación opuesta. Están constantemente enfrentados a la pérdida de agua y entrada de sales a través de la piel, branquias, intestino, etc. Para compensar la pérdida de agua deben extruir activamente sales. Este proceso requiere energía.

TRANSPORTE ACTIVO

b.- La homeostasis iónica en las células de eucariontes y procariontes.Las células mantienen una asimetría iónica entre el interior y el exterior y una diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana celular. La concentración de K+ es más alta en el interior y lo contrario ocurre con el ión Na+. Se ha determinado que al inhibir el metabolismo las células pierden K+, ganan Na+ y agua. Esto sugiere la existencia en las células mecanismos para mantener activamente estos gradientes de concentración y de potencial eléctrico: transporte activo.

K+ Na+

V

Ca2+ = 1 mM

Ca2+ = 0,1 μM

Aspectos Termodinámicos del Transporte Activo.

Definición: existe transporte activo de un soluto S (i.e. ión) si este se mueve en contra de su gradiente de potencial electroquímico, i, y su transporte está acoplado a reacciones bioquímicas celulares.

Si hay dos compartimentos 1 y 2 que contienen un soluto S (ej. un ión).

S (1) S (2)

 El potencial electroquímico de un ión i está dado por la siguiente expresión:  

i = 0 + RTln Ci + zF Si : i(1) i(2) , entonces : 0 + RTln Ci(1) + zF1 < 0 + RTln Ci(2) + zF2

   i = i(2) - i(1)

El transporte activo implica un aumento en el potencial químico i del soluto

transportado.y el cambio de energía libre del proceso es entonces 0: 

G(ti ) = RT ln[Ci(2)/ Ci(1)] + zF(1 - 2) 0 

Los procesos espontáneos ocurren en el sentido de una disminución de la energía libre G, o sea que G < 0.

Dado que i(1) I(2), entonces G(ti ) 0; esto significa que el

proceso no es espontáneo.

Para que el proceso de transporte activo ocurra, éste debe estar acoplado a un proceso bioquímico cuyo G < 0, de modo que la suma:

nG(ti) + G(qi) 0

n = coeficiente estequiométrico (moles de soluto transportado /moles de sustrato consumidos).

Para realizar el transporte activo de los iones las células poseen mecanismos moleculares que lo impulsen: bombas de iones.

Si la célula fuera un sistema cerrado se llegaría a un equilibrio en que se cumpliría :

nG(ti ) + G(qi ) = 0

Sin embargo…….…………..

transporte pasivo transporte activo

Modelo de bomba y fuga

…… las células son sistemas termodinámicos abiertos, es decir que intercambian materia y energía con el medio: en la práctica no se llega a un equilibrio por que los gradientes iónicos creados por las bombas tienden a disiparse continuamente a través de vías de fuga o “leaks”.

Por lo tanto, para mantener estos gradientes la célula debe consumir continuamente energía que proviene principalmente de reacciones bioquímicas muy exergónicas.

Modelo de bomba y fuga

Sustrato

Producto

Ejemplo

a.- Calcule la energía libre, G(tNa), necesaria para remover 5 pmoles (5 x 10-12 moles) de Na+ desde el interior de una célula nerviosa de calamar. Las concentraciones externas e internas de Na+ son 430 y 40 mM respectivamente, y el potencial de reposo de la fibra = (i - e) = -60 mV a 20 oC.

G(ti ) = RT ln [Ce/Ci] + zF(e - i)

R = 8,31 J mol-1 oK-1, F = 96.500 C mol-1, T = 293 oK

G(tNa) = RT ln([Na+]e/ [Na+]i) + zF(e - i)

G(tNa) = 8,31 J mol-1 oK-1 x 293 oK x ln(430 x 10-3/40 x 10-3) + 96,5 x 103 C mol-1 x 60 x 10-3 V

G(tNa) = [8,31 x 293 x 2,375] + [96,5 x 103 x 60 x 10-3] J/mol

G(tNa ) =[ 5.783 + 5.790] J/mol =11.573 J/mol

G(tNa ) = 11.573 J/mol x 5 x 10-12 mol = 5.7865 x 10-8 J

b.- ¿Cuál sería el valor de G(tNa), si el potencial de membrana fuera +60 mV?

G(tNa) = 8,31 J mol-1 oK-1 x 293 oK x ln(440 x 10-3/40 x 10-3) – 96,5 x 102 C mol-1 x 60 x 10-3 V

G(tNa) = [8,31 x 293 x 2,375] J/mol - [96,5 x 103 x 60 x 10-3] J/mol

G(tNa) = 5.783 – 5.790 = ~0 J/mol

Criterios de Transporte Activo 

a) H. Ussing introdujo la medición de la razón (f ) de flujos unidireccionales(*) de un soluto x : 

Jie Ci

f =  = exp zF/RT Jei Ce

[*: los flujos unidireccionales (moles/s cm2)pueden medirse con radioisótopos de los solutos, siempre que se conozca la actividad específica (cpm/mol) ]

b) Generación de un gradiente de concentración del soluto transportado debido

al funcionamiento del sistema de transporte activo.

Sistemas de transporte activo Sistemas de transporte activo primario: Son aquellos en los que la

energía para el proceso proviene directamente de una reacción bioquímica como la hidrólisis de un compuesto cuyo ΔG(qi) < 0. Ejemplos de estos

sistemas son el transporte activo acoplado de Na+ y K+ y de transporte activo de Ca2+ en células de eucariontes. 

Sistemas de transporte activo secundario: En éstos la fuente de energía para el transporte activo es el gradiente de potencial electroquímico generado por un soluto que se transporta por transporte activo primario. Ejemplos : transporte activo de azúcares y aminoácidos acoplado al transporte de Na+ en intestino delgado y la extrusión de Ca2+ en intercambio con Na+ en neuronas y células musculares.

