Determinación simultánea de fármacos hospitalarios en muestras ambientales
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Máster Estudios Avanzados en Química Determinación simultánea de fármacos hospitalarios en muestras ambientales Manuel Prada Fernández Directores: Esteban Alonso Álvarez Juan Luís Santos Morcillo Departamento de Química Analítica
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Máster Estudios Avanzados en Química
Determinación simultánea de fármacos hospitalarios en muestras ambientales
Manuel Prada Fernández
Directores:
Esteban Alonso Álvarez
Juan Luís Santos Morcillo
Departamento de Química Analítica
2
3
ÍNDICE
1. ANTECEDENTES 5
1.1. Introducción 7
1.2. Propiedades de los fármacos hospitalarios antineoplásicos 9
1.4. Metodologías analíticas 12
1.5. Objetivo 14
2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 15
2.1. Principios activos antineoplásicos 17
2.2. Toma de muestras 17
2.3. Tratamiento de muestras 17
2.4. Análisis HPLC/MS/MS 18
3. OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 25
3.1. Optimización del método cromatográfico 27
3.1. Optimización del método de extracción 27
3.2.1. Optimización del cartucho de extracción 27
3.2.2. Optimización del pH de la muestra 28
3.2.3. Optimización del disolvente de elución 29
4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 31
4.1. Linealidad 33
4.2. Recuperación 34
4.3. Límite de detección y cuantificación 35
4.4. Precisión 36
4.5. Efecto matriz 37
4.6. Aplicación a muestras medio ambientales 38
5. CONCLUSIONES 41
6. REFERENCIAS 45
4
5
1.Antecedentes
6
7
1. ANTECEDENTES
1.1. INTRODUCCIÓN
Durante años el hombre ha contaminado el medio ambiente vertiendo numerosos
sustancias contaminantes utilizadas en el sector agrario, industrial y doméstico, por
desconocimiento y sin reparar en sus consecuencias a corto o largo plazo. La preocupación
por preservar el medio ambiente de las últimas décadas ha llevado poco a poco a tomar
medidas con legislaciones para las sustancias que se consideran contaminantes. (Mahnil et
al., 2004). De esta manera la comunidad científica ha centrado sus esfuerzos en el estudio y
determinación de los posibles contaminantes químicos y proceder después a su legislación.
La mayoría de los estudios realizados hasta la fecha han sido dirigidos hacia los llamados
contaminantes prioritarios, sin embargo, existen otros contaminantes, a los que se les ha
llamado contaminantes emergentes que hasta la fecha han alcanzado poca atención.
La lista de contaminantes emergentes incluyen una variedad de productos que van
desdeproductos de uso urbano comoprincipios activos farmacológicosy productos del
cuidado personalhasta productos industriales. (Castiglioni et al., 2005; Garcia-Ac et al.,
2009).
Los principios activos farmacológicos han despertado un gran interés en los últimos
años, no sólo porque su consumo se cifra en cientos de toneladas por año (Zuccato et al.,
2000) sino porque además son sustancias diseñadas por su actividad biológica y sus efectos
en organismos son desconocidos. En la actualidad los principios activos farmacológicos
que se consideran más peligrosos e investigados son:
- Los antibióticos, ya que las bacterias pueden hacerse inmunes a los antibióticos
creándose cepas resistentes.
- Los radiofármacos, tienen una legislación muy estricta en cuanto a su vertido a la
red de saneamiento hospitalario pero que consiste en una dilución o en una
contención del efluente hasta alcanzar el período de semidesintegración de los
compuestos.
- Los medios de contraste radiológicos para rayos X, son compuestos orgánicos
iodados muy persistentes.
8
- Las hormonas, como los estrógenos que se emplean como anticonceptivos y en el
tratamiento de desórdenes hormonales, que son capaces de afectar a organismo
terrestres y acuáticos, como ciertas especies de peces que absorben estas sustancias
afectando a su proceso reproductivo e incluso su comportamiento sexual.
Muchos de estos principios activos sólo se administran en hospitales o en centros de
salud, bien por las condiciones especiales para su aplicación o por las necesidades de
control continuado de efectos y resultados. La preinscripción, dispensación y
administración sólo se hace bajo la responsabilidad del hospital. Algunos ejemplos de estos
fármacos hospitalarios son: antirretrovirales, antiinfecciosos, calcitriol intravenoso,
antianémicos (eritropoyetina) y agentes antineoplásicos (Sacher et al., 2001).
La principal vía de entrada de todos estos principios activos farmacológicos al medio
ambiente son las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs) ya que muchos de
estos fármacos se excretan fuera del organismo a través de la orina y de la heces sin
cambios o en forma de metabolitos activos que pasan a la red de alcantarillado municipal
(Kümmerer et al., 1997). El agua en las EDARsse trata y se vierte finalmente al cauce de
un río cercano. No obstante, las depuradoras de aguas basadas en tecnologías
convencionales no están preparadas para eliminar estos principios activos, que tanto estas
sustancias pueden alcanzar los cauces de los ríos, las aguas subterráneas y contaminar los
acuíferos, así como llegar al suelo a través de la aplicación de los lodos generados como
subproducto del tratamiento de depuración, afectando al ecosistema terrestre y a través de
la cadena trófica pasar el ser humano (Figura 1).
Figura 1. Esquema de introducción de fármacos hospitalarios en el medio ambiente
Hospital
Hogares
RíosAgua
subterráneaAgua potableEDAR
Industria
Ganadería AgriculturaLodos
red alcantarillado
municipalfiltraciónevacuación
red de
alcantarillado
producción
aplicación
percolación
distribución
vertidovertido
9
El interés por los productos farmacológicos en el medio ambiente comenzó en 1990
(Daughton et al., 1999) y desde entonces el número de publicaciones no han dejado de
crecer exponencialmente. Entre los principios activos farmacológicos más estudiados, se
encuentran antiinflamatorios, antibióticos o reguladores lipídicos, debido
fundamentalmente a su amplio consumo, sin embargo otros como los principios activos
antineoplásicos usados en la lucha contra el cáncer, pueden presentar mayor toxicidad, pese
a encontrarse a concentraciones de nanogramos por litro (ng L-1).
Existen más de 50principios activos antineoplásicosempleados en hospitales de países
desarrollados de manera rutinaria, a éstos se le suman unos 15 más en fase de ensayo
clínico (Johnson et al., 2008), si bien su consumo actual es bajo en comparación con los
otros principios activos farmacológicos, su demanda anual aumenta un 10 %.
