Estudio estructural y funcional de proteínas con técnicas...
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Estudio estructural y funcional de
proteínas con técnicas biofísicas
Alessio Ausili, PhD
Prometeo de la Sección de Genética Humana,
Microbiología y Bioquímica Clínica
Loja, 7 de Mayo 2015
Por qué…
• Estructura secundaria
• Estructura tridimensional
• Cambios conformacionales
• Entornos de determinados aminoácidos
• Secuencia aminoacídica
• Identificación de proteínas
• Tamaño, forma y peso molecular de las proteínas
• Dinámicas moleculares
• Interacciones proteína-proteína, enzima-sustrato, proteína-
membrana, proteína-DNA, etc.
• Estabilidad
1. Espectroscopía Ultravioleta-Visible (UV/Vis)
2. Espectroscopía de Fluorescencia
3. Dicroísmo circular (CD)
4. Resonancia Magnética Nuclear (NMR)
5. Difracción de Rayos X
6. Espectrometría de Masas (MS)
7. Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
8. Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)
9. Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC)
10.Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)
Técnicas
Se basa en la absorción de las radiaciones electromagnéticas
monocromáticas en el intervalo de UV (200-350 nm) y visible (350-700
nm) por parte de las moléculas. Esta absorción es producida por un
salto electrónico del estado normal al excitado y sigue la ley de
Lambert-Beer:
A = -log10 I1 /I0 = ecl
A = Absorbancia
l = camino óptico (cm)
c = concentración (mol L-1)
e = coeficiente de extinción molar (L mol-1 cm-1)
Espectroscopía Ultravioleta-Visible Principios
I0 I1
Equipo
Lámpara Monocromador
Intensidad
luz incidente
I0
Intensidad
luz transmitida
I1
Cubeta Detector
Espectrómetro
Varian Cary 100
Cubetas
de cuarzo o plástico
Espectroscopía Ultravioleta-Visible
Aplicación en estudio de proteínas
Espectroscopía Ultravioleta-Visible
• Determinación de concentración y pureza de proteínas en solución
• Información sobre el microentorno de los aminoácidos aromáticos
• Cambios conformacionales: desplegamiento y dinámica molecular
LIMITES:
• Muy poco usada en análisis estructurales
• Cambios de absorbancia de los aminoácidos aromáticos muy bajo
durante el desplegamiento
• Espectros poco específicos
Espectroscopía de Fluorescencia Principios
Se basa en la propiedad de algunas moléculas de reemitir a una
longitud de onda mayor las radiaciones electromagnéticas absorbidas.
Los electrones de las moléculas excitadas pasan del nivel energético
fundamental a uno excitado y cuando vuelven al estado fundamental lo
hacen emitiendo una radiación a menor frecuencia de la inicial
Equipo
Espectroscopía de Fluorescencia
Lámpara
Monocromador
de excitación Monocromador
de emisión
Divisor
de haz
Lente Lente
Cubeta lecc
lem
Fotomultiplicadores Detector
Fluorímetro
Varian Cary Eclipse
Cubetas
de cuarzo
Aplicación en estudio de proteínas
Espectroscopía de Fluorescencia
• Información sobre la estructura terciaria
• Cambios en el microentorno del triptófano
• Cambios conformacionales
• Estabilidad (T, pH, sal, agentes desnaturalizantes, etc.)
• Plegamiento
• Estudio de binding
LIMITES:
• Información limitada al microentorno de los aminoácidos aromáticos
• Depende de las condiciones del solvente
Ejemplos
Espectroscopía de Fluorescencia
mKO ArgBP
Cambios conformacionales y plegamiento Binding
Arg
Dicroísmo Circular (CD) Principios
Se basa en el fenómeno físico de la diferente absorción por parte de
una molécula quiral de las dos componentes, derecha e izquierda, de
la luz polarizada circularmente. Los espectros de dicroísmo circular son
espectros diferenciales miden la diferencia de absorción (DA) de la luz
polarizada circularmente a la derecha (AR) y a la izquierda (AL). DA se
expresa en elipticidad (q) definida por:
DA = AL – AR
DA = Decl
q = [q]cl
[q] es la elipticidad molar
Luz polarizada
Circularmente a la izquierda
Luz polarizada
Circularmente a la derecha
Equipo
Dicroísmo Circular (CD)
Fuente de luz Monocromador Polarizador lineal Modulador
fotoelástico (PEM)
Fotomultiplicador Cubeta
Cubeta
Far UV
Cubeta
Near UV Espectrómetro
Jasco J-815
Aplicación en estudio de proteínas
Dicroísmo Circular (CD)
UV lejano (180-260 nm), enlace peptídico:
• Información sobre la estructura secundaria
• Porcentajes estructuras secundarias
• Plegamiento-desplegamiento
• Estabilidad (T, pH, sal, agentes desnaturalizantes, etc.)