Transporte activo primario Transporte activo acoplado de Na+ y K+ en células animales.  Uno de los sistemas más utilizados para estudiar el transporte activo primario ha sido los glóbulos rojos humanos. Son células aisladas, abundantes (aprox. 5 millones por mm3 de sangre), fáciles obtener y son homogéneos. Tienen la desventaja de que poseen pocos sitios de T.A.

Concentraciones de iones en el plasma y en GRs humanos [mM]:

K+ Na+ Cl- HCO3- ECl EK ENa [mV]

Plasma 5,4 144 111 28Célula 150 20 75 20 -9,9 -84,0 +43,1 -9,0

Como puede observarse, en los glóbulos rojos los cationes no están en equilibrio termodinámico, pero si lo están los aniones :

[Cli-]/[Cle

-] = [OHi-]/[OHe

-] = [HCOi3-]/[HCOe

3-]

Acoplamiento de los flujos de Na+ y K+ en eritrocitos.

En 1941 Harris y Danowski y luego Harris y Maizels en 1952 estudiaron la extrusión de Na+ y la acumulación de K+.Observaron que:

1.- eritrocitos mantenidos a 2 - 5 oC ganaban Na+ y perdían K+.

2.- a 37 oC en presencia de glucosa extruían Na+ y reacumulaban K+

(Figura). 3.- la velocidad de extrusión de Na+ era función de la [Nai

+] …y ……!!de la [Ke

+]!!.

Este resultado constituía una fuerte evidencia del acoplamiento entre estos dos procesos.

El estudio del transporte activo de Na+ y K+ avanzó notablemente con :a) el hallazgo por Schatzmann (1956) que drogas cardiotónicas como estrofantidina y ouabaína (glicósidos cardíacos) inhibían específicamente el T.A. de Na+ y K+, sin interferir con la glicólisis. b) el desarrollo por Hoffman de la preparación de fantasmas de eritrocitos.c) el uso de los radioisótopos 40K+ y 22Na+ para medir flujos de estos iones.

Acoplamiento de los flujos de Na+ y K+ en eritrocitos.

Glynn en los 1960`s mostró que el flujo de entrada de K+ sigue una cinética compleja que puede interpretarse compuesta de dos mecanismos separados: uno lineal difusivo y otro saturante y dependiente del metabolismo

partially

Glucose absent

Inhibidores de sistemas de transporte

Garrahan y Glynn, y Sachs y Welt (1967) estudiaron el acoplamiento de los flujos activos de Na+ y K+. Preincubaron células con 22Na+ y los suspendieron en medios con diferentes [Ke

+].Midieron la salida activa de Na+ en función de la concentración externa de K+ :

[Na+i](t) = [Na+

i](0) exp(-kNa t).

También encontraron que la constante de velocidad de la salida activa de Na+,

kNa, era una función sigmoídea de la [Ke

+]

20 mM-K

Por otra parte, la captación activa de K+ seguía una cinética de saturación en función de [Ke

+]

Estequiometría de la bomba. Post y Jolly (1957) midieron la velocidad de extrusión de Na+ de eritrocitos humanos cargados de cantidades variables de este ión, en función de la concentración de K+ externo. Demostraron que al graficar el incremento de [K+

i] versus la disminución de [Na+

i] los puntos experimentales caían en una línea cuya pendiente era 2/3: indicando una acumulación de 2 K+ por la extrusión de 3 Na+

Fuente de energía para el transporte activo de Na+ y K+.

En 1954 Gárdos demostró en GRs resellados que la acumulación de K+ era dependiente de ATP (interno) que se hidrolizaba en el proceso.

En 1955 Hodgkin y Keynes observaron que al tratar axones gigantes de calamar con DNP 0.2 M o CN- (Caldwell y cols. 1960) se inhibía el flujo de salida de 24Na+.

Al perfundir la fibra con arginina fosfato o ATP se observaba un incremento en la extrusión de Na+

ATP

Estequiometría de la bomba

Se demostró que la estequiometría total de la bomba es: 3 Nai+ : 2

Ke+ : 1ATP.

3 Nai+ + 2 Ke

+ + ATPi + H2O 3 Nae+ + 2 Ki

+ + ADPi+ Pi

  Gtotal = 3 GNa + 2 GK + 1 GATP < 0

El número de sitios para Na+ se puede determinar midiendo los flujos activos de este catión en función de su concentración interna:

Jmax [Nai

+]n

JNa+ =

KNa + [Nai+]n

De esta relación se determinó que el número de sitios para la bomba de Nai

+ era n = 3.

Bioquímica del transporte activo de Na+ y K+.

En 1958 J.C. Skou obtuvo una preparación de vesículas de membrana de nervio de patas de cangrejo que presentaba actividad ATPásica, requería Mg2+, Na+ y K+ y era inhibida específicamente por ouabaína.

Mg2+, Na+ y K+

Microsomas + ATP ADP + Pi

Skou: Dependencia de la actividad de la Na/K ATPasa de la concentración de Na+ y K+

μg P

i

Mg2+, Na+ y K+

Microsomas + ATP ADP + Pi

Lo que medía Skou era la producción de fosfato inorgánico

Skou: obtuvo el Premio Nobel en 1997 por sus trabajos en la Na/K ATPasa

(a)

Ciclo catalítico de la Na+-K+ ATPasa

Skou, Post, Albers y otros investigadores (1960s-1970s) demostraron en una serie elegantes experimentos que la reacción de la Na+-K+ ATPasa  ocurre en varias etapas :1.- Transferencia del fosfato terminal del ATP a un residuo aspartato de la enzima. Esta fosforilación requiere de la presencia de Na+ y Mg2+.2.- La enzima fosforilada sufre un cambio conformacional (E1-E2). Paso inhibido por oligomicina y NEM agente modificador de grupos sulfhidrilos.3.- La enzima se desfosforila liberándose Pi. Se requiere la presencia de K+ y Mg2+ y es inhibida por ouabaína. 4.- La enzima pasa de E2 - E1