Los principios activos antineoplásicos están diseñados para dañar el DNA, inhibir su
síntesis y la replicación celular. Esto hace que tengan efectos citotóxicos, mutagénicos y/o
teratogénicos (Mahnik et al., 2004). Además no actúan de manera selectiva, afectando a
todas las células en crecimiento.
La mayoría de los principios activos antineoplásicos se administran por vía intravenosa
en una clínica o un hospital, pero también hay otras formas de administración como la oral,
la tópica o la inyección intramuscular o intraósea. A nivel mundial, los principios activos
antineoplásicos más administrados son 5-fluorouracilo, seguido de gemcitabina, ifosfamida,
ciclofosfamida y metotrexato (Kovalova et al., 2009). La tendencia actual es a su
administración oral en hospitales o centros de salud y a un aumento de la dosis (para un
tratamiento más eficaz) pues cada vez se controlan mejor los efectos secundarios. Por
tanto, los hospitales, pueden actúan como fuente de entrada de estos principios activos al
medio amiente.
1.2. PROPIEDADES DE LOS FÁRMACOS HOSPITALARIOS
ANTINEOPLÁSICOS
Las propiedades físico-químicas de los principios activos antineoplásicos determinan su
comportamiento y su destino medio ambiental. Además tienen una gran importancia en el
diseño del método analítico. Las principales propiedades físico-químicas de los principios
activos antineoplásicos seleccionados vienen dadas en la Tabla 1. A continuación
describiremos algunas de las propiedades de estos fármacos.
10
Tabla 1. Propiedades físicas y químicas de los principios activos antineoplásicos
CAS
Fórmula
Peso molecular (g mol-1)
Solubilidad (g L-1)[1]
KH (atm m3/mol)[2]
pKa[1]
Kow[2]
Log P[2]
Presión vapor (mm Hg)[2]
Fármacocinética (h, vida media) [2]
CICLOFOSFAMIDA
50-18-0
C7H15Cl2N2O2P
261.09
40.0
1.40·10-11
-
- 2.46
0.80
4.45·10-05
3 - 12
CITARABINA
147-94-4
C9H13N3O5
243.22
43.80
1.57·10-19
13.93
-
-2.80
8.74·10-12
1 - 3
DOCETAXEL
114977-28-5
C43H53NO14
807.88
0.025
-
12.02
-
2.40
-
86
DOXORUBICINA
23214-92-B
C27H29NO11
543.52
1.18
2.23·10-23
11.02
1.27
-0.50
8.99·10-25
12 – 18.5
EPIRUBICINA
56420-45-2
C27H29NO11
543.52
1.18
2.20·10-23
11.02
-
- 0.50
2.50·10-23
-
ETOPÓSIDO
334419-42-0
C29H32O13
588.56
58.7
1.75·10-30
12.28
0.60
1.00
5.40·10-23
6
CAS
Fórmula
Peso molecular (g mol-1)
Solubilidad (g L-1)[1]
KH (atm m3/mol)[2]
pKa[1]
Kow[2]
Log P[2]
Presión vapor (mm Hg)[2]
Fármacocinética (h, vida media) [2]
5-FLUOROURACILO
51-21-8
C4H3FN2O2
130.08
< 1
1.66·10-10
8.02
- 0.89
- 0.80
2.68·10-06
0.25
GEMCITABINA
95058-81-4
C9H11F2N3O4
263.20
22.3
1.70·10-17
3.60
- 2.01
- 1.40
1.7·10-09
1.5 – 10.6
IFOSFAMIDA
3778-73-2
C7H15Cl2N2O2P
261.10
3.78
1.36·10-11
-
0.86
0.80
2.98·10-05
70% en 72h
CAS
Fórmula
Peso molecular (g mol-1)
Solubilidad (g L-1)[1]
KH (atm m3/mol)[2]
pKa[1]
Kow[2]
Log P[2]
Presión vapor (mm Hg)[2]
Fármacocinética (h, vida media) [2]
[1] IPCS (www.inchem.org), [2] HSDB, Hazardous Substances Data Bank
11
Los fármacos hospitalarios objeto de estudio son compuestos polares (pKa), con un
coeficiente de partición octanol-agua (Kow) y coeficiente de reparto (LogP) de entre – 2.8 y
4, poco volátiles y neutros (a excepción del metotrexato).
La constante de disociación, pKa es la constante de equilibrio que describe el grado de
disociación de un compuesto a un pH determinado. Si tenemos en cuenta que el pH
promedio de las aguas de un río común es aproximadamente 7, de acuerdo con los valores
de pKa de los compuestos dados en la Tabla 1, sólo el metotrexato tiene carácter anfótero y
podrá disociarse, el resto de compuestos son neutros a este pH. La disociación del
metotrexato aumentará su movilidad acuosa y en última instancia afectar a su destino
IRINOTECAN
100286-90-6
C33H38N4O6
586.68
0.11
-
-
-
3.20
-
6 – 12
MITOMICINA
50-07-7
C15H18N4O5
334.33
8.43
10.9
- 0.40
-
- 1.60
-
8 – 48
METOTREXATO
59-05-2
C20H22N8O5
454.44
2.60
4.70
- 1.85
1.54·10-31
- 2.20
2.09·10-19
3 – 15
CAS
Fórmula
Peso molecular (g mol-1)
Solubilidad (g L-1)[1]
KH (atm m3/mol)[2]
pKa[1]
Kow[2]
Log P[2]
Presión vapor (mm Hg)[2]
Fármacocinética (h, vida media) [2]
PACLITAXEL
33069-62-4
C47H51NO14
853.91
0.006
-
11.99
-
3.00
-
5 – 8
VINORELBINA
71486-22-1
C45H54N4O8
778.93
0.012
-
15.05
4.84
4.00
-
27 – 44
CAS
Fórmula
Peso molecular (g mol-1)
Solubilidad (g L-1)[1]
KH (atm m3/mol)[2]
pKa[1]
Kow[2]
Log P[2]
Presión vapor (mm Hg)[2]
Fármacocinética (h, vida media) [2]
[1] IPCS (www.inchem.org), [2] HSDB, Hazardous Substances Data Bank
12
ambiental. Todos los compuestos son muy solubles (salvo doxetacel y paclitaxel) como
indican los valores de solubilidad dados en la Tabla 1.
