ANEXO

Cuantificacin de variables con importancia en los procesos que se realizan en el laboratorio

DETERMINACIN DE AZUCARES TOTALES POR EL MTODO DE ANTRONA PREPARACIN DE LA SOLUCIN BASE DE ANTRONA

La vidriera a utilizar debe estar previamente lavada con solucin de cido sulfrico al 10%. Tomar 100 mL de cido sulfrico al 96% en un recipiente mbar o en un erlenmeyer previamente cubierto con papel aluminio para evitar que la solucin final de Antrona en cido reaccione con la luz. A los 100 mL de cido adicionarles 200 mg de Antrona slida y llevar a agitacin hasta obtener una solucin homognea. Para la manipulacin de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes debido a su alta toxicidad.

ELABORACIN DE CURVA ESTANDAR Pesar 0.25 g de glucosa y llevarlo a un volumen final de 50 mL para obtener una solucin de concentracin 5 g/L. Tomar una alcuota de 0.5 ml de esta solucin y llevarlos a un volumen final de 50 mL para obtener una solucin de concentracin 0.05 g/L. Con esta ltima solucin preparar las siguientes diluciones en tubos de ensayo, utilizar micropipeta de 1 mL para esto. Solucin

Concentracin [g/L]

Volumen de solucin madre (mL)

Volumen de agua destilada (mL)

Blanco 0 0 1.5 1 0.005 0.15 1.35 2 0.01 0.30 1.20 3 0.015 0.45 1.05 4 0.02 0.60 0.90 5 0.025 0.75 0.75 6 0.03 0.90 0.60 7 0.035 1.05 0.45 8 0.04 1.20 0.30 9 0.045 1.35 0.15 10 0.05 1.50 0

Conservar en un bao de hielo durante todo el tiempo que se demore el tratamiento de las diluciones puesto que la reaccin con el reactivo de Antrona es demasiado exotrmica.

Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 3 mL del reactivo de Antrona incluyendo el blanco; agitar en vortrex hasta obtener soluciones homogneas. Llevar todas las soluciones al bao termosttico a temperatura de 80 90 C durante 10 minutos. Pasados 10 minutos exactos de calentamiento llevar las soluciones a un bao de hielo hasta que las soluciones se enfren completamente. Agitar nuevamente y esperar 15 minutos hasta que las burbujas de aire desaparezcan. Leer absorbancia de todas las soluciones a 625 nm y realizar una curva de concentracin de glucosa en g/L versus Absorbancia y hacerle un ajuste lineal.

DETERMINACIN DE AZUCARES POR EL MTODO DE DNS PREPARACIN DE LA SOLUCIN BASE DE DNS Se preparan 20 mL de una solucin de NaOH al 2 N con NaOH slido en un erlenmeyer de 200 mL y llevar a agitacin hasta obtener una solucin homognea. A esta solucin se le adicionan 30 gramos de Tartrato de Sodio y Potasio y se completa el volumen a 100 mL. Para la adicin del DNS, se debe tener en cuenta, que este en solucin es reactiva a la luz; por lo tanto es necesario utilizar un recipiente mbar o en su defecto cubrir el erlenmeyer con papel aluminio. Por ltimo a esta solucin se le aade 1 gramo de DNS (cido 3 5 dinitrosaliclico). Para la manipulacin de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes debido a su alto poder cancergeno. ELABORACIN DE CURVA ESTANDAR Pesar 0.1 g de glucosa y llevarlos a un volumen final de 50 mL para obtener una solucin de concentracin 2 g/L. Tomar una alcuota de 5 ml de esta solucin y llevarlos a un volumen final de 25 mL para obtener una solucin de concentracin 0.4 g/L correspondiente a la solucin madre. Con esta ltima solucin preparar las siguientes diluciones en tubos de ensayo, utilizar micropipeta de 1 mL para medir estos volmenes.

Solucin

Concentracin [g/L]

Volumen de solucin

madre (ml)

Volumen de agua

destilada (ml)Blanco 0 0 2.0

1 0.04 0.2 1.8 2 0.08 0.4 1.6 3 0.12 0.6 1.4 4 0.16 0.8 1.2 5 0.20 1.0 1.0 6 0.24 1.2 0.8 7 0.28 1.4 0.6

