7/25/2019 detergentes bioqumicos para extraccin de protenas

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Abstracto

La separacin de fases es un mtodo simple, eficiente y barato para purificar yconcentrar las protenas de membrana solubilizada con detergente. A pesar deesto, la separacin de fases no se usa mucho o incluso conocido entre los

cientficos de protenas de membrana, y protocolos listos para su uso estndisponibles por slo relativamente pocas combinaciones de protenas dedetergente / membrana. Au, resumimos los parmetros fsicos y umicos ueinfluyen en el comportamiento de separacin de fases de los detergentes de usocom!n para los estudios de protenas de membrana. "e proporcionan e#emplospara la purificacin con $ito de las protenas de membrana utilizando este mtodocon diferentes clases de detergentes. %omo la eleccin del detergente es crticoen muchas aplicaciones posteriores &por e#emplo, la cristalizacin de protenas demembrana o ensayos funcionales', se discute cmo los nuevos protocolos deseparacin de fases se pueden desarrollar para un sistema tampn detergentedado.

Introduccin

Los detergentes se utilizan para e$traer protenas de la membrana de lasmembranas biolgicas y para mediar su solubilidad en soluciones acuosas, lo cuales un reuisito previo para una mayor purificacin de protenas &('.)urificacin deprotenas de la membrana es generalmente tedioso &*',ya ue se eliminan de suentorno nativo de membrana en un tampn detergente ue pueden mimetizar sloparcialmente las propiedades fsicas y umicas de una membrana lipdica. )or lotanto, muchas protenas de la membrana no conservan su actividad biolgicadespus de la e$traccin, o lo hacen slo parcialmente o slo ba#o condiciones detampn muy especiales.

+espus de la e$traccin, purificacin de protenas de membrana se logrageneralmente por los mismos mtodos utilizados para la cromatografa deprotenas solubles, siendo la diferencia ue los detergentes deben estar presentesen las memorias intermedias en todo momento. +etergentes no interfieran conintercambio inico o cromatografa de uelatos metlicos, y slo a veces con otrosmtodos de cromatografa de afinidad. n la cromatografa de e$clusin portama-o, el peso molecular aparente de protenas de la membrana se incrementapor el detergente unido.

La separacin de fases es una poderosa alternativa o adicin a los protocolos depurificacin basado en la cromatografa. )uede ser utilizado directamente en lasmembranas solubilizadas, separando las protenas de membrana de las protenassolubles y otras impurezas hidrfilas. ales protocolos de purificacin brutos seutilizan en la protemica membrana o como una primera etapa de purificacin,seguido por cromatografa &, 0'.Alternativamente, la separacin de fases puede

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ser e$plotado como una concentracin simultnea y etapa de pulido en una etapaposterior de purificacin &1'.

l uso de etapas de separacin de fase en la purificacin de protenas de lamembrana tiene una serie de beneficios.Los protocolos son simples de usar, no

reuieren euipos de laboratorio comple#os, son fcilmente ampliarse a grandesvol!menes, y son compatibles con la mayora de los mtodoscromatogrficos. specialmente, la eliminacin de compuestos hidrfilos es muyeficiente. )or otra parte, las protenas de membrana pueden purificarse y seconcentraron al mismo tiempo, comparable en eficacia con protocolos deprecipitacin de las protenas solubles ue emplean &23 0' *"4 0u otrassales. 5na posible desventa#a del mtodo son las altas concentraciones dedetergentes implicados, ue pueden ser desfavorable para la estabilidad de laprotena y puede interferir con los ensayos bioumicos y procesos de unin. Ladilisis u otros mtodos como la absorcin de detergente o de filtracin en gelpueden ser necesarias para eliminar el e$ceso de detergente de la solucin.

A continuacin, describimos los parmetros fsicos y umicos ue influyen en laseparacin de fases de las diferentes clases de detergentes de uso com!n en lapurificacin de protenas de membrana. "e discuten los protocolos de separacinde fases e$itosas y dar pautas sobre cmo estos protocolos se pueden adaptar alos nuevos sistemas tampn detergente.