Para determinar la absorción y la afinidad de una sustancia por las partículas de suelo,
sedimentos o lodos, se emplea el coeficiente de partición octanol-agua (Kow). Este
coeficiente deriva del coeficiente de distribución octanol-agua (Dow) y depende del pH,
pues en función de él, se ionizan los grupos funcionales de los compuestos. El valor de
Dow se corrige según la ionización de los compuestos de manera que sólo se considera la
concentración de especie no ionizada (Kow).
Como una primera aproximación estos fármacos se esperan que se encuentren en los
ecosistemas acuáticos principalmente y no en los lodos (ya que al ser poco lipofílicos, serán
poco adsorbidos por las partículas sólidas del lodo).
La mayoría de los principios activos antineoplasicos tienen baja biodegradabilidad,
muchos de estos productos farmacéuticos son hidrofílicos y no se absorben fácilmente en
los lodos; algunos de los compuestos contienen átomos de halógeno (de los 14 compuestos
de este estudio, 6 son halogenados) y muchos pueden ser tóxicos para las propias bacterias.
Estos fármacos hospitalarios por efecto de la luz pueden foto-descomponerse, pero lo
hacen principalmente aquellos que poseen transición -electrón de las estructuras con
dobles enlaces, los grupos donadores de electrones (NH2 y OH) y los grupos aceptores de
electrones (COOH, NO2, C-halógeno).
La presión de vapor y el coeficiente de Henry (KH) dan una idea de la volatilidad de los
compuestos, estos valores vienen dados en la Tabla 1, y podemos deducir que la fracción
eliminada por volatilización se considera insignificante, pues tanto la presión de vapor,
como el coeficiente de Henry son muy bajos.
1.3. METODOLOGÍAS ANALÍTICAS
No existe una metodología para la determinación simultánea de fármacos hospitalarios
en matrices medio ambientales tales como influentes o efluentes de EDARs, aguas
superficiales, aguas potables olodos. En la Tabla 2se muestran algunos de los métodos
analíticos aplicados en la determinación de fármacos hospitalarios antineoplásicos en
algunas muestras medio ambientales, así como los métodos de extracción de los analitos,
13
técnicas de la determinación analítica, las recuperaciones y concentraciones encontradas en
muestras medio ambientales.
Tabla 2. Métodos analíticos en la determinación de principios activos antineoplásicos en muestras
medioambientales
Compuesto Muestra Método de extracción
Determinación analítica
Recuperación (%)
Referencias Concentración
(ng L-1)
Ciclofosfamida
Efluente de hospital SPE (C18) + SPE
(SiOH) GC-MS
30 6 T. Steger-Hartmann et al., 1996 Ifosfamida 39 7
Ifosfamida Efluente de hospital SPE (RP-18) GC/MS 39 7 K. Kümmerer et al., 1997
Ciclofosfamida Efluente de hospital, agua potable SPE (C18) LC/MS-MS
57 50 - 250
T.A. Ternes et al., 1998 Ifosfamida 51 50 - 100
Ciclofosfamida Agua superficial SPE (Oasis MCX) LC/MS-MS 70 0.02 E. Zuccato et al., 2000
Ciclofosfamida Agua superficial y agua potable SPE (PPL Bond-Elut) HPLC/MS-MS
71 - 102 10
F. Sacher et al., 2001 Ifosfamida 73 - 87 4.2
Fluorouracilo Efluente de hospital SPE ENV+ HPLC/CE 88 1700* S. Mahnik et al., 2004
Ciclofosfamida
Efluente
SPE (Lichrolut EN)
LC/MS-MS
106 1.90*
S. Castiglioni et al., 2005 Metotrexato SPE (Oasis MCX) 76 0.83*
Doxorubicina
Efluente de hospital SPE (C8 columns) HPLC/FL
85 50
S. Mahnik et al., 2006 Epirubina 86 60
Ciclofosfamida Influente, efluente, agua superficial, agua subterránea SPE (Bio-Beads SM) LC/MS-MS
74 - 94 0.02 - 1
I. Buerge et al., 2006 Ifosfamida 75 - 102 0.02 - 2
Ciclofosfamida Influente, efluente, agua potable
SPE (Strata X)
LC/MS-MS
80 5.0 - 6.0
A. Garcia-Ac et al., 2009 Metotrexato SPE (Strata C8) 69 11.0 - 16
Fluorouracilo
Efluente de hospital SPE (Isolute ENV+) LC/MS-MS
46 <5.0
L. Kovalova et al., 2009
Citarabina Gemcitabina 79 0.9
Ciclofosfamida
Influente, efluente SPE (HLB + WAX) UPLC/MS-MS 45 - 109 0.5 - 7.0 J. Yin et al., 2010
Doxorubicina
Etopósido
Ifosfamida
Metotrexato
Ciclofosfamida
Influente de hospital SPE (Oasis HLB) LC/MS-MS
104 2.0
C. Ort et al., 2010 Ifosfamida 95
* límites de cuantificación del método
La determinación simultánea de fármacos hospitalarios antineoplásicos requiere de un
método analítico multiresiduo capaz de analizar distintos grupos de compuestos muy
diferentes entre sí. Además requiere de una situación de compromiso en la selección de las
condiciones experimentales, aunque para algunos analitos no sean las más satisfactorias.
Para la determinación de los principios activos antineoplásicos se necesitan de herramientas
con gran sensibilidad y especificidad capaz de medir a niveles de los ng L-1.
La electroforesis capilar/espectrometría de masas (CZE/MS) se empleó en la
determinación de estos principios activos farmacológicos (Macià et al., 2004), no obstante,
es una técnica poco sensible y quedó limitada en la determinación de estos
compuestos(Maijó et al., 2011).
14
El desarrollo de nuevas técnicas como cromatografía de gases/espectrometría de masas
(GC/MS) y cromatografía de líquidos/espectrometría de masa (LC/MS) han supuesto un
avance en la determinaciónde fármacos hospitalarios antineoplásicos con buena
sensibilidad.
Las nuevas técnicas como los tándem LC/MS/MS acoplan un equipo de HPLC
(cromatografía líquida de alta resolución) y dos analizadores de espectrometría de masas
(MS), este acople permite eliminar otros iones o fragmentos que pueden interferir en el
análisis. Los analizadores más extendido en la determinación de fármacos hospitalarios
antineoplásicosen muestras medio ambientales son los analizadores de triple cuadrupolo
(QqQ) y tiempo de vuelo (TOF) (Garcia-Ac et al., 2009; Lavén et al., 2009; Ort et al.,
2010).
