MEDIOS DE CULTIVO

Preparación de medios de cultivo

Los medios de cultivo se comercializan desecados, en forma de polvo, para su disolución y esterilización. Actualmente se pueden adquirir también medios sólidos ya preparados, dispuestos en frascos, que se licuan mediante ebullición y se dispensan en placas, medios líquidos en tubos y medios sólidos en placa, listos para su inoculación.

Aunque esta última práctica se ha extendido enormemente, facilitando el trabajo rutinario, conviene conocer las operaciones necesarias para conseguir preparar un medio de cultivo en buenas condiciones.

Pesado de los componentes

El pesado debe ser lo más preciso posible. Se admite un pequeño margen de error del orden del miligramo, centigramo e incluso decigramo en las peptonas.

Disolución de los componentes.

Siempre se hace en agua destilada, salvo la indicación contraria. El agua desionizada no se aconseja por que las resinas de intercambio iónico puede ceder sustancias no deseables. Los recipientes deben ser de vidrio y estar limpios. El calor favorece o es imprescindible para la disolución de algunos productos pero debe limitarse al estrictamente necesario, sin llegar la ebullición.

Ajuste del pH

Es muy importante para la calidad del medio, y necesario por la variación que proporciona la temperatura de esterilización. El ajuste se realiza con tiras indicadoras y soluciones de ácidos y bases, teniendo en cuenta que después del autoclave y el enfriamiento el pH baja aproximadamente un punto.

Reparto en recipientes

Se utilizan matraces o tubos de diversa capacidad según la posterior finalidad del medio. Estos recipientes deben estar limpios y cerrados con algodón graso o tapones de caucho, plástico o metal, respectivamente.

Esterilización de los medios

La esterilización se realiza en la autoclave a una temperatura de 110 – 121°C (aproximadamente una atmósfera) y durante un tiempo de 15 – 20 minutos. Algunos medios no se pueden esterilizar en la autoclave, por sus componentes muy lábiles y se recurre a la esterilización por filtración.

Reparto en placas

La mayoría de los medios se utilizan repartidos en placas de Petri. El reparto no debe hacerse con el medio recién salido de la autoclave, pues se formaría un exceso de agua condensada en la cubierta de las placas, hay que esperar a que alcance una temperatura de 45 – 50°C (Cuando no quema al tacto). La operación del reparto debe hacerse al lado del mechero para evitar contaminaciones. Las placas se colocan apiladas formando una torre de diez unidades y se comienza a repartir por la inferior, sosteniendo el resto en alto. La altura del medio en la placa debe ser aproximadamente de 4mm (25ml de medio para las placas de 25mm y 60ml para las placas de 140ml). Las burbujas formadas pueden eliminarse con la llama del mechero.

Las placas se dejan a temperatura ambiente hasta que el medio se enfría; luego se invierten para su almacenamiento.

Conservación de los medios

Es necesario impedir la desecación de los medios sólidos y la evaporación de los medios líquidos, para que su composición no se altere. Los tubos y frascos de cierre hermético se conservan durante carios meses a temperatura ambiente; los de tapón metálico o algodón graso (cubierto con papel parafinado) no resisten más de un mes; las placas de Petri aguantan aproximadamente una semana refrigeradas a 4°C, y algo más, si se protegen los bordes con papel adhesivo y se colocan dentro de una bolsa de plástico. Todos los medios se conservan mejor en la oscuridad, refrigerados y en atmósfera de humedad relativamente minima.

Esterilización por Calor Húmedo

El calor húmedo destruye a los microorganismos sobre todo por la coagulación de las proteínas (desnaturalización), que es causada por la rotura de los enlaces de hidrogeno que mantienen la estructura tridimensional.

La esterilización confiable con calor húmedo requiere temperaturas superiores a la de la ebullición del agua. Estas temperaturas elevadas se alcanzan con más frecuencia mediante vapor bajo presión en una autoclave. La colocación en autoclave es el método preferido de esterilización a menos que el material que se desea utilizar pueda ser dañado por el calor o la humedad.

Cuanto mayor será la presión en la autoclave mayor será la temperatura. Por ejemplo cuando el vapor fluye libremente a una temperatura de 100°C se encuentra a una presión de una atmósfera por encima de la presión a nivel del mar, es decir, 1.05 Kg/cm2 (15 psi), la temperatura se eleva a 121°C.

La esterilización es más eficaz cuando los microorganismos se hallan en contacto directo con el vapor o están contenidos en un volumen pequeño de líquido. En estas condiciones el vapor a una presión de unos 15 psi causara la muerte de todos los microorganismos y sus endosporas en alrededor de 15 minutos.

Para esterilizar recipientes de vidrio secos, apósitos y otros elementos similares debe tenerse cuidado de asegurar que el vapor entre en contacto con todas las superficies. Por ejemplo, el papel de aluminio es impermeable para el vapor y no debe usar para envolver materiales secos que se van a esteriliza. También debe tenerse cuidado de que el aire atrapado en el fondo de un recipiente seco por que no será remplazado por vapor.