8 0.32 1.6 0.4 9 0.36 1.8 0.2

10 0.40 2.0 0

Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 2 mL de la solucin de DNS incluyendo el blanco; tapar con papel vinipel todos los tubos para evitar prdidas por evaporacin (En el caso de no poder trabajar inmediatamente con las soluciones guardar todos los tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS comience a reaccionar). Llevar todas las soluciones al bao termosttico a temperatura de 80 90 C durante 5 minutos. Pasados 5 minutos exactos de calentamiento llevar las soluciones a un bao de hielo durante otros 5 minutos o hasta el momento en que se dispone a hacer las lecturas. Leer absorbancia de todas las soluciones a 540 nm, realizar una curva de Concentracin de glucosa en g/L versus Absorbancia y hacerle un ajuste lineal. DETERMINACIN DE PROTEINA SOLUBLE ( MTODO DE LOWRY) El mtodo ms exacto para determinar concentracin de protena es probablemente la hidrlisis cida seguida por la determinacin de aminocidos. La mayora de los otros mtodos son sensibles a la composicin de aminocidos de la protena, por lo que no se pueden obtener concentraciones absolutas. El mtodo de Lowry no es una excepcin, pero su sensibilidad es moderadamente constante de protena a protena y ha sido tan ampliamente usado, que se constituye en el mtodo de eleccin para mezclas de protenas y extractos crudos.

El mtodo se basa en la reaccin de Biuret, donde el enlace peptdico reacciona con el cobre bajo condiciones alcalinas produciendo ion cuproso, el cual reacciona con el reactivo de Folin va aminocidos aromticos. La reaccin produce un complejo de color azul, que depende principalmente de Tyrosina y Triptofano. El mtodo es sensible hasta niveles de 0.01 mg de protena / ml, pero es mejor para concentraciones de 0.01 1.0 mg/ml.

Reactivos Reactivo A: En un beaker pequeo pesar 20.0 g de Na2CO3 y 4.0 g de NaOH. Transvasar a un baln volumtrico de 1.0 L y completar volumen con agua destilada. Reactivo B-1 En un beaker pequeo pesar 1.0 g de CuSO4.5H2O, transvasar a un baln de 100 ml y completar volumen con agua destilada. Reactivo B-2 En un beaker pequeo pesar 2.0 g de Tartrato de Na-K, transvasar a un baln de 100 ml y completar volumen con agua destilada.

Reactivo C: En un recipiente apropiado mezclar en el siguiente orden 1 ml de Reactivo B-1, 1 ml de Reactivo B-2 y 100 ml de Reactivo A. Preparar esta solucin diariamente. Reactivo de Folin Coplcateau 2.0 N: Reactivo grado analtico, marca Merck. Fenol 1.0 N: En un recipiente apropiado diluir un volumen del reactivo de Folin Ciocalteau (2.0 N) con un volumen igual de agua destilada. cido Tricloroactico 10 % p/v: En un beaker pequeo pesar 10 g del reactivo y transvasar a un baln volumtrico de 100 ml.

Preparacin de la muestra: Filtrar o centrifugar la muestra de cultivo, con el fin de remover los slidos presentes. Usar el lquido sobrenadante. Precipitacin: Colocar 2.0 ml de muestra en un tubo de centrfuga cnico de 15 ml. Aadir 2.0 ml de cido tricloro acetico al 10 % p/v. Mezclar en un vortex. Incubar de 30 60 minutos en la nevera. Centrifugar durante 25 minutos a 2000 r.p.m. Descartar el supernadante y disolver el pelet en 2.0 ml del Reactivo A. La protena soluble tambin puede precipitarse por adicin de 4.0 ml de acetona a 2.0 ml de muestra. En este caso el pelet se disuelve en un buffer apropiado, de acuerdo al medio en el que se desee evaluar la protena. Este procedimiento se usa para medir la concentracin de enzima en muestras que contienen altas concentraciones de azcar que interfieren con el ensayo de celulasa Derivatizacin de la protena soluble: En un tubo de ensayo colocar 0.5 ml de muestra (debe contener entre 0.05 g 1.0 mg de protena /ml). Aadir 5.0 ml del reactivo C y mezclar con vortex.. Dejar en reposo durante 10 minutos. Luego aadir 0.5 ml del reactivo de Fenol 1.0 N y mezclar con vortex. Esperar 30 minutos y leer la Absorbancia a 750 nm contra un blanco reactivo.

Curva de calibracin: Solucin Stock de Albmina de Suero Bovino (A.S.B.): En un beaker pequeo pesar 0.5 g del reactivo grado analtico, transvasar a un baln volumtrico de 50 ml y completar volumen con agua destilada. Agitar. Conservar esta solucin en el congelador (0 5 C). La solucin preparada tiene una concentracin final de 10000 ppm. Soluciones estndar de Albmina de Suero Bovino: A partir de la solucin stock tomar alcuotas de 0.125, 0.250, 0.750, 1.25 1.75 y 2.5 ml. Transferir cada alcuota a un baln volumtrico de 25 ml. Completar volumen con agua destilada y agitar. Las soluciones preparadas tienen una concentracin de 50, 100, 300, 500, 700 y 1000 ppm de A.S.B. Dichas concentraciones se encuentran en el rango recomendado para el ensayo (0.05 1.0 mg/ml). Almacenar los estndares en el congelador.

