Elucion biobricks 2008
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Elución de Biobricks de la carpeta de 2008 Materiales: • TE (10:1), pH 8.0. • Tubos de PCR de 1.5 ml. • Tubos epp de 2 ml. • Clulas !ompete"tes !epa T#P10 • $a%o a &2'C. • "!ubadora a *'C. • +#C. • Caas petri !o" a"tibi-tios. "stru!!io"es: 1. Cale"t ar ali !uotas de 5 l de bu// er TE a 50'C e " los t ubos de P CR. Preparar u" ba%o de aua a &2'C 2. Per/or ar !o" el sa !abo!ado s i"!lui do e" le paue te e" el pu"t o do"de se e" !ue"tr a el biobr i! ue ese 3a a usar. . +oltar l a per/ora !i-" real i4ada, pre sio"a" do la parte sup erior de l sa!abo!a dos, de"t ro del tubo de 5 l !o" TE a !ale"tado. &. (#p!i o"al) Ce "tri/ uar los tubos !o " la per/o ra!i-" p or mi"ut os a 15,000 6. 5. 7ear l as per/ ora!io "es de"t ro del TE d ura"te 20 mi". Empe 4ar a des!o "elar l as !lulas !ompete"tes !olo!"dolas e" 9ielo moado. . E"/riar tubos epp de 2 ml e" 9ieo moado. ;%a dir 2 l de 7<; e" TE 50 l d e !lulas !ompete"tes T#P10 des!o"eladas. El 7<; sobra"te puede ser alma!e"ado dura"te 3arias sema"as !o"elado. *. Ma"te"e r el 7<; las ! lulas !ompet e"tes e " 9ielo dura"t e 0 mi" . 8. +umer ir la s !lul as e" u" b a%o pre! ale"ta do a &2'C dura"t e 0 seu" dos. =. "!ubar las !lulas e" 9i elo por 2 mi". 10. ;%adir 200 l de medio +#C ( re3isar ue "o est !o"tami"ado, "o debe !o"te"er a"tibi-ti!os). 11. "!ubar las !lulas a *'C !o" aita!i-" dura"te 2 9oras. 12. Platear 250 l del !ulti 3o e" u"a !aa petri !o" aar >$ a"ti bi-ti!o(s). 1. "!ubar a *'C e"t re 12 1& 9r.
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Para poder usar los biobricks que inicialmente vienen deshidratados
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Elucin de Biobricks de la carpeta de 2008
Materiales:
TE (10:1), pH 8.0.
Tubos de PCR de 1.5 ml.
Tubos epp de 2 ml.
Clulas competentes cepa TOP10
Bao a 42C.
Incubadora a 37C.
SOC.
Cajas petri con antibitios.
Instrucciones:
Calentar alicuotas de 5 l de buffer TE a 50C en los tubos de PCR.Preparar un bao de agua a 42C
Perforar con el sacabocados incluido en le paquete en el punto donde se encuentra el biobrick que ese va a usar.
Soltar la perforacin realizada, presionando la parte superior del sacabocados, dentro del tubo de 5 l con TE ya calentado.
(Opcional) Centrifugar los tubos con la perforacin por 3 minutos a 15,000 G.
Dejar las perforaciones dentro del TE durante 20 min. Empezar a descongelar las clulas competentes colocndolas en hielo mojado.
Enfriar tubos epp de 2 ml en hieo mojado. Aadir 2 l de DNA en TE y 50 l de clulas competentes TOP10 descongeladas. El DNA sobrante puede ser almacenado durante varias semanas congelado.
Mantener el DNA y las clulas competentes en hielo durante 30 min.
Sumergir las clulas en un bao precalentado a 42C durante 60 segundos.
Incubar las clulas en hielo por 2 min.
Aadir 200 l de medio SOC (revisar que no est contaminado, no debe contener antibiticos).
Incubar las clulas a 37C con agitacin durante 2 horas.
Platear 250 l del cultivo en una caja petri con agar LB y antibitico(s).
Incubar a 37C entre 12 y 14 hr.