Las posibles interferencias de la matriz de las muestras medio ambientales hace
necesario aplicar un método de extracción que permita separar los analitos de la matriz
interferente.
Entre los métodos de extracción utilizados se encuentra la micro extracción en fase
sólida (SPME) o la “Stir Bar Sortive Extraction” (SBSE), aunque estas técnicas quedan
limitadas a la determinación de compuestos que posean similar polaridad.
La SPE es, sin embargo, el método de extracción más extendido en la determinación de
fármacos hospitalarios. Este método de extracción presenta la ventaja de además de ser
más económico, permite la extracción de una amplia variedad de analitos.
Los principios activos antineoplásicos empezaron a extraerse con los cartuchos C18 de
base de sílice (T. Steger-Hartmann et al., 1996, K. Kümmerer et al., 1997, T.A. Ternes et
al., 1998) pero posteriormente aparecieron nuevos cartuchos (Oasis HLB, MCX, WAX,
WCX, …) que aumentaban entre 2 y 3 veces más el área superficial respecto a los
anteriores, presentando un claro aumento la capacidad de retención y los valores de
recuperación (Ort., et al 2010; Yin., et al 2010; Castiglioni et al., 2005; Zuccato et al., 2000).
1.4. OBJETIVO
El objetivo de este trabajo es proponer un método analítico de rutina para la
determinación simultánea de 14 fármacos hospitalarios antineoplásicos en aguas residuales
(influentes y efluentes de EDARs y en aguas superficiales. El método se basa en la
15
extracción y concentración de los analitos empleando la SPE y posterior determinación por
cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de masas de triple
cuadrupolo (HPLC/MS/MS).
16
2.Procedimiento
experimental
17
18
2. PROCEDIMIENTO EXPRERIMENTAL
2.1. PRINCIPIOS ACTIVOS ANTINEOPLÁSICOS
Los principios activos antineoplásicos estudiados fueron metotrexato, citarabina, 5-
flourouracilo, ifosfamida y mitomicina C de Streptomyces caespitosus(Sigma-Aldrich; Steinheim,
Alemania), ciclofosfamida (Fluka; Steinheim, Alemania), docetaxel, doxorubicina,
epirubicina, etopósido, gemcitabina, paclitaxel y vinorelbina (European Pharmacopoeia
Reference Standards; Strasbourg, Francia), irinotecan (Tokio Chemical Industry; Tokio,
Japón).
2.2. TOMA DE MUESTRAS
Las muestras de aguas residuales fueron tomadas de cuatro EDARs situadas en la
provincia de Sevilla en enero de 2011. Las cuatro EDARs trabajan con dos líneas de
tratamientos. La línea de aguas consta de un pretratamiento, un tratamiento primario
mediante sedimentación y un tratamiento secundario basado en lodos activados. La línea
de lodos se basa en el espesado de los lodos generados y en su posterior digestión en
condiciones anaerobias. Se tomaron muestras de aguas influentes y efluentes durante un
periodo de tiempo de 24 horas. Las muestras integradas fueron almacenadas en botes de
vidrios color ámbar y transportadas al laboratorio para su análisis.
Las muestras de agua superficialesfueron tomadas del Río Guadalquivir, al que se vierte
las aguas las EDARs, empleando un toma muestras manual en enero de 2011. Las
muestras fueron almacenadas también en botes de vidrio y tratadas in situ en el laboratorio.
2.3. TRATAMIENTO DE LA MUESTRAS
Una alícuota de muestra de 250 mL fue filtrada empleando filtros de fibra de vidrio
(Whatman, Mainstone, Reino Unido) con un tamaño de poro de 1.2 µm para eliminar los
sólidos en suspensión. Una vez filtrada se añadieron 100 µL de una disolución de
fenacetina (Cambridge Isotope Laboratories; Andover, MA, USA) hasta una concentración
de 50 µg L-1.
Los cartuchos para la SPE, Oasis HLB 3cc (60 mg) (Water,Milford, MA; USA),
fueronacondicionados con 3 mL de metanol y 3 mL de agua desionizada a un flujo de 3
mL min-1. A continuación se pasóla muestra de agua empleando el equipo de extracción en
19
fase sólida conectado a una bomba de vacío Manifold, a un flujo aproximado de 15 mL
min-1 con ayuda de tubos de teflón.
Posteriormente los cartuchos se limpiaron con 3 mL de agua desionizada a un flujo de 3
mL min-1. La elución de los analitos se realizó tomando cuatro alícuotas de 1 mL de
metanol, a un flujo de 1 mL min-1. El extracto se sometió a una corriente suave de
nitrógeno hasta sequedad. Finalmente el residuo obtenido se reconstituyó con 1 mL de
metanol, se filtró con un filtro de nylon de 0.45 µm y se inyectaron 20 µL en el
LC/MS/MS.
2.4. ANÁLISIS HPLC/MS/MS
El análisis cromatográfico se llevó a cabo en un HPLC Agilent de la serie 1200(Agilent,
USA) equipado con: desgasificador, bomba binaria, muestreador automático,
compartimento termostatizado de la columna. La detección se llevó a cabo empleando
como detector un espectrómetrode masas de triple cuadrupolo 6410 QqQ (Agilent, USA)
con ionización por electrospray (ESI).
La separación cromatográfica se realizó empleando una columna Zorbax Eclipse XDB-
C18 Rapid Resolution HT (4.6x50 mm d.i.; 1.8 m) (Agilent, USA). Los analitos fueron
separados por elución en gradiente empleando una disolución 15 mM de formiato amónico
y acetonitrilo. El gradiente de elución empleado se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3. Gradiente de elución
Tiempo (min) % A % B
0.00 95.0 5.0 7.00 40.0 60.0 8.00 10.0 90.0 9.00 10.0 90.0 9.10 95.0 5.0 12.00 95.0 5.0
En la Figura 2 se muestra un cromatograma de una disolución patrón de una
concentración de 1 ppm de los principios activos antineoplásicos obtenido con el software
del equipo HPLC/MS/MS.
