Espectroscopa: elaboracin de una curva patrn para cuantificar la sacarosa

1. Objetivo

El objetivo de esta prctica consiste en utilizar la tcnica de espectrofotometra para

elaborar una recta patrn de sacarosa a partir de concentraciones conocidas de este

disacrido. Mediante interpolacin, esta recta permite determinar la concentracin de

sacarosa en una muestra desconocida. Se utilizar un mtodo colormetrico que utiliza

el cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) para que reaccione con la sacarosa tras su hidrlisis

qumica con HCl.

2. Fundamentos El DNS reacciona nicamente con los azcares reductores. La sacarosa es un

disacrido no reductor, pero tras su hidrlisis en medio cido se liberan glucosa y

fructosa que s son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto

coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por mtodos

espectrofotomtricos es proporcional a la concentracin de sacarosa.

Los mtodos espectrofotomtricos permiten calcular la intensidad de radiacin (luz

con una longitud de onda determinada) emitida o absorbida por una sustancia. La

cuantificacin se realiza aplicando la ley de Lambert-Beer:

A = . c . l donde:

A = Absorbancia medida en el espectrofotmetro = Coeficiente de absorcin molar a una determinada longitud de onda. Es

la absorcin de luz con una determinada longitud de onda de una disolucin

1M, cuando el paso ptico es de 1cm. Se expresa en M-1. cm-1

c = Concentracin en moles/litro (M) (en las mismas unidades que ) l = Paso ptico (espesor del tubo que contiene la disolucin, en cm). En las

cubetas estndar que se utilizan para hacer las medidas es de 1 cm.

3. Preparacin

a) Materiales

Vasos de precipitados (de 2 de 50 y 2 de 100 ml), gradilla con tubos de 20 ml, rotulador para vidrio, pipetas automticas de diversos volmenes, pipetas de vidrio con

su dispositivo para pipetear, cubetas especiales para medir en el espectrofotmetro,

espectrofotmetro visible, pipetas Pasteur de plstico, bao de agua a 90C, bao de

hielo, agitatubos, agitador magntico, tubo de dilisis.

b) Reactivos

cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), sacarosa 10 mM, HCl 2 M, NaOH 2M, NaCl 2M, agua

destilada.

b) Preparacin de los tubos con concentraciones conocidas de sacarosa

Se utilizarn tubos de cristal de unos 20 ml que se numerarn del 0 al 5. Se les

aaden distintos volmenes de una disolucin de sacarosa 10 mM (se utilizar una

pipeta automtica) y se aade agua destilada de modo que, al final, todos los tubos

tengan un volumen de 8 ml, tal y como se indica en la siguiente tabla:

Tubo n 0 1 2 3 4 5

Sacarosa 10 mM (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5

H2O destilada (ml) 8 7,5 7 6,5 6 5,5

c) Tratamiento

La sacarosa no lleva carbono anomrico libre, por lo que no es reductor. Por tanto,

antes de mezclarla con el reactivo DNS, es necesario hidrolizarla con un cido fuerte

como el HCl. Por lo tanto, la reaccin colorimtrica se lleva a cabo en 3 etapas:

1.- Hidrlisis cida:

Tubo n 0 1 2 3 4 5

Sacarosa 10 mM (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5

H2O destilada (ml) 8 7,5 7 6,5 6 5,5

HCl 2 M (ml) 1 1 1 1 1 1

AGITAR + + + + + +

Calentar 20 minutos a 100C + + + + + + Introducir en agua fra + + + + + +

2.- Neutralizacin:

Tubo n 0 1 2 3 4 5

NaOH 2M (ml) 1 1 1 1 1 1

AGITAR + + + + + +

En este momento, cada tubo contiene un volumen aproximado de 10 ml. Para

continuar con el protocolo hay que tomar 2 ml del contenido de cada tubo y transferirlos a un nuevo juego de tubos de ensayo, numerados igual que los anteriores.

3.- Reaccin con DNS (con aparicin de producto coloreado):

Tubo (nuevo) n 0 1 2 3 4 5

ml del juego de tubos anterior 2 2 2 2 2 2

cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) (ml) 1 1 1 1 1 1

AGITAR + + + + + +

Calentar 5 minutos a 100C + + + + + + Introducir en agua fra con hielo + + + + + +

H2O destilada (ml) 7 7 7 7 7 7

AGITAR + + + + + +

Medir la Absorbancia a 540 nm (A540) + + + + + +

NOTA IMPORTANTE: Cuando se manipule el DNS es necesario utilizar guantes.

d) Medida de la Absorbancia a 540 nm (A540) y elaboracin de la recta patrn

Se enciende el espectrofotmetro y se selecciona la longitud de onda de 540 nm (luz de color verde)

Se espera al menos 10 minutos para que se estabilice el aparato La absorbancia (A) se mide en tubos especiales adecuados a cada

espectrofotmetro.

Con el contenido del tubo blanco (tubo 0, [sacarosa] = 0) se ajusta la transmitancia al 100% (T = 100) o la absorbancia a cero (A = 0), siguiendo las

instrucciones del fabricante.

Para realizar las medidas se llena el tubo especial del espectrofotmetro hasta 1 cm del borde. El contenido de los tubos no se tira por la fregadera sino que

se devuelven al tubo original y se tirar despus de representar la curva patrn

en el bidn de residuos preparado a tal efecto.

Realizar las medidas comenzando por el tubo de menor concentracin y terminando con el de mayor concentracin. Los valores de A540 se van

apuntando en la tabla adjunta:

Tubo n 0 1 2 3 4 5

[sacarosa] (mM)

A540

d) Clculos y Resultados

1.- Calcular las concentraciones de sacarosa en cada tubo y aadir ese dato a la tabla anterior

2.- Representar en un grfico los datos de A540 frente a la [sacarosa] 3.- Determinar el coeficiente de absorcin molar () de la sacarosa