Esquema de reacción

Mg2+ Mg2+

3Nai++ E1 E1(Nai

+)3 + ATP E1(Nai

+)3ATP E1(Nai+)3P + ADP

  Mg2+ Ke

+

E1(Nai+)3P E2(Nai

+)3P E2 + 3Nae+ + Pi + 2Ki

+

 E2 E1

Mecanismo del transporte activo de Na+ y K+:

1.- durante los cambios conformacionales la proteína expone alternadamente sitios de unión de estos iones a uno y otro lado de la membrana (análogo a los transportadores).2.- tres iones Na+ se unen con alta afinidad a sitios en el lado citoplasmático de la proteína.3.- se une ATP (complejado con Mg2+) al sitio de fosforilación.4.- El ATP se hidroliza a ADP y el grupo fosfato es transferido a un grupo aspartato de la enzima (E1-P). La fosforilación activada por Na+ le da a la enzima una conformación “ocluida” : los iones Na+ quedan “encerrados” en la proteína.5.- la ATPasa sufre un cambio conformacional desde (E1-P) al estado (E2-P), más estable.6.- los iones Na+ son transportados a través de la proteína hasta ligarse débilmente a sitios que se forman en el lado externo de la membrana y se liberan al exterior.7.- la forma E2-P de la enzima es de baja energía y la unión del dos iones K+ a sitios externos de la proteína acelera su desfosforilación.8.- los iones K+ pasan a través de la proteína y son liberados al medio citoplasmático

Por formar un intermediario fosforilado a esta enzima se le ha clasificado dentro de las ATPasas de membrana tipo P.

Esquema del ciclo de transporte de Na+ y K+ por la bomba de sodio

K+ release(intracellular)

Lodish et al. 2004

Evidencias de identidad entre la bomba de Na y la Na+-K+ ATPasa 

1.- ambas funciones se encuentran en las membranas plasmáticas

2.- se requiere de la presencia simultánea de Na+ y K+ para inducir el transporte activo y la hidrólisis de ATP.

3.- a [Na+] saturantes, la [K+] necesaria para obtener ½ de Vmáx (Pi) es la

misma que para obtener ½ JK+máx,, o sea: Kmbomba = Km

ATPasa.

4.- ambas funciones son inhibidas por ouabaína en el mismo rango de concentración.

5.- la actividad de transporte activo de Na+ y K+ puede ser reconstituida incorporando la proteína Na+-K+ ATPasa purificada en liposomas.

Estructura química de la bomba de Na

En los 1970´s se desarrollaron métodos para solubilizar y purificar proteínas integrales de membrana usando detergentes (i.e. Triton X-100).

La bomba de Na fue una de las primeras proteínas de membrana en ser purificada y ha sido aislada de médula renal, cerebro, órgano eléctrico de anguila, etc.

Sitios de bomba en diferentes tipos de células:  en eritrocitos humanos hay 1 sitio/m2, en riñón 102, en cerebro 103 y en el órgano eléctrico de Torpedo 104.

.

Estructura química de la bomba de Na

La enzima ha sido disociada en dos subunidades: , de 110 kDa (1000 AA) y un glicopéptido, , más pequeño de alrededor de 55 kDa. La subunidad contiene el residuo aspartil fosforilable y el sitio de unión a oaubaína las funciones catalíticas están en la subunidad .

La estructura primaria de las subunidades y fue deducida a partir de las secuencia de cDNA de células de órgano eléctrico de Torpedo (Numa, 1986).

Los segmentos de la cadena polipeptídica que potencialmente pueden tener una estructura de hélice pueden ser identificados mediante los diagramas de hidropatía. La energía libre (ΔG) requerida para transferir segmentos sucesivos (aprox. 10 AA) de la cadena desde un solvente no polar al agua se calcula de la composición aminoacídica de cada segmento.

Perfiles de Hidropatía

Alberts et al. 2002

Estructura química de la bomba de sodio

Sitios de glicosilación Subunit

Sitio de fosforilación As369

A partir de los perfiles de hidropatía se han deducido 10 segmentos de trasmembrana para la subunidad de la Na+-K+ ATPasa.

rizo central (dominios P y N) dominio A

Estructura de la bomba de sodio

La cadena posee 10 segmentos de transmembrana unidos por 5 cortas asas extracelulares (análogo a otras ATPasas tipo P) y está muy conservada.

La fosforilación ocurre en un residuo Asp (369 en humano y 376 en electroplax) en un bolsillo de 7 AA que contiene la secuencia AspLisTreGliTre (presente en todas las ATPasas tipo P), 30 residuos del término de M4.

Hay un gran rizo (loop) central entre M4 y M5 (430 AA), una larga cola N terminal (90 AA) y un lazo intracellular de 120 AA entre M2 y M3.

Estos forman diferentes dominios: N, P y A. Los dominios N (unión a nucleótido) y P (de fosforilación) están formados por el rizo M4M5 y el dominio A o “activador”, está formado por el asa M2M3 y la cola N terminal.

citosol

extracelular

Estructura de la bomba de sodio

La subunidad tiene un solo segmento transmembrana. Está compuesta de 370 AA y expone la mayor parte de su estructura muy plegada al exterior (300 AA). Su función aún no se conoce pero se piensa que se requiere para el adecuado plegamiento de la proteína y su destinación a la MP. Se supone que la unión de las dos subunidades ocurre en el RE.

La enzima funcional parece estar formada por dímeros de . Se ha demostrado la existencia de 4 isoformas de las sub unidades (1, 2, 3 ,4) y 4 de la (1, 2, 3, 4). Estas isoformas difieren en su

afinidad por la ouabaína, Km : 10-4 - 10-7 M.

Esquema del ciclo de transporte de Na+ y K+ por la bomba de sodio

K+ release(intracellular)

Lodish et al. 2004

 Funciones de la bomba de Na.