Propiedades General de Detergentes

Los detergentes son molculas anfipticas por lo general consisten en un grupo decabeza polar o cargado y una cadena hidrocarbonada hidrfoba e$tendida. Aconcentraciones muy ba#as, estas molculas son solubles en agua comomonmeros. Al aumentar la concentracin de detergente por encima de ladenominada concentracin micelar crtica &%6%', las molculas de detergenteforman agregados con una distribucin de tama-o muy estrecha, llamadamicelas. l tama-o de las micelas es dependiente del tipo de detergente7 paradetergentes usados tpicamente en la bioumica de la membrana, el n!mero deagregacin &es decir, el n!mero de molculas de detergente por micela' puedevariar de * a para colato de sodio a apro$imadamente (08 para riton9 :;(88 &

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sal de una solucin micelar acuosa de detergente. La solucin micelar entonces seconvierte en turbia7 las micelas se convierten en inmiscible con agua y formangrandes agregados ue se separar de la fase de agua. La mayora, pero notodas las particiones de detergente en la fase rica en detergente, ue a su vezcontiene todava una cantidad sustancial de agua. +ependiendo del detergente y

las condiciones de tampn, la fase rica en detergente puede ser completamentetransparente o turbia y se puede encontrar en la parte superior o por deba#o de lafase de detergente pobres. ste proceso se llama separacin de fases o, a veces,la e$traccin de nubes de puntos. La separacin de fases se produce debido auna diferencia de temperatura dependiente de la entropa entre el sistema de unasola fase y de dos fases. l efecto es similar a la precipitacin de protenasutilizando polietilenglicol &)>' o &23 0' *"4 0, donde no hay suficiente agua libre est disponible paramantener la protena totalmente hidratado y, por tanto, soluble. +el mismo modo, las micelas de detergenteagregarse y formar una fase separada en la ue menos agua cubre su superficie,y este comportamiento de agregacin es influenciada por la temperatura, sales, ypolmeros.

Diagramas de fase

La ?igura ( muestra dos e#emplos simplificados de diagramas de fase dedetergente en solucin acuosa, ue muestra el comportamiento de fase de dosdetergentes diferentes al aumento de la temperatura y / o concentracin dedetergente. odos los detergentes son monomrica en solucin a ba#asconcentraciones. La lnea ue separa la solucin de detergente monomrica de lasolucin de micelas representa la %6% ue por s mismo es dependiente de latemperatura. )or encima de esta concentracin, el detergente forma micelas de untama-o definido. La frontera entre la solucin micelar y la separacin de fases enel diagrama de fase se llama ya sea lmite superior o inferior consolucin. n la?igura (A, del punto de enturbiamiento del detergente se alcanza mediante elaumento de la temperatura de una solucin de micela de concentracin intermediade cruzar el lmite inferior consolucin, mientras ue el punto de enturbiamientodel detergente en la ?igura (@ se alcanza por la disminucin de la temperatura deuna solucin de micela del compuesto intermedio concentracin de detergentepara cruzar la frontera consolucin superior.%omportamiento de fase como en la?igura (A es tpico de detergentes a base de )>, mientras ue un lmite superiorconsolucin como en la ?igura (@ se observa para muchos detergentes de ionhbrido y glicosdicos. %uando se alcanza el punto de enturbiamiento, eldetergente se formar una fase separada, y la fase acuosa se agota dedetergente. A muy alta concentracin de detergente y ba#a temperatura &por logeneral en concentraciones ue no son pertinentes a efectos bioumicos', unafase cristalina luida formar ue contiene molculas de detergente bienordenadas. ?ases cristalinas luidas se pueden clasificar en fases c!bicas,he$agonales, o laminares &'dependiendo de muchos factores ue no se discutenau. s importante tener en cuenta ue la temperatura en funcin diagramas defase de concentracin puede cambiar drsticamente cuando se vara la fuerzainica de la solucin. )or lo tanto, el punto de enturbiamiento de una solucin demicela se puede alcanzar mediante la adicin de sal en lugar de cambiar la

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temperatura. sto ha sido estudiado e$tensivamente para detergentes de la familiade riton&B'. 4tros aditivos como glicerol o urea afectan en gran medida elcomportamiento de fase de un detergente, al igual ue la presencia de lpidos enmicelas mi$tas &(8'y la adicin de polmeros &vase la seccin siguiente'.