20
Figura 2. Cromatrograma de una disolución patrón de 1 ppm de principios activos antineoplásicos
Para la identificación de los analitos se usaron las dos transiciones más intensas de cada
compuesto, salvo en el caso de los principios activos antineoplásicos citarabina, epirubicina
y fluorouracilo, que sólo tuvieron una única transición (debido a su poca fragmentación).
Para obtener las mayores señales,las transiciones en MRM se midieron en cinco
segmentos de tiempos. En el período 1 (0 - 2.5 min) se midieron citarabina, fluorouracilo y
gemcitabina con un tiempo de barrido de 100 ms. En el período 2 (2.5 – 5.5 min)
metotrexato y mitomicina se midieron con un tiempo de barrido de 140 ms. En el período
de tres (5.5 – 7.2 min) se midieron ciclofosfamida, doxorubicina, epirubicina, etopósido,
ifosfamida, irinotecan y el patrón interno (fenacetina) con un tiempo de barrido de 100 ms,
a excepción de ciclofosfamida y ifosfamida (con tiempo de barrido de 200 ms con el fin de
mejorar la sensibilidad). En el período 4 (7.2 - 8.7 min) se midió vinolrebina con un tiempo
de barrido de 180 ms. En el último período, el 5, (8.7 –10.5 min) se midieron docetaxel y
paclitaxel con un tiempo de barrido de 180 ms.
La Tabla 4 muestra, el tiempo de retención, el ión precursor, las transiciones, el
fragmentor y la energía de colisiónde los principios activos antineoplásicos estudiados. La
mayoría de los compuestos se ionizaron positivamente, a excepción del fluorouracilo y
epirubición, cuya ionización fue negativa.
21
Tabla 4. Optimización de los parámetros de MRM en la determinación de QqQ-MS
Principio activo
Tiempo retención (min)
Ión precursor (m/z)
MRM 1 (cuantificación)
MRM 2 (confirmación)
Fragmentor (V)
Energía colisión (V)
Citarabina 0.85 266 [M+Na]+ 266>134 - 180 12
Fluorouracilo 1.25 129 [M-H]- 129>42.1 - 100 15
Gemcitabina 1.45 264 [M+H]+ 264>112 264>95.0 180 12
Metotrexato 4.40 455 [M+H]+ 455>308 455>175 140 16
Mitomicina 4.85 357 [M+Na]+ 357>242 357>274 140 24
Irinotecan 6.06 587 [M+H]+ 587>124 587>167 180 36
Ifosfamida 6.26 261 [M+H]+ 261>92 261>154 138 24
Doxorubicina 6.29 544 [M+H]+ 544>397 544>379 135 10
Epirubicina 6.43 542 [M-H]- 542>395 - 145 8
Ciclofosfamida 6.48 261 [M+H]+ 261>140 261>106 131 20
Fenacetina, P.I. 6.66 180 [M+H]+ 180>110 180>163 89 16
Etopósido 6.79 606 [M+NH4]+ 606>229 606>185 114 16
Vinorelbina 7.36 779 [M+H]+ 779>658 779>323 175 20
Docetaxel 9.58 830 [M+Na]+ 830>549 830>304 135 20
Paclitaxel 9.64 876 [M+Na]+ 876>308 876>474 180 24
El control y la adquisición de los datos se realizaron con software MassHunter (Agilent,
EE.UU.). Los analitos se identificaron comparando los tiempos de retención y los
espectros de masas para cada uno de los principios activos antineoplásicos estudiados.
En la Figura 3se muestrael cromatograma de las transiciones MRM 1 y MRM 2y el
espectro de masas para cada principio activo antineoplásico. A excepción de los
compuestos citarabina, epirubicina y fluorouracilo que sólo poseen una transición MRM 1.
Figura 3. Cromatogramas y espectros de masas de los fármacos hospitalarios
Ciclofosfamida
Citarabina
22
Docetaxel
Doxorubicina
Epirubicina
Etopósido
Fluorouracilo
Gemcitabina
Ifosfamida
Irinotecan
Mitomicina
Metotrexato
23
Paclitaxel
Vinorelbina
24
En la Figura 4 se muestran el cromatogramaobtenido para una disolución patrón de 50
µg L-1entodos los principios activos antineoplásicos y en el patrón interno.
Figura 4. Cromatograma de un patrón de 50 µgL-1
0
400
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Citarabina
40
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
5-Fluorouracilo
0
400
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Gemcitabina
0
4000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Metotrexato
0
600
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Mitomicina
0
4000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Irinotecan
0
11000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Ifosfamida
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Doxorubicina
30
150
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Epirubicina
0
10000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Ciclofosfamida
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Fenacetina (P.I.)
0
1500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Etopósido
0
1500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Vinorelbina
0
1500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Docetaxel
0
3000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Tiempo (min)
Paclitaxel
25
26
3.Optimización del
método analítico
27
28
3. OPTIMIZACIÓN DE PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
3.1. OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO
La columna cromatrográfica permitió separar los 14 principios activos antineoplásicos
en 10 minutos, además de obtener una separación satisfactoria de cada uno de ellos,
reduciendo el tiempo de análisis y por tanto el consumo de disolventes de las fases móviles.
3.2. OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN
La extracción en fase sólida fue optimizada mediante el dopaje de alícuotas de 250 mL
de agua potable a 4 µg L-1 en los fármacos hospitalarios antineoplásicos a estudiar, por
triplicado. Se probaron diferentes tipos de rellenos de cartucho (Oasis HLB, Oasis MCX y
Cromabond tetraciclina), diferentes disolventes (acetona, metanol y metil tert-butil éter) en
la fase de elución, así como, diferentes pH de la muestra (ácido, neutro y básico).
3.2.1. Optimización del cartucho de extracción
Se procede a evaluar varios tipos de cartuchos en la extracción. En el mercado existen
números tipos de cartuchos, con diferentes características físico-químicas para poder
retener todo tipo de analitos. Según la bibliografía consultada, los cartuchos más usuales
para este tipo de compuestos son los Oasis HLB, Oasis MCXy Cromabond tetraciclina.
Los cartuchos Oasis HLB tienen un relleno con balance hidrofílico-lipofílico, de fase
reversa, humectable en agua, adecuados para la SPE de todo tipo de compuestos. Están
fabricados a partir de un monómero de N-vinilpirrolidona (hidrofílica) y un monómero de
divilbenceno (lipofílica). Es capaz de proporcionar una retención superior en fase reversa,
y con una capacidad especial para retener los analitos polares.