El transporte acoplado de Na+ y K+ aparece hace como 600 x 106 años. Esta bomba tiene un rol fundamental en las células animales en diversas funciones :

1.- Es responsable de la asimetría en las concentraciones intra y extracelulares de Na+ y K+.

2.- Varias enzimas del metabolismo intermediario y de la síntesis de proteínas requieren altas concentraciones de K+ para su actividad óptima; varias son inhibidas por alta [Nai

+].

3.- Estas asimetrías iónicas son responsables de la mantención de la diferencia de potencial eléctrico (de reposo) a través de la membrana celular y de los fenómenos bioeléctricos esenciales en la función de las células excitables como nervio y músculo.

4.- La asimetría en [Nai+] y [Nae

+] establecida por la bomba energetiza el transporte activo secundario de diferentes solutos: i.e. cotransporte glucosa/Na+ y aminoácidos/Na+ en intestino, y el intercambio Na+/Ca2+ en nervio y músculo.

5.- Otra función vital de la bomba de Na en células animales es mantener la osmolaridad intracelular equilibrada con la exterior lo que hace que se mantenga regulado el volumen celular.

Bombas de Ca o Ca2+-ATPasas

Las bombas de Ca o Ca2+-ATPasas también pertenecen grupo de ATPasas de membrana tipo P. Están presentes en la MP y en organelos como retículo endoplásmico y sarcoplásmico (SERCA) y el aparato de Golgi. Juegan un papel importante en la homeostasis celular de este ion.

Las SERCAs están constituidas por una sola cadena polipeptídica de 110 kDa. En cada ciclo catalítico se transportan 2 iones Ca2+ por cada ATP hidrolizado e intercambian 2H+ por 2 Ca2+. La Ca2+-ATPasa de MP tiene una estequiometría de 1:1 respecto al ATP e intercambia 1H+ por 1Ca2+.

Esquema de reacción:

El modelo más aceptado del mecanismo catalítico de estas Ca-ATPasas es el siguiente :

Mg2+

2Cai2+ + E1 E1(Cai

2+)2 + ATP E1(Cai

2+)2ATP E1(Cai2+)2 P +

ADP

E1(Cai2+)2P E2(Cae

2+)2P E2 P + 2Cae2+

  E2 P Pi + E2 E1  

Rojas P., Surroca. A., Orellana A. & Wolff, D, 2000

Determinación de los parámetros cinéticos en la bomba de Ca2+ de A. de Golgi y RE

Topología de la bomba de Ca2+ tipo SERCA con sus dominios funcionales más importantes

dominio de hoja

Dominios hélices transmembrana

aspartato (351) del sitiocatalítico de unión a ATP

Tallos dominios hélices

Dominio citoplasmáticode unión a ATP

lisina

Corta cola carboxi terminal

unión a TG

CITOSOL

Estructura de la bomba de Ca2+ tipo SERCA

N

A

citosol

P

unión deTG

citosol

lumen

membrane

Vista desde el lumen del RE. Los dos iones Ca2+ (verde) están coordinados por Val304, Ala305, Ile307 and Glu309 (M4), Asn768 and Glu771 (M5), Thr799 y Asp 800 (M6), and Glu908 (M8). El grupo carboxilo de la cadena lateral de Asp 800 participa en la coordinación de ambos iones Ca2+.

Sitios de coordinación de iones Ca2+ de la Ca2+-ATPasa.

Transporte de iones Ca2+ en la bomba de calcio SERCA

Alberts et al. 2000

ATPasas de membrana tipo V.

Están presentes en las membranas de las vacuolas y en organelos como lisosomas, retículo endoplásmico, cisternas del aparato de Golgi y vesículas cubiertas, bombean electrogénicamente H+ desde el citosol al lumen del organelo.

Tienen una estructura constituida por un dominio hidrofóbico ubicado en la membrana (V0) que constituye la vía de transporte de protones y una cabeza (V1) hidrofílica que está orientada hacia el citoplasma y donde se realiza la hidrólisis del ATP.

H+

H+

lumen

citosol

V0

V1

ATPasas de membrana tipo V.

La forman siete tipos de subunidades diferentes con un PM total de entre 400 y 500 kDa. Los procesos de transporte de H+ e hidrólisis de ATP están separados y durante el ciclo de transporte no se fosforilan.

Múltiples genes podrían codificar isoformas con propiedades específicas requeridas para servir las diferentes funciones de vacuolas y endomembranas.

H+

H+

e- H+ H+

H+H+

H+

H+

e-

FADH2

ATPasas de membrana tipo F

Están presentes en las membranas plasmáticas de las bacterias, en la membrana tilacoide de cloroplastos y en la membrana interna de las mitocondrias. Catalizan la reacción de síntesis de ATP (G > 0) a partir de ADP y Pi: Síntesis quimiosmótica de ATP.

La energía proviene del gradiente de potencial electroquímico de protones (fuerza proton motriz) a través de la membrana generado por la actividad de la cadena transportadora de electrones (cadena respiratoria): es decir, actúan como ATP sintetasas.

Inner membrane

H+H+H+

ATPasas de membrana tipo F

Al igual que las ATPasas tipo V están formadas por dos dominios : F1 y F0

El complejo integral F0 contiene tres tipos de subunidades a, b y c. En bacterias éstas tienen composición a1b2c10 y contiene el canal a través del que se transportan los protones.

El complejo F1 está compuesto de 5 polipéptidos diferentes : , , , y , con estequiometría 3,3, .

H+ H+

H+

H+ (i) i = citosol o matriz H+ (e) e = extracelular

El potencial electroquímico del H+ en un compartimento está dado por la siguiente expresión:  

H+ = 0 + RTln CH+ + zF Si : H+(i) H+(e) , entonces : 0 + RTln CH+(i) + Fi < 0 + RTln CH+(e) + Fe

    H+ = H+(e) - H+(i)

H+ = RT ln CH+(e)/ CH+(i) - F(e - i)

=(i - e) = Vm

H+ = RT 2.3 log (CH+(e)/ CH+(i))+ F(i - e) = RT 2.3(-pH) + F

FPM = H+ /F = - RT/F 2.3(pH)  

 

Fuerza Protón Motriz

Transporte activo secundario

En este caso la fuente de energía para el transporte activo es el gradiente de potencial electroquímico de un soluto que se transporta por transporte activo primario.

