Practica N. 8 FERMENTACIN ALCOHLICA CON LEVADURAS

INTRODUCCIN La Fermentacin alcohlica de define como el proceso bioqumico por el cual las levaduras transforman los azcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la fermentacin se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consiguen 1g de levadura por cada 4g de azcar consumidos los productos obtenidos son muy poco etanol, agua y CO2. En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentacin; es decir degradan los azcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energa. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por cada 100g de azcares consumidos. Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la produccin de etanol. Saccharomyces cerevisiae es la levadura ms comnmente utilizada. El Etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es crtica para obtener rendimientos altos. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentacin. Los ms relevantes son los siguientes: TEMPERATURA: A mayor temperatura la fermentacin transcurre mas rpidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y mas cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima de desarrollo. Por encima de 35C la actividad disminuye rpidamente y mueren a antes de 45C. OXIGENO: Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxigeno disuelto en el mosto. NUTRIENTES: Los azcares son fuente de energa para las levaduras.

OBJETIVO Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin realizada por la levadura de Saccharomyces cerevisiae .

MATERIALES Y EQUIPOS Azcar, miel o panela, Levadura, Recipiente de vidrio, Manguera y tapn, Licuadora, Colador, Antiespumante, Alcoholmetro, Agitador mecnico pHmetro, Equipo de destilacin, Probeta, Esptulas, Balones de 4-6 L, Refractmetro, Perlas de ebullicin REACTIVOS KMNO4, Bisulfito de Sodio, cido Cromotrpico, H2SO4

DATOS Y OBSERVACIONES Consideraciones a tener en cuenta en la elaboracin del fermento: Tabla 1: Cantidad de azcar del mosto para corregir los Brix

MATERIALES QUE CONTIENEN AZCAR

CANTIDAD (g) AGUA (ml) BRIX

Azcar Blanca 10 100 1 Azcar Morena 10 100 1 Miel 10 100 0,6 Glucosa 10 100 1

NOTA: No es recomendable utilizar para la prctica frutas tales como: Mango, Papaya, Guanbana y Guayaba; ya que estas tienen mucho muclago y son muy espesantes al trabajar con ellas, complicando la fermentacin

Se sugiere utilizar frutas tales como: Mora, Uva, Lulo, Maracay, Naranja.

Tabla 2: %Azcar en algunas frutas

FRUTA %AZCAR (g/1000ml) AZCAR (gramos/litro)

Anon 25.4 254 Badea Jugo sin semilla 10.1 101 Banano comn 23.4 234 Ciruela comn 20.8 208 Cereza 16.6 166 Ciruela Claudia 13.0 130 Curaba 6.3 63 Chirimoya 18.2 182 Durazno amarillo 12.0 120 Feijoo sin cscara 11.9 119 Frambuesa 11.6 116 Fresas enteras 6.9 69 Guayaba comn 11.9 119 Guayaba pera 6.8 68 Guanbana pulpa 13.0 130 Higo sin semilla 9.6 96 Kiwi pulpa 14.9 149 Lima 6.0 60 Limn comn jugo 8.6 86 Limn mandarina 5.8 58 Limn Tahit 7.2 72 Lulo sin semilla 5.7 57 Mamey pulpa 12.4 124 Mandarina Jugo 10.1 101 Manzana Ana 15.0 150 Manzana sin cscara ni semilla 14.8 148 Maracuy morado pulpa 13.6 136 Maracuy amarillo pulpa 14.5 145 Mora castilla pulpa sin semilla 5.6 56 Naranja jugo 10.4 104 Pera sin cascara 8.5 85 Pia jugo 13.0 130 Tamarindo pulpa concentrada 61.3 613 Tomate arbol pulpa semilla 7.0 70 Toronja jugo 9.2 92 Uchuvas enteras 19.6 196 Uva Queen verde 14.0 140 Uva Isabela 15 150 Uva negra 9.6 96 Uva Red Globe 17 170 Uva Ribier 17 170 Uvas pasas sin semilla 75.0 750 Zapote pulpa 12.4 124

Tabla 3: Gramos de azcar a adicionar por kilo de mosto. Gramos de azcar a adicionar por litro de mosto