Los cartuchos Oasis MCX tienen un relleno de retención mixta porque están elaborados
como los HLB (poli-divinilbenceno-co-N-vinilpirrolidona, DVD/NP) con grupos
sulfonatos que permite trabajar en modo mixto, como intercambiador iónico y en fase
reversa. Están diseñados para satisfacer las necesidades de la SPE moderna permitiendo
una elevada selectividad y sensibilidad en la extracción de moléculas básicas, ácidas y
neutras de matrices biológicas. Poseen alta selectividad especialmente para compuestos
básicos.
29
Los cartuchos Cromabond Tetraciclina están constituidos de sílice con octadecil
modificado y trabajan en fase reversa.
En la optimización del cartucho en la SPE se usaron tres tipos cartuchos empleando
metanol y a continuación agua desionizada en el acondicionamiento de los cartuchos. Se
pasó la muestra por los cartuchos a pH neutro y se eluyeron los analitos empleando
metanol como disolvente.
En la Figura 5 se muestran los valores de recuperaciones obtenidos para cada uno de los
compuestos en los cartuchos estudiados.
Figura 5. Valores de recuperaciones para los distintos compuestos en función del tipo de cartucho (n=3)
Las mayores recuperaciones se obtuvieron en el caso del cartucho Oasis HLB (104.8 –
68.8 %), recuperamos todos los compuestos y obtenemos una recuperación media del 90%.
Los cartuchos Oasis MCX (120.3 – 0.1 %) y el Chromabond (140.7 – 0.6 %) no recuperan
a cuatro compuestos (doxorubicina, fenacetina, irinotecan y paclitacel), entre ellos se
encuentra el patrón interno.
3.2.2. Optimización del pH de la muestra
Se prueban tres valores de pH en las muestras, ácido (pH 2), neutro (pH 7) y básico (pH
8.5). La SPE se llevó a cabo en cartuchos Oasis HLB, empleando metanol como
disolvente de acondicionamiento y elución.
El pH 2 (132.8 – 5.4 %) presentó bajas recuperaciones para fenacetina, mitomicina y
vinorelbina. Las muestras a pH 8.5 (136.6 – 0.6 %)mostraron bajas recuperaciones para
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
Oasis HLB
Oasis MCX
Chromabond
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
Oasis HLB
Oasis MCX
Chromabond
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
Oasis HLB
Oasis MCX
Chromabond
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
Oasis HLB
Oasis MCX
Chromabond
30
doxorubicin, metotrexato, paclitacel y vinorelvina. Las muestras a pH 7 (104.8 – 68.8 %)
mostraron recuperaciones medias del 90%. Así que elegimos como pH óptimo, el pH 7.
La Figura 6 muestra los valores de recuperación de los principios activos antineoplásicos
para cada uno de los valores de pH.
Figura 6. Valores de recuperaciones para los distintos compuestos en función del valor del pH (n=3)
3.2.3. Optimización del disolvente de elución
La optimización del disolvente empleado en la elución se realizó con tres disolventes,
acetona, metanol y metil tert-butil éter (MTBE) elegidos de acuerdo con el protocolo del
fabricante según el tipo de relleno del cartucho. La optimización se realizó empleando
cartuchos de extracción Oasis HLB y con un pH de la muestra de 7.
El acondicionamiento de los cartuchos se llevó a cabo de la siguiente manera:
Disolvente acetona: 3 mL acetona + 3 mL MeOH + 3 ml H2O, elución 4 ml acetona
Disolvente MeOH: 3 mL MeOH + 3 mL MeOH + 3 ml H2O, elución 4 ml MeOH
Disolvente MTBE: 3 mL MTBE + 3 mL MeOH + 3 ml H2O, elución 4 ml MTBE
Las recuperaciones obtenidas para cada uno de los disolventes estudiados se muestran
en la Figura 7.
Figura 7. Valores de recuperaciones para los distintos compuestos en función del tipo de disolvente (n=3)
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
pH 2
pH 7
pH 8.5
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
pH 2
pH 7
pH 8.5
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
pH 2
pH 7
pH 8.5
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
)
pH 2
pH 7
pH 8.5
31
El metanol (104.8 – 68.8 %) es el disolvente con mayores valores de recuperación, con
un valor medio del 90%. La acetona (106.9 – 34.8%) mostró un valor medio de
recuperación del 81.1% y el metil tert-butil éter (100.8 – 0.0 %) del 52.7%. Destacan los
valores muy bajos de doxorubicin y epirubicina tanto para acetona como el MTBE.
Optamos por el metanol para eluir en la SPE.
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
) Metanol
Acetona
Metil tert-butil éter
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
) Metanol
Acetona
Metil tert-butil éter
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
) Metanol
Acetona
Metil tert-butil éter
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
) Metanol
Acetona
Metil tert-butil éter
0
25
50
75
100
125
150
Recu
pera
ció
n(%
) Metanol
Acetona
Metil tert-butil éter
32
4.Validación
del método analítico
33
34
4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
La validación del método analítico se realizó en forma de linealidad, recuperación,
precisión,límite de detección, límite de cuantificación y efecto matriz.
4.1. LINEALIDAD
Las disoluciones de calibración seprepararon por dilución de las madres con metanol, en
el rango de 0.05 ng L-1 a 100ng L-1, para la evaluación de la linealidad se inyectaron los
patrones de calibración de 0.05, 0.07, 0.10, 0.50, 1.00, 10.0, 20.0, 50.0, 70.0 y 100 ng L-1.
Las rectas de calibrado miden la relación de respuesta del patrón interno (área de los
analitos dividida por el área del patrón interno) frente a las concentraciones de cada uno de
los patrones. La linealidad se evaluó por el coeficiente de correlación (r2) de la recta
obtenida.
Tabla 5. Rango lineal y valores del coeficiente de correlación para los distintos compuestos
Compuesto Rango lineal (ng L-1) r2
Citarabina 5.52 - 80 0.9999
Ciclofosfamida 4.80 - 200 0.9981
Docetaxel 5.03 - 200 0.9989
Doxorubicina 13.8 - 400 0.9999
Epirubicina 2.35 - 200 0.9981
Etopósido 7.16 - 200 0.9995
Fluorouracilo 70.4 - 4000 0.9914
Gemcitabina 3.29 - 200 0.9982
Ifosfamida 3.78 - 400 0.9984
Irinotecan 2.98 - 80 1.0000
Metotrexato 0.27 - 40 0.9988
Mitomicina 5.54 - 200 0.9999
Paclitaxel 0.81 - 80 0.9989
Vinorelbina 13.3 - 200 0.9998
Todos los compuestos poseen un coeficiente de correlación mayor de 0.998, salvo el
fluorouracilo cuyo valor es un poco menor, 0.991.