Curva de Calibracin: En tubos de ensayo para centrfuga, tomar alcuotas de cada uno de los estndares y centrifugar a 7500 r.p.m. durante 12 minutos. Del sobrenadante tomar 2.0 ml en otro tubo de ensayo y adicionar 2.0 ml de cido tricloro acetico al 10 %. Agitar con vortex y llevar a la nevera durante 45 minutos.

Retirar de la nevera y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 25 minutos . Descartar sobrenadante. Al residuo adicionar 2.0 ml del Reactivo A. Mezclar con vortex. De la solucin anterior se toman 0.5 ml en un tubo de ensayo y se adicionan 5.0 ml del Reactivo C. Agitar con vortex y dejar en reposo durante 10 minutos. A la solucin anterior aadir 0.5 ml del reactivo de Folin 1.0 N. Agitar y esperar 30 minutos. Finalmente leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 750 nm contra un blanco reactivo.

Blanco reactivo: En un tubo de ensayo tomar 2.0 ml de agua destilada y proceder de igual forma como en el numeral 5 c. Curva de Calibracin: Construir un grfico de Absorbancia versus concentracin para cada uno de los estndares. Trazar la mejor lnea recta, por el mtodo de los mnimos cuadrados (regresin lineal). Verificar que existe una relacin lineal entre la Absorbancia y la concentracin para el rango establecido (coeficiente de correlacin mayor a 0.95). Obtener la ecuacin para la lnea recta con el fin de interpolar los valores de absorbancia obtenidos para cada muestra ensayada. Contenido de protena en la muestra ensayada: Una vez obtenido el valor de Absorbancia para la muestra, este se interpola en la curva de calibracin, con el fin de obtener la concentracin de protena en ppm, para la solucin leda. Si la muestra leda es producto de diluciones previas sobre la muestra de inters, el valor obtenido se multiplica por el factor de dilucin correspondiente. C final = C interpolacin * F.D. C final = Concentracin de protena en el problema, C interpolacin = Concentracin obtenida por interpolacin de la absorbancia de la muestra leda, en la curva de calibracin.

F.D. Factor de dilucin. Datos experimentales: Los siguientes datos se obtuvieron en un espectrofotmetro Espectronic 20, marca instruments, de pantalla digital. Las muestras ensayadas consisten en medios de cultivo de hongos ruminales, evaluados para actividad celuloltica.

# Estndar [Estndar] Absorbancia 1 50 0.074 2 100 0.134 3 300 0.346 4 500 0.548 5 700 0.709

Ppm Absorbancia

50 0.074

100 0.134

300 0.346

500 0.548

700 0.709

Para un extracto enzimtico ensayado, se obtuvo una absorbancia de 0.548, que al Interpolarse en la curva de calibracin, corresponde a 518.6 ppm de protena en la muestra leda.

Bibliografa Ghose T. K. Measurement of cellulase activities. International Union of Pure and Applied Chemistry. Applied Chemistry Division Commission on Biotechnology. Walker John. Basics protein and peptides protocols. Chapter 1. The Lowry Method for protein quantitation. Humana Press. Totowa, New Jersey. DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO POR EL MTODO DE PESO SECO Se siembra el microorganismo de inters en agar (sobre medio slido) para permitir el crecimiento de cepas aisladas.Luego de observar un crecimiento representativo del microorganismo, se procede a extraer una cepa aislada del cultivo en caja y sembrarla en un caldo de cultivo rico, que permita la adaptacin a un nuevo ambiente y el crecimiento de las clulas (este proceso se denomina inocular). Este caldo se prepara en un erlenmeyer y corresponde al 10% del volumen total con el que se desea trabajar posteriormente. El inculo se pasa a otro erlenmeyer que corresponde a un medio de cultivo con un volumen especfico de trabajo deseado. Se vierte el inculo en este medio recientemente preparado, y se deja en suspensin con agitacin y calentamiento hasta observar que los microorganismos han crecido lo suficiente, lo cual se hace apreciable cuando el medio del cultivo se torna turbio. Despus de obtener un medio de cultivo con una cantidad de clulas representativa se procede a centrifugar toda la suspensin, se descarta el sobrenadante y se lava con solucin salina al 0.9 %; esta nueva solucin se suspende y corresponde a la solucin madre.

Se extraen alcuotas de la solucin madre para concentraciones (%v/v) de 100, 50, 40, 30, 20, 10, 0 %; para ello se toman 25, 12.5, 10.0, 7.5, 5.0, 2.5, 0.0 ml respectivamente, estos volmenes se llevan a 25 ml (en baln volumtrico). Se toma un papel filtro por cada dilucin y para cada uno un trozo de papel aluminio, este ltimo se usa como soporte para el papel filtro por lo tanto no debe ser cambiado con ningn otro a fin de no generar errores en el peso obtenido. Los papeles filtro y aluminio se pesan y se marcan con las diluciones de cada una de las soluciones; el papel filtro se pesa tanto seco como hmedo.