Densidad 20C Brix Alcohol 8% Alcohol 10% Alcohol 12% Alcohol 14% 1.0000 0.0 144.0 180.0 216.0 252.0 1.0050 1.5 129.0 165.0 201.0 237.0 1.0070 2.0 124.1 160.1 196.1 232.1 1.0100 2.7 116.7 152.7 188.7 224.7 1.0110 3.0 114.2 150.2 186.2 222.2 1.0150 4.0 104.4 140.4 176.4 212.4 1.0196 5.0 94.0 130.0 166.0 202.0 1.0200 5.2 92.1 128.1 164.1 200.1 1.0250 6.4 80.0 116.0 152.0 188.0 1.0300 7.6 67.9 103.9 139.9 175.9 1.0350 8.8 55.9 91.9 127.9 163.9 1.0399 10 44.0 80.0 116.0 152.0 1.0441 11.0 34.0 70.0 106.0 142.0 1.0483 12.0 24.0 60.0 96.0 132.0 1.0500 12.4 20.3 56.3 92.3 128.3 1.0525 13.0 14.0 50.0 86.0 122.0 1.0550 13.5 8.6 44.6 80.6 116.6 1.0567 14.0 4.0 40.0 76.0 112.0 1.0610 15.0 0.0 30.0 66.0 102.0 1.0653 16.0 20.0 56.0 92.0 1.0696 17.0 10.0 46.0 82.0 1.0740 18.0 0.0 36.0 72.0 1.0784 19.0 26.0 62.0 1.0828 20.0 16.0 52.0 1.0873 21.0 6.0 42.0 1.0918 22.0 0.0 32.0 1.0963 23.0 22.0 1.1009 24.0 12.0

PROCEDIMIENTO A (Produccin con Clulas libres) Preparar un sustrato (tener en cuenta que est en buen estado), medir los grados Brix y verificar que se encuentren entre 17-20 grados. En caso de ser necesaria una correccin, se puede adicionar azcar como fuente de carbono suplementaria hasta obtener los grados Brix requeridos. Una vez corregidos, se ajusta el pH (3.0-3.5). Finalizado este proceso, se toman 200ml del mosto y en l, se adiciona la levadura (aproximadamente 2-4g/l) para sua ctivacin a 37 C. Al mosto sobrante, se le agrega Bisulfito de Sodio (100 p.p.m.) para impedir la proliferacin bacteriana y el pardeamiento del medio. Es necesario dejar un espacio en el recipiente para el control de espuma y la salida del CO2, para ello se le pone el tapn de caucho con un orificio para la introduccin de una manguera aproximadamente de 1 metro de longitud la cual tiene una salida que llega a un recipiente con agua donde se observarn las burbujas del CO2 producidas.

Dejar fermentar libremente durante 4 semanas aproximadamente. A lo largo de todo el proceso, se debe realizar un control peridico de las propiedades fisicoqumicas del material en fermentacin, tales como: pH y grados Brix, las cuales ponen en evidencia el curso que lleva el proceso. (Produccin no de fermentacin). En caso de que los grados Brix bajen puede ser necesaria la adicin de ms cantidad de azcar, proporcional a los grados Brix que se quieran aumentar. VER TABLA 1. Finalizado el proceso de fermentacin por parte de la levadura, indicado por la estabilidad de los grados Brix, se procede a separar el alcohol del material no til, mediante destilacin, para esto se procede as: DETERMINACIN DEL GRADO ALCOHLICO VOLUMTRICO Medir 200 ml del medio en un matraz aforado y anotar la temperatura. Transvasar la muestra al baln de destilacin, enjuagar el matraz aforado 4 veces, con 10 ml de agua destilada cada vez y aadir los lquidos de lavado al mismo baln; adicionar perlas de vidrio y adicionar unas gotas del antiespumante. Ensamblar el equipo y destilar recibiendo el destilado en el mismo matraz donde se midi la muestra, el cual debe permanecer en bao de hielo. Recoger el destilado, hasta obtener un volumen aproximadamente igual a del volumen. Agitar y llevar a volumen con agua, a la temperatura inicial, con una tolerancia de +/- 2C. Para comprobar la produccin de etanol producido, se realiza una prueba cualitativa, el cual se toma una porcin del destilado con una esptula y con una candela se pone la llama debajo de esta, presenciar la produccin de una llama de color azul intenso, la cual indica la presencia de etanol relativamente puro, descartndose la presencia de agua en el producto destilado.

Lectura: Colocar el destilado en la probeta, la cual debe mantenerse en perfecta posicin vertical. En el lquido no deben existir burbujas ni partculas flotando. Introducir el alcoholmetro en el lquido, agitar, dejar en reposo al menos 30 segundos y anotar la temperatura. Leer el grado alcohlico, por encima o por debajo. PROCEDIMIENTO B (Produccin con Clulas inmovilizadas utilizando como sustrato jarabe glucosado) MATERIALES Cepa de Saccharomyces cerevisiae mantenida en caja petri con agar Sabouraud 4 % de glucosa a 4 C.