35
4.2. RECUPERACIÓN
Los estudios de recuperación se llevaron a cabo mediante el cálculo de las
recuperaciones de cada principio activo antineoplásico en tres tipos diferentes de muestras
de aguas residuales influentes y efluentes y aguas superficiales.
Para ello se prepararon por triplicado muestras de aguas dopadasa una concentración de
4 g L-1 cada uno de los principios activos al principio del tratamiento. En paralelo se
trataron muestras de aguas residuales y superficiales sin dopar (blancos).
Ambos tipos de muestras se trataron como se describe en el apartado 2.3. Los valores
de recuperación se calcularon de acuerdo con la expresión:
Recuperación (%) = [Adopada – Ablanco] / Apatrón
En la Tabla 6 se muestran los valores obtenidos para cada principio activo
antineoplásico, para cada tipo de muestra.
Tabla 6. Valores de recuperaciones (%) para los distintos tipos de muestras de aguas (n=3)
En las muestras de agua superficial el promedio de recuperaciones fue del 75.5%,
excluyendo a la citarabina, metotrexato y docetaxel que poseen valores más bajos (21 –
34%). En las muestras de agua influente el promedio de recuperaciones fue del 73.0%,
Compuesto Agua
superficial Aguainfluente Aguaefluente
Citarabina 27 20 24
Fluorouracilo 46 28 50
Gemcitabina 77 64 77
Metotrexato 34 25 32
Mitomicina 80 72 61
Irinotecan 43 50 58
Ifosfamida 90 84 78
Doxorubicina 84 68 69
Epirubicina 73 67 57
Ciclofosfamida 91 85 84
Fenacetín (I.S.) 100 100 100
Etopósido 91 105 101
Vinorelbina 90 74 67
Docetaxel 21 20 11
Paclitaxel 66 61 41
36
excluyendo a la citarabina, fluorouracilo, metotrexato y docetaxel que poseen valores más
bajos (20 – 28%). Y en las muestras de efluente el promedio de recuperaciones fue del
67.5% (salvo citarabina, metotrexato y docetaxel, 11 – 32%).
Así que los valores de recuperación oscilan entre el 41 – 99%.
4.3. LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
La sensibilidad del método se evaluó con los límites de detección (LD) y cuantificación
(LC). El límite de detección se define como la concentración o cantidad más pequeña de
analito que puede detectarse con una certeza razonable mediante un determinado
procedimiento analítico. Y el límite de cuantificación se define como la concentración o
cantidad más pequeña de analito que puede determinarse cuantitativamente mediante un
procedimiento analítico con una calidad metrológica preestablecida.
El LD y el LC fueron calculados empleando la relación señal/ruido, obtenida en cada
tipo de muestra con el software del equipo HPLC/MS/MS y según el tratamiento de
muestras descrito en la sección 2.3.
El límite de detección se determinó como la concentración de analito para la cual la
relación señal/ruido es igual a 3, aplicando el factor de dilución del método de extracción y
los valores de recuperaciones de la metodología. El límite de cuantificación se evaluó de
forma análoga considerándolo como la concentración de analito cuya relación señal/ruido
igual a 10.
Los LD fueron de entre 0.08 y 38.4 ng L-1. Y los LC fueron de entre el 0.27 yel 128 ng
L-1. Destacan los altos valores de LD y LC para el fluorouracilo, y puede deberse a la poca
fragmentación del compuesto que disminuyen sus valores de sensibilidad.
En la Tabla 7se muestran los LD y los LC para cada analito y para cada tipo de muestra.
37
Tabla 7. Límites de detección y cuantificación para los distintos tipos de muestras de aguas
Compuesto
Agua superficial Agua influente Agua efluente
LD(ngL-
1) LC(ngL-
1) LD(ngL-
1) LC (ngL-
1) LD(ngL-
1) LC (ngL-
1)
Ciclofosfamida 1.66 5.52 2.13 7.11 2.29 7.65
Citarabina 1.44 4.80 1.47 4.89 1.47 4.89
Docetaxel 1.51 5.03 1.89 6.30 1.65 5.49
Doxorubicina 5.27 17.6 4.15 13.8 4.29 14.3
Epirubicina 3.49 11.6 3.75 12.5 0.70 2.35
Etopósido 2.15 7.16 3.38 11.3 2.95 9.82
Fluorouracilo 34.1 114 38.4 128 21.1 70.4
Gemcitabina 0.99 3.29 1.43 4.78 2.61 8.71
Ifosfamida 1.31 4.38 1.72 5.75 1.14 3.78
Irinotecan 0.89 2.98 1.12 3.74 1.04 3.45
Metotrexato 0.10 0.32 0.10 0.32 0.08 0.27
Mitomycin C 2.21 7.36 1.66 5.54 1.97 6.57
Paclitaxel 0.25 0.83 0.26 0.85 0.24 0.81
Vinorelbina 3.98 13.3 5.18 17.3 4.48 14.9
4.4. PRECISIÓN
La precisión es una medida de la variabilidad de los resultados, generalmente descriptos
por la desviación estándar relativa (DSR%), se relaciona con el error aleatorio. La precisión
puede ser evaluada en formas de precisión intradía o intraensayo y precisión interdía o
interensayo. Ambas precisiones se evaluaron en los tres tipos de muestras de aguas
estudiadas mediante la medida de muestras dopadas con losprincipios activos
antineoplásicos y tratadas como se describe en la sección 2.3. En la Tabla 8se muestran los
resultados obtenidos.
En los estudios de precisión intradía del porcentaje de desviación estándar relativa
fueron de 1-18%, 2-11% y 1-7% en agua superficial, agua influente y agua efluente,
respectivamente (como media para todos los compuestos). Sin contar los valores de
desviación para la gemcitabina, cuyo promedio, fue del 14% (el valor más alto de
desviación). En el caso de los estudios de precisión interdía los porcentajes de desviación
estándar relativa media de todos los compuestos fueron del 14% tanto para agua
superficial, influente y efluente, a excepción nuevamente de la gemcitabina cuyo valor de
recuperación fue del 19%.