UV cercano (240-360 nm), aminoácidos aromáticos:
• Información sobre la estructura terciaria
• Cambios conformacionales
LIMITES:
• Baja resolución
• Baja sensibilidad a cambios de estructuras hoja-b
• Inadecuado para estudio de proteínas no en solución
Ejemplos
Dicroísmo Circular (CD)
AGP
Termoestabilidad
UV cercano
UV lejano
ArgBP
Estructura secundaria
WT Mutante
WT: 36% a, 14% b
Mut: 31% a, 16% b
Resonancia Magnética Nuclear (NMR) Principios
Se basa en las propiedades magnéticas (spin nuclear) de los núcleos
de algunos átomos e isotopos que sometidos a un campo magnético
externo absorben diferentes frecuencias de señales de radio. La
absorción de estos núcleos depende de su entorno dentro de la
molécula y de los átomos adyacentes (desplazamiento químico). Esto
proporciona información sobre como los núcleos están enlazados
químicamente, sus distancia espacial y la velocidad con la cual se
mueven. De estos datos se obtiene un mapa con el que se determina
la estructura global de la proteína.
Resonancia Magnética Nuclear (NMR) Equipo
Transmisor de
radiofrecuencias Receptor de
radiofrecuencias
Generador
de pulsos
Polo del
imán
Polo del
imán
Control y
registrador
Bobinas
de barrido Bobinas
de barrido
Tubo de
muestra
Espectrómetro NMR
Bruker Avance 800
Tubos de NMR
• Estructura 3D de alta resolución
• Información sobre dinámica molecular
• Interacciones con otras moléculas
LIMITES:
• Complejidad de los cálculos
• No sirve en proteínas grandes (max 30 kDa)
• Muestra muy concentrada (15 mg/ml)
Aplicación en estudio de proteínas
Resonancia Magnética Nuclear (NMR)
Resonancia Magnética Nuclear (NMR)
10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 -2.0 Desplazamiento químico de 1H (ppm) 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 -2.0
Desplazamiento químico de 1H (ppm)
-2.0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
Despla
zam
iento
quím
ico d
e 1
H (
ppm
)
Globina
Ejemplos
Estructura 3D
Principios
Difracción de Rayos X
Se basa en el fenómeno de difracción de un haz de rayos X por parte
de un retículo atómico en un cristal. Los rayos X son difractados por los
electrones que rodean los átomos siendo la longitud de onda del
mismo orden del radio atómico y pueden ser detectado por películas
fotográficas o placas de imagen. Según los ángulos y las intensidades
de los rayos difractados se puede producir una imagen tridimensional
de la densidad de electrones en el cristal
Equipo
Cristal
Placa de imagen
Haz de rayos X
enfocados
Monocromadores
Rayos X
sin enfocar
Generador
de rayos X
Goniómetro
Difracción de Rayos X
Difractometro
Nonius Kappa
Sincrotrón ESRF
Grenoble - Francia
Aplicación en estudio de proteínas
Difracción de Rayos X
• Estructura 3D de alta resolución
• Estudio de proteínas de grandes dimensiones
LIMITES:
• Complejidad de obtener el cristal
• Conformación interna del cristal puede ser modificada por factores
no fisiológicos
• Complejidad de los cálculos
• Costes elevados
Difracción de Rayos X Ejemplos
Mioglobina
Estructura 3D
Espectrometría de Masas (MS) Principios
Se basa en la posibilidad de separar una mezcla de iones en función
de sus relación masa/carga a través de un campo magnético. Las
moléculas se pueden ionizar por diferentes técnicas (MALDI, ESI, etc.),
se aceleran mediante potencial eléctrico y se pueden separar por
diferentes métodos (sector magnético, trampa de iones cuadrupolar,
TOF, etc.).