Medio de cultivo para la activacin de la cepa

Componente Cantidad por litro Fuente de carbono 100.0 g KH2PO4 2.0 g (NH4)2SO4 3.0 g MgSO4 7 H2O 1.0 g Extracto de Levadura 4.0 g Peptona Universal 3.6 g Agua destilada 1.0 L

PROCEDIMIENTO Se debe repicar la cepa de levadura para obtener un cultivo fresco, esto se realiza preparando algunas cajas con agar Sabouraud 4 % de glucosa y sembrando el ellas el microorganismo. Se deben incubar las cajas a 38 C durante 4 das. Activacin de la levadura: Como el microorganismo se conserva en caja, para transferirlo al medio de cultivo de produccin del etanol; es necesario activarlo, para esto se utilizan tubos de ensayo tapa rosca con un volumen de 10 mL del medio de cultivo para activacin. NOTA: La fuente de carbono utilizada es sacarosa. Se toman colonias definidas y aisladas de una caja petri y se lleva a los diferentes tubos con medio previamente preparados y esterilizados, posteriormente se incuban a 38 C y 150 rpm durante 4 das. Pasado este tiempo, se selecciona uno de los tubos dependiendo de la cantidad de biomasa que presente y este se escala a un volumen final de 100 mL del mismo medio de cultivo utilizado para la activacin de la cepa. Pasadas 24 horas, los 100 mL son escalados nuevamente a un volumen de 250 mL del mismo medio de cultivo. Finalmente se escala a 2 L. NOTA: Todos los volmenes escalados se incuban a 38 C y 150 rpm. Despus de 2 das se presentan un crecimiento representativo de clulas que servirn como inculo. Se deshecha alrededor de 1 L de sobrenadante, y el medio con clulas restante se divide en dos partes aproximadamente iguales, 50 mL sern utilizados como inculo para el proceso en batch y el resto para el proceso en continuo con clulas inmovilizadas. Se preparan 2.5 L del medio de cultivo pero esta vez el sustrato ser jarabe glucosado. Para preparar este medio es necesario conocer la concentracin de azcares en el jarabe, puede utilizarse el mtodo de DNS o Antrona y posteriormente hacer la dilucin correspondiente para que el jarabe quede a una concentracin de 100.0 g/L. FERMENTACIN EN BATCH

Para esta fermentacin se preparan 450 mL de medio de cultivo con jarabe glucosado a este medio se le agregan los 50 mL del medio separado como inculo para este proceso y se incuba durante 12 horas a 35 C y 150 rpm;

pasado este tiempo, se toman 10 mL del sobrenadante, a esta muestra se le realiza un anlisis para determinar la concentracin de sustrato por el mtodo DNS o Antrona. Se toman aproximadamente 100 mL del mismo sobrenadante para ser destilados con el fin de concentrar el Etanol y determinar su concentracin. FERMENTACIN EN CONTINUO

Las clulas que quedaron en los ltimos 2 L de medio para crecimiento sern las utilizadas en la inmovilizacin. Antes de montar la fermentacin es necesario inmovilizar las clulas. INMOVILIZACIN DE CLULAS MATERIALES: Jeringa estril, 150 mL de solucin isotnica al 0.85 % (p/v) (solucin acuosa de NaCl), 190 mL de solucin acuosa de Alginato de sodio al 3 % (p/v), 400 mL de solucin acuosa de CaCl2 al 3 % (p/v). NOTA: Todas las soluciones deben ser esterilizadas. PROCEDIMIENTO Despus de tener una cantidad suficiente de clulas para inmovilizar, se descarta el sobrenadante del medio de cultivo en el que han crecido. Las clulas que quedan se centrifugan para obtener pellets libres de medio de cultivo y, se resuspenden en una solucin de NaCl estril (solucin isotnica). La inmovilizacin se realiza mezclando una suspensin de levaduras en 100 mL de solucin isotnica estril con una solucin estril al 2 % de Alginato de Sodio. Se hace gotear esta mezcla mediante una jeringa estril sin aguja sobre una solucin previamente esterilizada de CaCl2 al 3 %. Con una altura de gotea de 1 cm se pueden obtener esferas homogneas de menos de 5 cm de dimetro. MONTAJE DEL BIOREACTOR Esterilizar durante 15 minutos y a 15 psi el reactor incluyendo las mangueras y la tapa de este, adems, esterilizar 2 L de medio del cultivo con jarabe glucosado. En un ambiente estril llenar completamente el reactor con las esferas de levadura inmovilizada. llenar la columna con el medio de cultivo preparado con jarabe y mantener durante 8 horas el proceso en batch para acondicionar las clulas inmovilizadas. Pasado este tiempo, operar el reactor en continuo durante 12 horas a 37 C. Por ltimo, tomar una muestra de 10 mL de medio de cultivo para el anlisis de azcares y 100 mL para la destilacin y determinacin de la concentracin de Etanol. Hacer clculos de rendimiento en los dos procesos y comparar los resultados.

