Estructura y propiedades de proteínas...Estructura y propiedades de proteínas Parte I. Extracción...
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Estructura y propiedades de proteínas
Parte I. Extracción y precipitación por salado
Q.A. Moisés Méndez Ramírez
Dra. Sobeida Sánchez Nieto
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Lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo esquelético de Gallus gallus
https://swissmodel.expasy.org/interactive#sequence
Ciclo de Cori
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Función de LDH
• https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_pathway?ec00620+1.1.1.27
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Conversión de Lactato a Piruvato
https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.1.1.27&Suchword=&reference=&UniProtAcc=&organism%5B%5D=Gallus+gallus&show_tm=0
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Ejercicio de estructura de LDH
• MSLKDHLIHNVHKEEHAHAHNKISVVGVGAVGMACAISILMKDLADELTLVDVVEDKLKGEMLDLQHGSLFLKTPKITSGKDYSVTAHSKLVIVTAGARQQEGESRLNLVQRNVNIFKFIIPNVVKYSPDCKLLIVSNPVDILTYVAWKISGFPKHRVIGSGCNLDSARFRHLMGERLGIHPLSCHGWIVGEHGDSSVPVWSGVNVAGVSLKALHPDMGTDADKEHWKEVHKQVVDSAYEVIKLKGYTSWAIGLSVADLAETIMKNLRRVHPISTAVKGMHGIKDDVFLSVPCVLGSSGITDVVKMILKPDEEEKIKKSADTLWGIQKELQF
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¿Para qué purificar una proteína?
• Investigación
• Industrial
• Farmacéutica
• Agroalimentaria
• Caracterización de actividad• Determinación de estructura-función• Establecimiento de relaciones evolutivas
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¿Qué necesito saber para purificar proteínas?
• Fuente. Cuánto necesito y de dónde puedo extraerla y en dónde esta
• Función/Propósito. Para qué la necesito. Qué tan pura se requiere
• Propiedades de la proteína. Estabilidad, pH, pI, peso molecular (Da), solubilidad, afinidad por ligandos, hidrofobicidad.
• Equipo y presupuesto. Con qué y cuánto dispongo para el proceso
• Protocolo. Cuál será el diseño experimental. Qué hay en la literatura
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Consideraciones generales• Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad.Definir los objetivos de la purificación
• En función de su localización celular: compartimientos extracelulares y/o intracelulares.
Seleccionar muestra biológica de inicio
• Determinación rápida de pureza, actividad o contenido total de proteína. Desarrollar una técnica de análisis
• Evitar protocolos largos. Perdida de actividad biológica y/o rendimiento.Minimizar la manipulación de la muestra
• Interferencia con análisis. Evitar degradación de proteína.Remover contaminantes
• Aumento del costo y posible perdida de actividad.Reducir uso de aditivos
• Incrementar la pureza y mejorar el rendimiento.Usar una técnica diferente en cada paso
• 5-8 pasos para un enriquecimiento alto.Minimizar el número de pasos
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Pasos para la obtención de una proteína
• Homogeneizado
• Fraccionamiento
• Aislamiento/Purificación
FASE I: Ruptura de membranas celulares y centrifugación diferencial o por gradiente. FASE II: Precipitación selectiva por adición de sales o disolventes.FASE III: Aislamiento de proteína con base en su propiedades fisicoquímicas.
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Selección de fuente de proteína
Debe considerar:
• Tipo de proteína
• Facilidad de obtención de biomasa
• Cantidad de proteína en el tejido
• Propiedades de la proteína
• Ensayos piloto con proteína similar
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Homogeneizado
• Proceso para la obtención de una suspensión uniforme por la ruptura celular y liberación del contenido al medio mediante un método mecánico, químico o enzimático.
• Requiere un medio o solución de homogenización que evite la desnaturalización o inactivación de la proteína. Permite ajustar pH, la fuerza iónica y estabilizar a la proteína.