Autoclave. El vapor que ingresa obliga al aire a salir por la parte inferior (flechas azules), La válvula de purga automática permanece abierta todo el tiempo que la mezcla aire-vapor sale por la tubería de desagüe. Cuando se ha eliminado el aire la mayor temperatura del vapor puro cierra la válvula y aumenta la presión en la cámara.

CONCLUSIONES:

La importancia de esta práctica en su buen entendimiento practico y teórico radica en que estos hábitos son rutinarios en la microbiología, ya que se necesita continuamente de material estéril para las diferentes técnicas microbiológicas de siembra y cultivo microbiano y así evitar la contaminación de algunos cultivos. De esta manera también se debe hacer de un hábito la asepsia y desinfección de el espacio en el que se trabaja, y tratar de hacer de esto una habilidad con el tiempo para que no nos consuma mucho espacio de prácticas.

CUESTIONARIO:

2.- Explique las condiciones de esterilización por calor húmedo.

La esterilización por vapor a presión se lleva a cabo en un autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras lo que permite que la cámara alcance una temperatura de 121ºC. El tiempo de esterilización usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las características del material, es necesario variar el tiempo de esterilización.

3.- Explique el mecanismo de esterilización por calo seco.

La esterilización por calor seco se puede realizar por varios métodos: • Aire caliente • Llama directa • Incineración

Aire caliente

El aire caliente es uno de los métodos de esterilización por calor seco más utilizados. Este proceso se lleva a cabo en hornos especiales que permiten la distribución uniforme del calor en su interior, donde el material se expone a temperaturas de aproximadamente 170ºC durante 2 horas.

El tiempo de esterilización se debe determinar para cada tipo de material, por ejemplo en el caso de materiales muy resistentes al calor, se pueden usar temperaturas más altas por tiempos más cortos. Entre las ventajas de este método de esterilización están que no deja residuos, y es un método rápido y económico. Además permite la esterilización de materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas. Su principal desventaja es que sólo debe emplearse para esterilizar materiales termoestables. Para controlar este proceso de esterilización se utilizan indicadores físicos tales como los termómetros, los cuales permiten medir la uniformidad de la temperatura de la cámara interna del horno, indicadores químicos como las cintas adhesivas e indicadores biológicos como las esporas de Bacillus subtilis.

Este método se emplea para la esterilización de material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, agujas de metal, materiales no miscibles con el agua, etc.

Llama directa

Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que éste se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas. Su eficacia depende de la calidad de la llama. Es un procedimiento muy sencillo que se realiza de rutina en los laboratorios de microbiología para esterilizar el asa o el filamento con la llama del mechero. Cuando se realiza este procedimiento se debe evitar la formación de aerosoles (pequeñas gotas liberadas al aire) que podrían contaminar el ambiente. Incineración

El material a esterilizar se coloca en cámaras especiales que alcanzan elevadas temperaturas. Con este método se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas. Es una forma efectiva de esterilizar el material contaminado a descartar tales como bolsas, papel, uniformes desechables, cadáveres de animales, etc.

6.- ¿Cómo esterilizaría un cubículo para siembra?

La descontaminación del espacio, el mobiliario y el equipo de laboratorio requiere una combinación de desinfectantes líquidos y gaseosos. Las superficies pueden descontaminarse con una solución de hipoclorito de sódico (NaOCl); una solución que contenga 1 g/L de cloro libre puede ser apropiada para la limpieza general, pero se recomiendan soluciones más potentes (5 g/L) cuando se trate de situaciones de alto riesgo. Para la descontaminación de espacios y superficies, las soluciones de ledjía puedes sustituirse por fórmulas que contengan un 3% de peróxido de hidrogeno (H2O2).

Las salas y el equipo pueden descontaminarse por fumigación con formaldehído gaseoso, que se obtiene calentando paraformaldehído o hirviendo formol. Este procedimiento es sumamente peligroso y debe ser realizado por personal espacialmente adiestrado. Todas las aberturas del local ( ventanas, puertas, entre otros) deben cerrarse con cinta adhesiva o un material análogo antes de que se desprenda el gas. La fumigación debe efectuarse a una temperatura ambiente de al menos 21°C y una humedad relativa del 70%.

Tras la fumigación, la zona debe ventilarse completamente antes de permitir la entrada de personal. Toda persona que entre en la sala antes de la ventilación habrá de llevar mascarillas respiratorias. Para neutralizar el formaldehído puede utilizarse bicarbonato amónico gaseoso.

BIBLIOGRAFÍA:

Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case (2007). Introducción a la microbiología. Editorial Panamericana. Paginas 191 – 194.

Pedro García, Fernando Paredes, María Teresa Fernández. Microbiología clínica práctica. 2da Edición. Universidad de Cádiz. Paginas 56 – 58.

Organización Mundial de la Salud. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio. 3ra Edición. Paginas: 96 - 97