Ejemplos: 1.- cotransporte de azúcares y aminoácidos en intestino.2.- intercambio de sodio y calcio en células excitables.

1.- Transporte activo de azúcares y aminoácidos acoplado al transporte de Na+ en intestino delgado.

En el epitelio intestinal, las células que realizan el transporte activo de estos solutos son los enterocitos

Estudios in vivo

Los primeros estudios del transporte de azúcares se realizaron in vivo. Cori y Willbrandt en 1926 y Barany y Sperber (1936) midieron las velocidades relativas de absorción de monosacáridos en intestino delgado

Azúcar % control CN-

D-galactosa 115 53 D-glucosa 100 33 D-fructosa 44 37 D-manosa 33 25 D-xilosa 30 31 L-glucosa 30 30

Wilson y Wiseman (1954) desarrollaron el sistema in vitro del saco intestinal evertido. Midieron la acumulación de azúcares en el interior de este saco y encontraron que :1.- la glucosa se acumulaba en el saco, o sea se transportaba activamente.2.- el transporte activo de glucosa era dependiente de la [Na+] en el lado mucoso del epitelio.3.- el Na+ disminuye la Km pero no altera la Vmáx: actuaba como un activador competitivo.Na+ = 0

Na+ = 24 mM

Na+ = 48

Na+ = 1451/Vmax

4.- el transporte activo era inhibido por inhibidores metabólicos (CN-), por floridzina, baja temperatura y ouabaína desde el lado seroso.5.- se determinó que existían dos vías de transporte para azúcares: dependiente y independiente de Na+.6.- la entrada dependiente de Na+ requería que el azúcar tuviera estructura piranósica y el -OH del carbono 2 en posición ecuatorial.

Floridzina

Ouabaína

21

En 1962, Crane formuló un modelo para el transporte activo de glucosa en los enterocitos. Schultz y Zalusky hicieron uno análogo para la absorción de aminoácidos.

El modelo postula que los AAs y azúcares entran al enterocito a través de la membrana apical (borde en cepillo) mediante un cotransporte con Na+, acumulándose en el interior de la célula.

La energía para el transporte en contra del gradiente de concentración provendría del gradiente electroquímico del ión Na+. Este gradiente se mantiene por la acción de bombas de Na+ presentes sólo en la membrana basolateral.

Los azúcares salen de la célula hacia el plasma a través de esa membrana por transporte facilitado, vía transportadores específicos.

gradiente μNa

-50 mV

bomba de Na

Para validar este modelo se debe demostrar que el gradiente de potencial electroquímico del Na+ es suficiente para energetizar el transporte activo de azúcares y aminoácidos. Se estima que la fuerza sodio-motriz (μNa/ F) a través de la membrana es

de -120 mV.  Se debe cumplir que : nGNa + mGG 0,  

[Gi] [Nae+] n

o sea: ln < [ln - zF/RT]( ) [Ge] [Nai

+] m

El mecanismo de transporte de azúcares y aminoácidos se clarificó aún más cuando se hicieron estudios de captación de estos compuestos en vesículas de membranas apical (BB) y basolateral. Hopfer (1973). Midieron la captación rápida de azúcares marcados con 14C o 3H en presencia de gradientes de concentración de Na+ o por intercambio isotópico en equilibrio, en que se mide el intercambio de glucosa 3H cis/trans.Se confirmó que los cotransportadores azúcar-Na+ se encontraban sólo en las membranas del BB. El transporte muestra una cinética de saturación y parece haber 2 sistemas con diferente afinidad y capacidad. Las bombas de sodio solo se encuentran en la membrana basolateral

Bioquímica del cotransportador glucosa/Na+.

El transportador de glucosa/Na+ se ha solubilizado con detergentes como Tritón X100 y deoxicolato y su purificación se ha hecho por fraccionamiento en columnas de sefarosa-concanavalina (Wright et al). Se aisló un péptido de ~70 kDa que ha sido reconstituído en liposomas. En 1987 se clonó el cotransportador glucosa/Na+ de BB de intestino de conejo y luego el humano. En humanos existen dos isoformas: SGLT1 (alta afinidad por glucosa) en intestino y túbulo proximal riñón y SGLT2 (baja afinidad) en riñón. La secuencia primaria del SGLT1 indica que está constituída por 664 residuos de AA. De los perfiles de hidropatía se deducen 14 dominios de transmembrana, cada uno formado por 21 residuos formando hélices α. Los dominios NH2 y COOH enfrentan el lado extracelular.

Mecanismo del cotransporte glucosa y Na+ :Se ha postulado que el cotransportador funcional SGLT1 es un homotetrámero (c/u 75 kDa). En ausencia de Na+, la D-glucosa no se une: Km > 50 mM. En presencia de Na+ la afinidad por el azúcar aumenta: Km < 1 mM. El transportador cargado sufre cambios conformacionales. La proteína vuelve a exponer los sitios activos al exterior y queda lista para iniciar un nuevo ciclo. En condiciones fisiológicas, las etapas limitantes son los pasos de translocación a través de la membrana.

Modelo cinéticoen 6 estados para el cotransporte de glucosa y Na+

2 Na+ Segmentos 10 - 13 forman la vía de translocación del azúcar

2.- Intercambio de sodio y calcio

El Ca2+ es el principal mensajero intracelular y durante la evolución se han desarrollado numerosos mecanismos para regular su nivel citosólico. Uno de estos mecanismos es el intercambio Na+-Ca2+.