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TIPO TÉCNICA MECANISMO ESTRÉS APLICACIÓN
Mecánico
Mortero Molienda con abrasivos Moderado Células vegetales
Esferas Trituración con bolas de
acero o vidrioFuerte
Células animales y vegetales
Aspas Mezclados con cuchillas ModeradoTejidos duros y
blandos
Alta presiónFuerzas de cizalladura al
pasar a través de un orificioFuerte Bacterias
SonicaciónProducción de ondas de
ultrasonidosFuerte Levaduras y bacterias
Químico
Choque osmóticoSuspensión en medio
hipotónicoSuave Células animales
Tratamiento alcalino Saponificación de los lípidos FuerteEnzimas resistentes a
pH básicos
Disolventes orgánicosSolubilización de asociados a
membranaModerado Levaduras con tolueno
Detergentes Solubilización de membranas Suave Bacterias con SDS
Enzimático Permeabilización enzimáticaPermeabilización de la pared
celularSuave Gram (+) con lisozima
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CentrifugaciónPermite eliminar contaminantes o clarificar a la proteína mediante la separación de los componentes del homogeneizado en función de su tamaño, forma y densidad.
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Localización de proteínaFracción Condición Componente celular
Nuclear 600g / 10’ Núcleos, células intactas y restos de tejido no homogeneizado
Mitocondrial 15000g / 15’ Mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y cloroplastos
Microsomal 100000g / 60’ Membrana plasmática, RE, Golgi, vesículas
Soluble 600000g / 120’ Ribosomas, polisomas, macromoleculas
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Centrifugación por gradiente
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Fuerza centrífuga relativa (RCF)
• Es la fuerza de aceleración aplicada a la muestra que depende del radio del rotor (r) y las revoluciones por minuto (rpm).
𝑅𝐶𝐹 = 1.12 𝑟𝑅𝑃𝑀
1000
2
• Controla el tamaño de los componentes a sedimentar y los que quedaran en suspensión
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Precipitación por salado
Precipitación se da por cambios en la solubilidad de la proteína debido a modificaciones en el pH, temperatura, polaridad del medio o adición de moléculas cargadas.
Adición de Sulfato de amonio (NH4)2SO4 es el método más común
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Desnaturalización de proteínas
La precipitación de la proteína dependerá sus características fisicoquímicas y estructurales.Cada proteína precipita a ciertas condiciones.
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“Salting in” y “Salting out”
• Salting in
Incremento de iones
Solubilidad
• Salting out
Exceso de iones
SolubilidadPrecipitación de proteína
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Video: Salting in and Salting out
• https://www.youtube.com/watch?v=gnhUh6qVD5Y&t=7sResiduos
hidrofóbicos
Residuos hidrofílicos
Proteína
H2O
Sal (NH4)2SO4
Aglomeración y precipitación de la proteína
Proteína soluble
Modificación conformacional de la proteína
Estructura nativa
• Ocurre la solvatación de la capa de agua de la proteína al incrementar los iones, aumentando la solubilidad.
• A altas concentraciones, se extrae el agua de la proteína modificando su conformación, por lo tanto, se aglomera y precipita.
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Cálculo de cantidad de sulfato de amonio
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl
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Desalado
Consiste en retirar el agente precipitante. Puede interferir con las propiedades de la proteína o pasos posteriores de purificación.
• Dilución
• Diálisis
• Ultrafiltración
• Filtración en gel o exclusión molecular
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Diálisis• Separación por medio de una membrana semipermeable de celulosa o
celofán de tamaño de poro determinado.
Requiere de una solución al menos 30 veces el volumen de la muestra.
Agitación constante a 4°C por aprox. 12 h.
Necesita varios cambios de solución.
Alto costo de membranasTiempo prolongadoProbabilidad de ruptura de la membrana
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Filtración/ Ultrafiltración
• Permite separación empleando filtros de diferente tamaño de poro.
• Pueden emplearse velocidades de centrifugación superiores a 300000g.
• Cambio de amortiguador y eliminación de sales. Alto costo de filtros.
Pueden agregarse proteínas.Volúmenes pequeños.
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Posible perdida de proteínaDepende de la elección del poro del gel
Monitoreo por absorbancia a 280 nm
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Diagrama experimental• Ruptura mecánica del tejido.
• Filtración en gasa
• Separación por peso (centrifugación)
• pp Salado
Muchas proteínas pp, pero NO la LDH y otras proteínas
• pp Salado
Muchas proteínas pp y también la LDH
• LDH y otras proteínas en el botón se resuspenden
antes de desalar
• Desalado