Espectrometría de Masas (MS) Principios
Ionización
MALDI (Desorción/ionización láser asistida por matriz) ESI (Ionización por electrospray)
Espectrometría de Masas (MS) Principios
Separación de los iones
Analizador de sector magnético
Generador y acelerador
de iones
Campo magnético
Seleccionador
de iones
Detector
𝑚
𝑒=𝐻2𝑟2
2𝑉
m es la masa del ion
e es la carga del ion
H es el campo magnético
r es el radio de la curva
V es el voltaje
TOF (Tiempo de vuelo)
Cámara
de vacío Camino de vuelo
Generador y acelerador
de iones
Área de
aceleración
Iones pesados
Detector
Iones ligeros
𝑣 =2𝑒𝑉
𝑚 𝑡 = 𝑘
𝑚
𝑒
v es la velocidad
e es la carga del ion
V es el voltaje
m es la masa del ion
T es el tiempo de vuelo
k es una constante del aparato
Espectrometría de Masas (MS) Equipo
Cámara de
ionización
Acelerador
de iones
Detector
de iones
Inyector
de muestra Análisis de
espectros
Módulos de un aparato de espectrometría de masas
Espectro
Espectrómetro de
masas MSD-TOF,
Agilent Technologies
Espectrómetro de
masas trampa de iones
Trap XCT Plus, Agilent
Technologies
Espectrometría de Masas (MS) Aplicación en estudio de proteínas
• Identificación de proteínas
• Determinación del peso molecular
• Determinación de la secuencia aminoacídica
• Estudios de proteómica
• Modificaciones postraduccionales
LIMITES:
• Análisis destructivo
• Costes elevados
• Problemas con análisis de mezclas
• Interferencia de la matriz (MALDI)
Espectrometría de Masas (MS) Ejemplos
¿Que proteínas
son?
SDS-PAGE
Banda de la proteína
Proteína desconocida
Péptidos trípticos Espectro de masas
Espectro de masas
teórico Secuencia de la proteína
Péptidos trípticos
teóricos
Identificación Búsqueda
vía database
Identificación de proteínas
Electroforesis en 2-D
Proteínas reguladas diferencialmente
Se basa en la dispersión de Rayleigh que es el fenómeno por el cual
cuando la luz golpea pequeñas partículas en suspensión se dispersa
en todas las direcciones si el tamaño de las partículas es menor que la
longitud de onda de la luz. Las fluctuaciones de la intensidad de la luz
dispersada dependen del movimiento Browniano de las partículas. De
la velocidad del movimiento Browniano deriva el radio hidrodinámico
de las partículas a través de la ecuación de Stokes-Einstein:
𝐷 =𝑘𝐵𝑇
6𝜋η𝑟
D es la velocidad de difusión
kB es la constante de Boltzmann
T es la temperatura
h es la viscosidad del medio
r es el radio hidrodinámico
Dispersión Dinámica de Luz (DLS) Principios
Equipo
Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
Espectrómetro AutoSizer 4800, Malvern Instruments Laser
Polarizador
Detector
Muestra
Partículas pequeñas
Intensidad de las fluctuaciones rápida
Partículas grandes
Intensidad de las fluctuaciones lenta
Aplicación en estudio de proteínas
Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
• Determinación del tamaño de las proteínas
• Monitoreo de la agregación, oligomerización y formación de
amiloides
• Estudio de estabilidad térmica
• Efecto de la concentración de las proteínas
LIMITES:
• No sensible a pequeños cambios de tamaño
• Sensible a viscosidad y concentración
Dispersión Dinámica de Luz (DLS) Ejemplos
BSA
Desnaturalización y agregación
Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) Principios
Se basa en el fenómeno óptico por el cual los plasmones de superficie
(ondas electromagnéticas que se propagan paralelamente a la
superficie de un material metálico plano) excitados por una radiación
luminosa, modifican la reflexión de la radiación. La resonancia de los
plasmones es sensible a cualquier cambio en la superficie que
modifique el índice de refracción local. Esto se refleja en cambios en el
ángulo de reflexión de la radiación.