Figura 1. (A) n diagrama de fasesimplificada de un detergente conun l!mite inferior consolucin.(Clic" para ampliar)

#l uso de separacin de fases parapurificar prote!nas de membrana

La separacin de fases a base dedetergente se desarroll a partir de laseparacin de fases a base depolmero.%uando dos polmerossolubles en agua suficientementediferentes &por e#emplo, de$trano y)>' se mezclan en solucin aconcentraciones elevadas, se formandos fases acuosasinmiscibles. +iferentes protenas se

repartir en las dos fases en funcin de sus propiedades fsicas y las propiedadesde los polmeros &(('. %uando se utilizan polmeros de diferentes cargas &pore#emplo, catinico o derivados de )> aninicos', una protena puede serdesplazado de una fase a la otra simplemente cambiando el p3 desde arriba pordeba#o de su punto isoelctrico a ba#a fuerza inica del sistema detampn &(*' . Las variaciones de este mtodo son sistemas de dos fases uecomprenden )> y sal &('. Los sistemas acuosos de dos fases se han adaptadoa los procesos a escala industrial&(0',pero slo se utiliza con poca frecuencia enaplicaciones de laboratorio.

"istemas de dos fases acuosas a base de polmero se puede utilizar paraprotenas de membrana solubilizada con detergente, donde las propiedades deldetergente unido influir en la particin de la protena de membrana encuestin. %omo esto implica dos polmeros, adems de la protena y el detergente,tales sistemas son difciles de mane#ar, y la eliminacin de polmeros paraaplicaciones de aguas aba#o es un desafo adicional. )ero el sistema )>;de$trano en combinacin con el detergente riton :;(88 ha sido utilizado con $ito

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para purificar Escherichia colifosfolipasa membrana e$terna &(1'y Micrococcuslysodeikticus@11< citocromo &(

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fases con protenas de membrana. AdicinG BF de &23 0' *"4 0oG (;monoter y sus puntos de enturbiamiento, %6%, y los n!meros

de agregacin se puede encontrar en varias revisiones de umica

fsicos &8, ('. "e nombran % $ yde acuerdo a su longitud de cadena

alulica (x) y el nmero de unidades de glicol de polioxietileno en el grupo de

cabeza &J'. %on frecuencia, estos detergentes son ms conocidos por sus

nombres comerciales &por e#emplo, @ri#9 1 para % (* *o mulgen (0= para

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% (* *1'. l punto de turbidez de estos detergentes depende de la longitud de la

cadena aluilo, as como del grupo de cabeza7 en longitud de cadena alulica

constante, el punto de la nube aumenta con el tama-o del grupo de cabeza &por

e#emplo, de 1 E ; E % para % tresa B< E % para % '. Al mismo tiempo, el

punto de turbidez disminuye con el aumento de tama-o de la cadena aluilo &por

e#emplo, desde 0 E % para % 0a 0 E % para % (* 0' &('. A pesar de estaamplia variabilidad de puntos de enturbiamiento ue debe permitir la separacin

de fases ba#o casi cualuier condicin de tampn a temperatura ambiente, e$isten

pocos protocolos para la purificacin de protenas de membrana utilizando )>

separacin de fases monoter. Kecientemente, % )4, un % $mezcla conxD

*;B se ha utilizado en la purificacin de una protena de la membrana e$terna

bacteriana. l componente principal de % )4 es % 0, cuya nube de puntos es 0 E %, pero la

nube de puntos se modific a la temperatura ambiente con la ayuda de *8F &23 0' *"4 0&1'. 5na venta#a

importante de % )4 sobre ritn :;((0 es su alta %6%, lo ue permite una fcil

e$traccin de e$ceso de detergente por dilisis. % (8 0muestra las mismas

propiedades, favorables con la venta#a a-adida de ue la separacin de fases seproduce a temperatura ambiente ya en tampones con poca sal &*'.