38
Tabla 8. Valores de desviación estándar relativa para los distintos tipos de muestras de aguas
Compuesto
Agua superficial Agua influente Agua efluente
DSR(%)Intradía
DSR(%)Interdía
DSR (%)Intradía
DSR (%)Interdí
a DSR
(%)Intradía
DSR (%)Interdí
a
Ciclofosfamida 5 9 4 9 4 10
Citarabina 2 5 7 7 3 5
Docetaxel 9 8 9 10 3 8
Doxorubicina 7 10 3 3 4 6
Epirubicina 4 4 9 11 7 8
Etopósido 8 15 7 12 7 14
Fluorouracilo 8 10 11 14 2 6
Gemcitabina 18 20 19 22 5 16
Ifosfamida 5 6 7 10 4 6
Irinotecan 2 4 4 6 1 4
Metotrexato 5 7 5 5 3 3
Mitomicina 5 5 2 5 4 8
Paclitaxel 1 3 5 10 2 5
Vinorelbina 6 6 5 9 5 5
Estos valores de DSR (%) son satisfactorios para el análisis de muestras de aguas en el
medio ambiente.
4.5. EFECTO MATRIZ
El efecto matriz es uno de los problemas más típicos cuando se trabaja con equipos
HPLC/MS/MS. Este efecto es un aumento o disminución de la repuesta de los analitos de
interés debido a la presencia de otros componentes de la propia matriz de la muestra. La
evaluación del efecto matriz se realizó mediante la comparación de las señales obtenidas
con disoluciones patrones, un extracto de muestra sin dopar y un extracto dopado. La
determinación se realizó empleando la siguiente expresión:
Efecto matriz (%) = {Aextracto con PI – Aextracto sin PI / Apatrón}·100
Si el porcentaje se encuentra por debajo del 100 % se trata de supresión y si está por
encima se trata de exaltación.
La mayoría de los principios activos antineoplásicos sufren el fenómeno de supresión
iónica, (citarabina, docetaxel, irinotecan, mitomicina y paclitaxel) como vemos en la Figura
8, mientras que el docetaxel es el único que sufre exaltación iónica en las tres tipos de
39
muestras ambientales. El efecto para los compuestos etopósido, fluorouracilo y
gemcitabina depende del tipo de muestra, pues en algún caso es supresión y en otros
exaltación iónica.
Hay cuatro principios activos antineoplásicos que apenas se afectaron por la matriz de la
muestra medio ambiental (ciclofosfamida, epirubicina, ifosfamide y vinorelbina).
Figura 8. Efecto matriz de los fármacos hospitalarios antineoplásicos
4.6. APLICACIÓN A MUESTRAS MEDIO AMBIENTALES
El método descrito fue aplicado a la determinación de los 14 principios activos
antineoplásicos estudiados en muestras medio ambientales, aguas influentes y efluentes de
EDARs de la provincia de Sevilla y aguas superficiales.
En la Tabla 9 se muestran los valores de concentraciónobtenidos.
De todos los principios activos antineoplásicos estudiados sólo citarabina, doxetacel,
etopósido, gemcitabina, ifosfamida y vinorelbina presentaron concentraciones superiores al
límite de cuantificación de la metodología propuesta en las aguas residuales analizadas (3.5 -
15 ng L-1 en muestras de influente y 1.2 - 14 ng L-1 en muestras de efluentes). Las muestras
de agua superficial sólo se encontraron citarabina y gemcitabina en concentraciones de 13 y
2.4 ng L-1, respectivamente. El fármaco hospitalario antineoplásico que presentó mayores
concentraciones en muestras fue la citarabina.
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
Agua superficial Efluente Influente
40
41
Tabla9. Concentraciones de fármacos hospitalarios en muestras medio ambientales
Agua superficial Agua efluente Agua influente
Compuesto (ng L-1) (ng L-1) (ng L-1)
Ciclofosfamida <LD <LD <LD
Citarabina 13 14 9.2
Docetaxel <LD <LD <LD
Doxorubicina <LD <LD 4.5
Epirubicina <LD <LD <LD
Etopósido <LD 3.4 15
Fluorouracilo <LD <LD <LD
Gemcitabina 2.4 7.0 9.3
Ifosfamida <LD 1.2 3.5
Irinotecan <LD <LD <LD
Metotrexato <LD <LD <LD
Mitomicina <LD <LD <LD
Paclitaxel <LD <LD <LD
Vinorelbine <LD 9.1 <LD
42
La Figura 9 muestra un cromatograma MRM de agua residual efluente de las EDARs
obtenida por HPLC/QqQ/MS.
Figura 9. Cromatograma MRM de una muestra de efluente de agua residual
40
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Citarabina
40
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
5-Fluorourailo
40
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Gemcitabina
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Metotrexato
0
600
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Mitomicina
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Irinotecan
90
250
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Ifosfamida
0
500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Doxorubicina
30
150
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Epirubicina
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Ciclofosfamida
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Fenacetina (P.I.)
30
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Etopósido
40
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Time (min)
Vinorelbina
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Tiempo (min)
Docetaxel
0
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Inte
nsi
dad
Tiempo (min)
Paclitaxel
43
5.Conclusiones
44
45
5. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se propone un método analítico para la determinación simultánea
de 14 principios activos antineoplásicos (ciclofosfamida, citarabina, docetaxel,
doxorubicina, epirubicina, etopósido, fluorouracilo, gemcitabina, ifosfamida, irinotecan,
metotrexato, mitomicina, paclitacel y vinorelbina) en muestras de aguas residuales
influentes y efluentes de EDARs y en aguas superficiales.
La optimización del proceso se realizó actuando sobre el disolvente de extracción, la
limpieza y elución, así como el tipo de relleno del cartucho y del pH. Las mayores
recuperaciones se obtuvieron empleando cartuchos Oasis HLB, en muestras a pH 7 y
empleando metanol como disolvente de elución.
Las recuperaciones obtenidas fueron de entre el 105 y el 20 %. Los límites de detección
fueron inferiores a 17.6 ngL-1 (obviando al fluorouracilo).
La aplicabilidad del método fue evaluada mediante los análisis de muestras de aguas
residuales influentes y efluentes de EDARs y aguas superficiales.
46
47
6.Referencias
48
49
6. REFERENCIAS
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