Corrientes de intercambio de Na+-Ca2+ han sido estudiadas en gran detalle en células musculares cardíacas, y en el segmento externo de los fotorreceptores bastoncitos de vertebrados. Se sabe ahora que los transportadores involucrados en ambos casos son diferentes.

Energética del intercambio Na+-Ca2+ en el intercambiador de músculo: Este intercambiador es un transportador activo secundario y el sentido neto del transporte de Ca2+ está determinado por el gradiente de [Na+] y el potencial de membrana. Normalmente este intercambiador transporta Ca2+ fuera de la célula en intercambio por sodio, proceso impulsado por el gradiente electroquímico de ambos iones.

nGNa+ + GCa2+ 0

En el equilibrio: G = 0

[Cae2+] [Nae

+] o sea = [ ]n exp[-(n - 2) zF/RT]

[Cai2+] [Nai

+]

Aunque ha habido bastante debate entre los investigadores del campo, actualmente

hay bastante acuerdo que se intercambian 3 iones Na+ por 1 ión Ca2+.Se han identificado al menos dos familias de intercambiadores:La primera de los NCX: 3 isoformas, NCX1, NCX2 y NCX3. Funcionan como intercambiadores Na+-Ca2+ .La segunda de los transportadores similares al intercambiador Na+-Ca2+-K+ inicialmente clonado de tejido retinal que intercambia 4 Na+ por 1 Ca2+ y 1K+

CURSO FISIOLOGÍA GENERAL

REGULACION DEL VOLUMEN CELULAR

Daniel Wolff 2008

REGULACION DEL VOLUMEN CELULAR

El volumen celular es un elemento integral dentro de la maquinaria de la célula que regula su funcionamiento.

Las células animales poseen una serie de mecanismos que les permiten mantener un volumen constante en el medio en que viven en condiciones iso-osmóticas, así como para enfrentar situaciones en las que hay perturbaciones osmóticas extra o intracelulares.

Recordemos que una función vital de la bomba de Na en células animales es mantener la osmolaridad intracelular equilibrada con la exterior lo que hace que se mantenga regulado el volumen celular.

Las células son en general altamente permeables al agua y aún en condiciones iso-osmóticas, el volumen celular es afectado por alteraciones de la osmolaridad intracelular debido a que varias vías metabólicas producen o disipan substancias osmóticamente activas (osmolitos).

hipertónico hipotónico

REGULACION DEL VOLUMEN CELULAR

Los rápidos cambios en el volumen celular son comúnmente causados por el flujo osmótico del agua (Jv) a través de la membrana celular, que es impulsado

por gradientes de presión hidrostática (p) o de presión osmótica () y dependen de la permeabilidad o conductividad hidráulica (Lp) de la membrana al agua.

hipertónico hipotónico

REGULACION DEL VOLUMEN CELULAR

Flujo de agua a través de la membrana está definido como:

Jv = Lp ( - p) Lp: conductividad hidráulica.

La diferencia de presión osmótica, , a través de la membrana está dada por la expresión : 

= RT σiCi

, es función de la concentración total de partículas de soluto disueltas (C i=

concentración soluto i), y del coeficiente de reflexión (Staverman), σ = = exp/ teor. (0 a 1).

Si σ = 1, entonces = RT Ci, que es la ecuación de van’t Hoff aplicable a una membrana idealmente semipermeable.

En el equilibrio, Jv = 0 o sea = pLa membrana celular no soporta gradientes de presión que excedan los 2 kPa (20 cm H2O) que es equivalente a ~1 mmol/l C. Sin embargo, la interacción de la MP con el citoesqueleto permite gradientes hidrostáticas mayores.

REGULACION DEL VOLUMEN CELULAR

Las células mantienen sus funciones metabólicas acumulando diferentes compuestos como proteínas, aminoácidos, polioles, o carbohidratos. La concentración de estos compuestos es más alta en el interior que en el medio extracelular. Este carga osmótica es contrabalanceada por menor concentración de iones. Como analizamos anteriormente la Na+ -K+-ATPasa, extruye Na+ de la célula en intercambio 3: 2 con el K+, y así mantiene un equilibrio osmótico.

Equilibrio de Gibbs-Donnan

En las células, la presencia de solutos cargados no difusibles como proteínas en el interior de la célula genera una diferencia de presión coloidosmótica que favorece la entrada de agua y iones. Si tenemos dos compartimentos (i y e), en ambos hay especies iónicas permeantes (ej.: K+, Cl-) y en i además hay al menos una especie no permeante ( i.e. ión proteinato, P-n).En el equilibrio se debe cumplir para los iones a cada lado o compartimiento: e i (célula e i Cje

+ Cji+

lado e Cje+ = Cje

- Cje- Cji

-

lado i Cji+ = Cji

- + nCp-n Cp-n

K+(left) > K+ (right)Cl- (left) < Cl- (right)

Inicial

Si los iones inorgánicos difunden pasivamente, en el equilibrio éstos se distribuyen de modo que se cumple que para cada especie se igualan los potenciales químicos:

ji = je

Cji

+ Cje-

o sea que: ------- = exp- zF/RT = ----- Cje

+ Cji-

Por lo tanto: Cje+ x Cje

- = Cji+ x Cji

-

Ahora deduciremos una expresión para Cji+ en función de Cje

+ y Cp-n : 

(Cje+)2 = Cji

+ x Cji-

Cji- = Cji

+ - nCp-n

(Cje+)2 = Cji

+ x (Cji+ - nCp-n)

                  (Cji+)2 -(Cji

+ x nCp-n) - (Cje+)2 = 0

                                                                                                                  nCp-n + [(nCp-n)2 + 4 (Cje

+)2]1/2

Cji+ = ---------------------------------------

2

En el equilibrio la concentración total de partículas en cada compartimento es:

e (extracel) i (célula)

Cje+ + Cje

- Cji+ + Cji

- + Cp-n

2Cje+ Cji

+ + (Cji+ - nCp-n) + Cp-

2Cje+ 2Cji

+ + (1 - n) Cp-n

 