Angulo critico
Angulo SPR
Angulo critico
Angulo SPR
Angulo Incidente (deg) In
tensid
ad L
uz R
efleja
da
Onda plasmonica
de superficie
Equipo
Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)
Fuente
de luz Luz
polarizada
Prisma
Luz
reflejada
Detector
óptico
Chip sensor
con film de oro
Canal
de flujo
Sensorgrama
Tiempo
Angulo
Resonancia
Intensidad
Biacore 3000
Chip sensor
Aplicación en estudio de proteínas
Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)
• Estudio interacciones (real-time) proteína-proteína, proteína-
membrana, proteína-ADN, etc.
• Estudio de afinidad y cinética de las interacciones
LIMITES:
• Problemas en la inmovilización de las proteínas de manera estable
y funcional
• Dificultad en discriminar uniones especificas y no-especificas
• Baja sensibilidad para compuesto de bajo peso molecular
• Costes elevados de aparato y chips sensores
Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) Ejemplos
Interacción proteína-proteína
Proteína Morfogénica Ósea (BMP) - Folistatina
Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC) Principios
Se basa en la posibilidad de cuantificar directamente la entalpía de
unión de dos o mas moléculas midiendo el calor absorbido o liberado
durante la reacción. Esta técnica permite la determinación directa de la
estequiometria, la diferencia de entalpía y la constante de afinidad de
la unión entre moléculas en solución y indirecta de los cambios energía
libre de Gibbs y de entropía según la relación:
∆𝐺 = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆
G es la energía libre de Gibbs
H es la entalpía
T es la temperatura absoluta
S es la entropía
Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC) Equipo
Microcalorímetro VP-ITC, MicroCal
Celda de
la muestra
Celda de
referencia
Jeringa automática
Termopares
Termopar
Cubierta aislante
Alimentador
T constante Alimentador
compensación DT
Aplicación en estudio de proteínas
Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC)
• Completa caracterización termodinámica en un solo experimento de
las interacciones proteína-proteína, enzima-ligando, proteína-
membrana, etc. sin marcaje, inmovilización o limite de peso
molecular
• Determinación del numero de sitios de unión de las proteínas
LIMITES:
• Requiere un alto grado de pureza de las muestras
• Requiere una gran cantidad de proteína
• Requiere alta solubilidad de todas las moléculas en el mismo
solvente
Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC) Ejemplos
Interacción proteína-proteína
ERK2 – PTP-SL
Termograma
Isoterma de unión
Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) Principios
Se basa en la posibilidad de obtener información termodinámica de
una o más moléculas calentando o enfriando la muestra. El DSC se
basa en la diferencia de flujo térmico que hay entre la muestra y una
referencia para mantener la misma temperatura. Esta técnica permite
la determinación directa de la entalpía asociada al proceso e indirecta
de los cambios energía libre de Gibbs y de entropía según la relación:
∆𝐺 = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆
G es la energía libre de Gibbs
H es la entalpía
T es la temperatura absoluta
S es la entropía
Equipo
Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)
Celda de
la muestra
Celda de
referencia
DT
Termopares
Cubierta aislante
Microcalorímetro VP-DSC, MicroCal
Celda
Heater Heater
Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) Aplicación en estudio de proteínas
• Estudio de estabilidad térmica de las proteínas
• Información sobre los parámetros termodinámicos de las
transiciones térmicas de las proteínas
• Estudio de desplegamiento y replegamiento
LIMITES:
• Resultados dependen de muchos parámetros incluido el operador
• Muy sensible hasta a pequeños cambios
Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) Ejemplos
Estudio termodinámico de proteínas
Tm = 96.9°C
DH = 690 kcal/mol
Tm = 52.5°C
DH = 9.8 kcal/mol
Tm = 22°C
DH = 5.3 kcal/mol
ADH
Muchas Gracias!
Alessio Ausili Caracterización de Proteínas con Métodos Biofísicos