DETERMINACIN DE METANOL Prueba cualitativa Diluir la muestra a una concentracin alcohlica entre 5 y 6% (G.L), tomar 50 ml de la muestra diluida y destilar recolectando 40 ml en el mismo baln donde se midi la muestra (baln de 50 ml). Ajustar a volumen con agua destilada. Adicionar 1 ml de solucin de KMNO4 a un erlenmeyer y enfriar en bao de hielo por 15 minutos, agregar 0,5 ml del destilado. (Mantener en bao de hielo por 30 minutos), decolorar la solucin con una pequea cantidad de NaHSO3 (Bisulfito de Sodio) seco (+/- 100 mg), aadir 0,5 ml de cido Cromotrpico y adicionar lentamente y con agitacin 7,5 ml de H2SO4 concentrado. Posteriormente se pone el erlenmeyer en un bao mara a 60C., durante 15 minutos (para desarrollar color). La aparicin de un color que va del violeta al morado intenso indica la presencia de metanol. Prueba cuantitativa Muestra Proceder igual que la prueba cualitativa, pero dejar enfriar despus del bao mara. Llevar a volumen con etanol al 5.5 %, agitar y mantener siempre a temperatura ambiente. Leer absorbancia a 575 nm. Blanco Tomar 1 ml de alcohol al 5.5 % llevarlo a un baln volumtrico de 50ml que contiene 1 ml de KMnO4, colocar en bao de hielo y tratar igual que la muestra. Solucin estndar de metanol Medir exactamente 1 ml de metanol y llevar a un baln volumtrico de 100 ml, ajustar volumen con alcohol al 5.5 % de concentracin = 1 % de metanol. Tomar 2.5 ml de la solucin anterior y llevar a un volumtrico de 100 ml, ajustar volumen con alcohol al 5.5 % de concentracin = 0.025 % de metanol. Tomar 1 ml de esta ltima solucin y llevar a un volumtrico de 50 ml que contiene 1 ml de KMnO4 y tratar en igual forma que la muestra y el blanco. Leer la absorbancia del estndar. Determinar la cantidad de metanol en la muestra como sigue: % v/v metanol = A X 0.025 X F

A* Donde: A: absorbancia de la muestra A*: absorbancia del estndar de metanol F: factor de dilucin de la muestra.

Preparacin de: Alcohol del 5.5 %: A partir de etanol absoluto. Tomar 55.5 ml de etanol absoluto y ajustar a 1 L con agua destilada.

GLOSARIO GRADOS BRIX: Es el porcentaje de slidos solubles presentes en el jugo o material fermentecible, los cuales relacionan la gravedad especfica de la solucin con la concentracin equivalente de sacarosa pura. PH: Medida de grado de acidez o basicidad de una solucin. FERMENTACIN: Consiste en el que el azcar contenido en el mosto, su mayor parte desaparece, ocupando su lugar el alcohol. GRADO ALCOHOLIMTRICO: Porcentaje de alcohol etlico a 20C. BILBLIOGRAFA POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, Mxico. (1978). Pg. 359-376. JAGNOW, G. Y David W.Bioctenologa: induccin con experimentos modelos. Ed. Acribia, Zaragoza-Espaa (1991). RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatologa. Medelln, Enero de 1999.

Prctica No. 9 CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO y OBTENCIN DE

PROTEASAS INTRODUCCIN El incremento poblacional que resulta de la multiplicacin celular, es un componente esencial de la funcin microbiana, y con l se asocian, tanto el crecimiento, como la generacin metablica; de hecho, las bacterias son mquinas de duplicacin constante en las que se incluyen reacciones cuya finalidad es la formacin de las macromolculas necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras celulares de sus descendientes. Como en la mayora de los procariotes, el desarrollo de una clula individual es continuo hasta la divisin en dos clulas nuevas (fisin binaria), el conocimiento de las caractersticas de crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues con ello se pueden reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los procesos generadores de metabolitos.