Cji+, se reemplaza por la expresión deducida en función de Cje

+ y Cp-n :

2Cje+ [(nCp-n)2 + 4 (Cje

+)2]1/2 + Cp-n

Esta expresión indica que hay un exceso de partículas ~(nCp-n) + Cp-n) al interior de la célula lo que genera un desequilibrio osmótico produciéndose un flujo de entrada de agua. Las células aumentarían de volumen hasta eventualmente lisarse. Sin embargo, este aumento de volumen no ocurre y las células animales son capaces de mantener un volumen constante. Esto indica que los iones inorgánicos permeantes no se distribuyen de acuerdo a un equilibrio de Gibbs-Donnan: en la células animales la diferencia de presión osmótica se compensa fundamentalmente con la extrusión de iones Na+ por la bomba de Na+-K+. Dado que la célula tiene una baja permeabilidad pasiva al Na+, en términos prácticos la célula se comporta como si fuera impermeable al Na+ (doble equilibrio de Donnan).

Regulación del volumen celular en medios anisotónicos.

Las células animales poseen mecanismos sensores que les permiten ajustar su volumen en medios anisotónicos y son gatillados por pequeñas alteraciones en el volumen celular. Se ha postulado mecanismos químicos y físicos. Entre estos últimos el sensor estaría ubicada en la membrana misma o en el citoesqueleto adyacente. Existen evidencias de la activación de canales iónicos mecanosensibles y de transportadores para iones y moléculas orgánicas pequeñas.

hipertónico hipotónico

Disminución regulada del volumenAumento regulado del volumen

Disminución regulada del volumen (DRV o RVD)

Si una célula coloca en un medio hipotónico se observa un rápido aumento del volumen y luego un proceso más lento de recuperación del volumen inicial. Se ha demostrado que en la DRV se activan diferentes sistemas que permiten la salida de iones y moléculas de bajo peso molecular disminuyendo de este modo la osmolaridad del medio interno:

(min)

0

10

Sistemas involucrados en la DRV.

1.- activación de canales de K+ y Cl- en linfocitos, líneas celulares tumorales (células de Erlich), células epiteliales (túbulos renales) y hepatocitos.

2.- activación del cotransporte de K+ y Cl-

(por estiramiento de la membrana). Es electroneutro y sensible a bumetanida y furosemida. Se ha observado en eritrocitos de peces, aves y mamíferos.

3.- activación de contratransportadores Cl-/HCO3

- y K+/H+. (eritrocitos de la salamandra Amphiuma)

4.- activación de transportadores que permiten la salida de varios compuestos orgánicos (osmolitos): glutamato, prolina, taurina. Se ha observado en astrocitos, eritrocitos y miocitos.

glutamato, taurina

Sistemas involucrados en la DRV.

Topología de transmembrana de los canales de K+ de dos dominio de poro

Canales y transportadores involucrados en la DRVCanales de la familia de canales de K+ con dos dominios de poro (2P-4TM).

En algunas células las corrientes de K+ activadas por hinchamiento hipotónico son portadas por canales de K+ del grupo llamado de “background” o basales, independientes del potencial, involucrados en la mantención del potencial de reposo. Pertenecen a la familia de canales de K+ con dos dominios de poro en tandem y cuatro dominios de transmembrana (2P-4TM). Presentan un corto dominio terminal N- y largo C- y un segmento hélice extracelular, SID, involucrado en la formación de los homodímeros. El canal TASK-2 de la familia 2P-4TM está presente en epitelios transportadores (túbulo proximal riñón, colon). Self interacting

domain

Canales y transportadores involucrados en la DRVCanales aniónicos de la familia ClC.

Aparentemente hay varios tipos de canales de Cl- que son activados por hinchamiento celular. Pertenecen a la familia de los canales aniónicos ClC. Uno de ellos, el ClC-2 es un canal de Cl- muy ubicuo, activado por fuerte hiperpolarización y regulados por glicoproteína P. Otros podrían corresponder a la isoforma ClC-3.

Los canales de Cl- de la familia ClC presentan 12 segmentos de transmembrana y forman dímeros con una puerta común. El sensor de hichamiento parece ser una parte del canal.

Topología de transmembrana de los canales de la familia ClC

Registros de corrientes unitarias de un canal de Cl- que presenta dos estados de conductancia

Presenta 12 regiones de transmembrana (TM) y dominios N- y C- terminales intracelulares.El cotransportador de KCl KCC1 se activa por fosforilación cuando la célula se expone a un medio hipotónico: ¿kinasa sensible a cambios de volumen?. En un medio hipertónico se desfosforila y se inactiva.

Canales y transportadores involucrados en la DRV

Cotransportador de KCl (KCC)

El intercambiador Cl-/HCO3- , AE1 o

banda 3(*) es el transportador predominante en los eritrocitos y juega un papel en la estructura y función de estas células y en las células secretoras de ácido en el riñón. Es una proteína de transmembrana de 95 kDa con un largo dominio citoplasmático N-terminal (400 AA), seguido de un dominio politópico de transmembrana (500 AA) con 14 segmentos hélices y una corta cola C-terminal.

Formaría estructuras diméricas o tetraméricas. Presenta un intercambio muy acoplado de los aniones, uno por uno, que involucra un mecanismo ping-pong, en el que AE1 alterna entre un estado con el sitio aniónico enfrentando (Ei) el citoplasma y un estado con el sitio enfrentando en medio externo (Eo).

(*) Su nombre de banda 3 deriva de su posición en los geles de electroforesis de las proteínas de membrana de los glóbulos rojos.

Canales y transportadores involucrados en la DRVIntercambiador cloruro-bicarbonato (Cl-/HCO3

-) AE1

N terminal

C terminal

Canal mecanosensible MscL de bacterias

En bacterias existen canales mecanosensibles que se abren directamente por deformación mecánica de la membrana plasmática cuando la célula enfrenta un medio hiposmótico.