Al igual ue con los detergentes de la serie riton y Ieen, monoteres de glicol

de polio$ietileno se pueden utilizar en la separacin de fases a base de polmero

con de$trano o )>. 5n estudio detallado con la protenas de la membrana

bacteriorodopsina y colesterol o$idasa se hizo para los detergentes % (* 1,

% (* y % (* * &es decir, @ri# 1' en combinacin con 188 de$trano o )>

08888. Ambos polmeros cambi el puntos de enturbiamiento de los detergentes

de tal manera ue la separacin de fases se produ#o a temperatura ambiente,

mientras ue slo e$ista una fase a 0 E % &(='. +el mismo modo,

polivinilpirrolidona se puede utilizar para inducir la separacin de fases dedetergentes a base de )> &'.

Detergentes glicos!dicos

Los detergentes con grupos de cabeza glicosdicos se utilizan frecuentemente en

la cristalografa de protenas de membrana. Los detergentes ms comunes de

esta clase son aluilo beta;glucsidos y aluil ;maltosides, con longitudes de

cadena de aluilo tpicamente van desde a (0. )arece ue los detergentes

glicosdicos tienen propiedades !nicas en comparacin con detergentes ue

tienen otros grupos de cabeza, ue los hace especialmente adecuados para lasolubilizacin y estabilizacin de protenas de la membrana7 la regin de interfaz

de micelas M;dodecilmaltsido &M;+6' proporciona un microambiente acuosa;liNe,

ue no es el caso para otros detergentes &no;glicosdicos' &0'. n los sistemas de

tampn ue contienen )>, los diagramas de fase de detergentes glicosdicos

muestran un lmite consolucin superior y por lo tanto se someten a separacin de

fases a ba#a temperatura &1'&?igura (@'. sto puede ser e$plotado para la

purificacin de protenas de membrana, utilizando )> &o de$trano' con M;

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octilglucsido &M;4>', M;dodecil;maltsido &(=, A; a 6>A;(8' &0'y

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deba#o de 8 E %7 por lo tanto, su lmite consolucin superior no se puede cruzar

para inducir la separacin de fases por disminucin de la temperatura a menos

aditivos tampn traer la nube de puntos a la temperatura ambiente &00'. l

detergente bipolar basado en colato ; Q&;colamidopropil' ;dimethylammnioR

sulfonato l;propano &%3A)"' &0='se utiliza con frecuencia para solubilizar

protenas de membrana7 "in embargo, no e$iste informacin sobre los diagramasde fase o puntos en la nube, mientras ue % ;lecithin est bien estudiado por su

comportamiento de separacin de fases, pero no se ha utilizado en la e$traccin

de protenas de la membrana &0'.

Detergentes aninicos

+odecil sulfato de sodio &"+"' se utiliza con frecuencia en aplicaciones de

protenas, pero por lo general desnaturaliza las protenas. n cuanto a otros

detergentes aninicos, el comportamiento de la solucin de "+" es fuertemente

dependiente de la fuerza inica del sistema tampn. l n!mero de agregacin de

"+" a ms del doble de

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$as me+clas de detergentes

n algunos casos, puede ser favorable para mezclar diferentes detergentes para

modificar las propiedades de separacin de fases de un tampn detergente. Las

mezclas de no inicos con detergentes catinicos se han utilizado con $ito para

purificar protenas de la membrana &vase la seccin titulada catinico+etergentes', y mezclas de % (8 0y plomo 4> a propiedades me#oradas de

separacin de fases en la purificacin de centros de reaccin bacterianas en

comparacin con los detergentes individuales & 1

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Cmo adaptar el protocolo a sus necesidades

l punto de partida para el desarrollo de un procedimiento de separacin de fases

es un tampn detergente cuyos componentes estn determinadas por la protena

de la membrana a purificar, como la mayora de las protenas de membrana

solubilizadas son estables slo en ciertos detergentes &

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es el uso de polmeros ue contienen grupos uelantes de metales capaces de

unirse etiuetas de polihistidina. 6arcada con 3is protenas de membrana pueden

entonces repartirse en la fase de polmero &en lugar de la fase rica en detergente',

lo ue permite una separacin de etiuetado de protenas de la membrana sin

etiuetar y la proteccin de la protena etiuetada por el contacto con

concentraciones de detergente e$tremas &=('. ste mtodo tambin puedeutilizarse para purificar las vesculas de membrana ue contienen protena

3istagged &=*'.