El canal MscL de E. coli es un modelo de transducción de un estímulo mecánico en una respuesta electroquímica. Exhibe una alta conductancia de aprox. 2.5 nS, sin selectividad iónica.

El MscL es un homopentámero de subunidades de 151 residuos con dos hélices , TM1 y TM2, de 50 Å y una hélice citoplasmática.

cotransportador 1K+/1Na+/2Cl-.

intercambiador Na+/H+

Sistemas involucrados en la ARV.

Aumento regulado del volumen (ARV) o (RVI)

Células expuestas a un medio hipertónico disminuyen rápidamente de volumen y luego en un proceso más lento recuperan el volumen inicial. Esto se debe se debe a la captación neta de KCl que aumenta la osmolaridad del medio interno. En el ARV se activan también algunos sistemas de transporte :

1.- activación de los contratransportadores Na+/H+ y Cl-/HCO3- en linfocitos,

eritrocitos de Amphiuma y perro y en túbulo distal del riñón.

células del túbulo colector del riñón

Aumento regulado del volumen (ARV) o (RVI)

2.- Activación del cotransportador 1K+/1Na+/2Cl-. En 1979, Geck presentó evidencias de un mecanismo de acumulación de K+ y Cl- electroneutro acoplado a la bomba de Na+- K+. Este sistema cotransporta 1K+/1Na+/2 Cl- por ciclo. Se ha encontrado en varios tipos celulares de vertebrados (eritrocitos de ave, células de Erlich, células del túbulo colector del riñón y acinares pancreáticas) y se inhibe por bumetanida y furosemida.

cotransportador 1K+/1Na+/2Cl-

bumetanida

furosemida

Existen seis isoformas de este transportador con una topología de 12 segmentos hélices de transmembrana que funciona como intercambiador iónico (Na+/H+ 1:1) Tiene un dominio C terminal citosólico que modula la actividad del transporte.

Están involucrados principalmente en la regulación del pH intracelular y también juegan un rol en la regulación del volumen celular.

La secuencia de AA de los segmentos de TM están muy conservados (TM6 y TM7 95%) lo que sugiere que participan en la translocación de Na+ y H+. Estos intercambiadores presentan una cinética de transporte simple Michaelis-Menten para el Na+ extracelular y el H+ (un solo sitio de unión cara extracelular)

Canales y transportadores involucrados en el ARVIntercambiadores o contratransportadores Na+/H+ (NHE).

Modelo topológico transportador NHE1 basado en análisis de hidropatía (centro) y estudios de mutagénesis de cisteínas (inserto). Las diferencias entre ambos modelos están en TM-10 (rojo) y TM-11 hasta EL-6 (azul).

Cotransportador Na+/K+/2Cl- (NKCC1).

Los cotransportadores Na-K-Cl pertenecen a una clase de proteínas de transporte que realizan el transporte de iones Na+, K+ y Cl- hacia adentro y fuera de las células de manera electroneutra, con una estequiometría de 1Na+:1K+:2Cl-. Se han identificado dos isoformas del cotransportador 1Na+/1K+/2Cl-: NKCC1, presente en la mayoría de los epitelios secretores y en células no epiteliales y NKCC2 presente sólo en las células del asa ascendente de Henle en el riñón.

Pertenece a una familia que incluye también a las múltiples isoformas del cotransportador K-Cl.

El NKCC1, es activado por fosforilación por una proteína kinasa no determinada en respuesta a varios secretagogos así como la reducción en la [Cl-]i y del volumen celular, cuando la célula se expone a un medio hipertónico. En un medio hipotónico se desfosforila y se inactiva.

Canales y transportadores involucrados en el ARV

Se predicen 12 regiones de transmembrana (TM) y dominios hidrofílicos N- y C- terminales intracelulares.A la izquierda la estructura del cotransportador K-Cl (KCC1). La comparación de la secuencia de AAs del KCC1 con la del NKCC1 revela que las regiones TM son las más altamente conservadas.

Estructura de transmembrana del cotransportador Na+/K+/2Cl-

(hNKCC1).

Canales de agua o acuaporinas

En las células el agua se transporta a través de proteínas de membrana específicas llamadas canales de agua o acuaporinas que fueron identificadas y clonadas en 1992.Están presentes en células animales (eritrocitos y células epiteliales renales) y de plantas (tonoplasto). Pertenecen a la familia de las proteínas MIP (major intrinsic proteins) y forman poros selectivos al agua, excluyendo iones y otras moléculas orgánicas polares de bajo PM. La expresión de estos canales de agua se ha detectado mediante ensayos de hinchamiento de ovocitos Xenopus expuestos a un medio hipotónico, inyectados con mRNAs que codifican para acuaporinas. La permeabilidad al agua aumenta de 1×10-3 cm/s a 2×10-2 cm/s.

exptal.

con t r ol

0,5 min 1,5 min 2,5 min 3,5 min

Canales de agua o acuaporinas.

Los canales están formados por homotetrámeros de subunidades de 28 kDa c/u con seis hélices α  que forman tres pares de homólogos.

La cadena polipeptídica posee seis dominios putativos de transmembrana con 2 asas de poro y los extremos amino y carboxilo enfrentan el citoplasma. Se ha postulado que estos poros deberían tener un radio de entre 1,5 a 2,0 Å.

Las moléculas de agua se moverían en fila india: cinco a nueve moléculas de agua ocuparían la porción limitante de la velocidad del canal. Estas proteínas forman tetrámeros, pero al parecer los monómeros son las unidades funcionales.

acuaporina AQP1

acuaporina -TIP de tonoplasto,

Estructura de una subunidad de la acuaporina AQP1 y un esquema del transporte de agua

Modelo de un monómero mostrando seis hélices de transmembrana con dos asas de poro con cortos hélices desde cara extracelular (naranja) e intracelular (turquesa).

Fin

Fine

The End

Estructura de la bomba de sodio

membrana

extracelular

citosol