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Fundamento tcnicas microbiologa

1. Preparar frotis bacteriano: gota de agua en un porta, esterilizacin de

asa, tomar muestra de cultivo, realizar frotis con asa, fijar a la llama.

2.

Teir con cristal violeta 1min3. Lavar

4. Lugol 1 min

5. Lavar

6. Decoloracin: alcohol-acetona 30 seg.

7. Lavar

8. Teir con Safranina 1 min

9. Lavar

10.

Secar la preparacin11.Observar (100x)

Agares

1. Mc Conkey: selectivo: solo bacilos gram (-) y diferencial:

Fermentadores de Lactosa: rosada

No fermentadores de Lactosa: transparente

2. SS (Salmonella-Shiguella): selectivo: solo gram (-) y diferencial por

fermentadoras de lactora y no (rosado-transparente).

*colonias centro negro: productoras de SH2: Salmonella, no Shiguella.

3. TCBS (Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa):

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Batera Bioqumica Bacilos gram (-):

1.

TSI (Triple Sugar Iron Agar):

Fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa: produccin de

cido y gas

Indicador: rojo fenol: alcalinorojo, cidoamarillo

Produccin de H2S(ppdo negro) (gas) a partir de aa azufrados

(cistina, cistena y metionina) por presencia de enzima

disulfhidrasa)

Interpretacin:

o Agar tendido:

A= acidez/amarillo; fermentacin de Lactosa y/o

Sacarosa.

K= Alcalinidad/rojo; ausencia de fermentacin de

Lactosa y/o sacarosa

o Agar Profundo:

A= acidez/amarillo; fermentacin de glucosa.

K=alcalinidad /rojo; ausencia de fermentacin de

glucosa

Produccin de gas: ruptura del agar

Produccin de H2S: ennegrecimiento2. LIA (Lysine Iron Agar):

A: acidez/amarillo; sin descarboxilacin de lisina

K: alcalinidad/violeta; descarboxilacin de lisina a cadaverina

R: rojo; desaminacin de la lisina

3. MIO (Movilidad Indol Ornitina):

Movilidad: (+): enturbiamento del agar

(-):agar transparente , crecimiento o turbidez solo en

la picadura. Indol: (+): anillo rojo con reactivo de Kovacs (produccin de indol

derivado del triptfano).

(-):no hay variacin de color del reactivo

Ornitina: K=alcalino/violeta;descarboxilacin de la ornitina

(producto putrescina)

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A= acidez/amarillo; ausencia de descarboxilacin

*Las serologas se hacen a partir del agar MIO

4. Citrato: (+)= azul (uso de citrato de sodio, como nica fuente de

carbono para su metabolismo y crecimiento)

(-):verde (color original)

5. Urea:ureasa (+)=rosado (hidrlisis de urea con produccin de CO2 y

amonacocarbonato de amonioalcalinizacin del medio)

Ureasa (-):mismo color del medio

Oxidasa: Significa que la bacteria si posee citocromo c oxidasa, por lo

que puede usar oxigeno en la produccin de energa con una cadena

de transporte de electrones. Un ejemplo de identificacin pre-eliminar

es la identificacin de los gnerosNeisseriayMoraxella, los cuales

ambos son diplococosGram-negativosoxidasa positiva. Muchos Gram-

negativos, como los bacilos curvados como Helicobacter pylori, Vibrio

cholerae y Campylobacter jejuni son oxidasa positiva.

Las enterobacterias son las tpicas oxidasa negativa.4El que no la

poseen significa que no puede usar el oxigeno en la cadena de

transferencia de electrones o aplican una citocromo diferente para

transferir electrones al oxigeno.

Hidrlisis de arginina:FUNDAMENTO: Se trata de detectar la hidrlisis

de la arginina mediante la enzima que transforma este aminocido en

citrulina, con liberacin de amoniaco.TECNICA: Se inocula un tubo de

caldo-arginina y se incuba junto a un tubo testigo estril durante 24 h

(en ocasiones 2-7 das). Transcurrido este tiempo se deposita una gota

del acultivo sobre un portaobjetos y se aade una gota del reactivo de

Nessler, que reacciona con el amoniaco. El desarrollo de un color entreanaranjado y marrn, indica la presencia de amoniaco. El tubo estril

que sirve de control debe ensayarse al mismo tiempo y debe ponerse

de color amarillo plido o no mostrar ninguna reaccin coloreada.

RESULTADO +: Color anaranjado-marrn.

http://es.wikipedia.org/wiki/Neisseriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Neisseriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Neisseriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Moraxellahttp://es.wikipedia.org/wiki/Moraxellahttp://es.wikipedia.org/wiki/Moraxellahttp://es.wikipedia.org/wiki/Gram-negativohttp://es.wikipedia.org/wiki/Gram-negativohttp://es.wikipedia.org/wiki/Gram-negativohttp://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_de_la_Oxidasa#cite_note-Farmer-4http://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_de_la_Oxidasa#cite_note-Farmer-4http://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_de_la_Oxidasa#cite_note-Farmer-4http://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_de_la_Oxidasa#cite_note-Farmer-4http://es.wikipedia.org/wiki/Gram-negativohttp://es.wikipedia.org/wiki/Moraxellahttp://es.wikipedia.org/wiki/Neisseria

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RESULTADO -: Color amarillo plido o ausencia de color.

Hidrlisis de Hipurato:Fundamento:

Detectar la capacidad del la bacteria de hidrolizar el hipurato mediante

la enzima hipuricasa.

La hidrlisis del hipurato dar como resultado glicina, que reaccionar

con la Ninhidrina provocando un cambio de color.

Mtodo:

- Realizar una suspensin bacteriana en 0.01 ml de agua destilada

- Aadir un disco de hipurato

- Incubar durante 2 horas a 37C

- Revelar la suspensin aadiendo II gotas de Ninhidrina para detectar

la formacin de glicina

- Incubar durante 30 minutos a 37C

Interpretacin de los resultados:

La aparicin de un color prpura intenso pondr de manifiesto la

presencia de glicina, dando como resultado una prueba positiva.

Si el hipurato no se hidroliza a glicina, tras la adicin del reactivo de

Ninhidrina no habr cambio de color dando como resultado unaprueba negativa.

Prueba de oxidacin fermentacin: (O/F)

Fundamento: los organismos sacarolticos (fermentan azcares)

degradan glucosa ( por va fermentativa u oxidativa), el producto final

de la degradacin oxidativa (A/N) ,son cidos dbiles, para detectarlos

se necesita medio ms sensible a la oxidacin (Hugh y Leifson).

Se necesian dos tubos:Cerrado: con 1 cm de vaselina lquida esteril o parafina fundida

Abierto: sin sellar.

Incubar ambos a 35C

Interpretacin:

Abierto Cerrado Metabolismo

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cido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativocido (amarillo) cido (amarillo) Fermentativo

Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacaroltico

Catalasa: Fundamento: la catalasa descompone el perxido de hidrogeno

(H2O2) en agua e hidrgeno. A excepcin de los Streptococcus y

Enterococcus, la mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias

facultativas poseen actividad catalasa. Procedimiento: con un asa transferir

parte de la colonia a la superficie de un portaobjetos, agregar una gota de

perxido de hidrgeno al 3% y observar la formacin de burbujas.

Coagulasa: Fundamento: coagulasa convierte el fibringeno en fibrina, lo

que da como resultado la formacin de un coagulo visible. Coagulasa libre

(prueba en tubo): similar a la trombina presente en los filtrados de los

cultivos, procedimiento: emulsionar una colonia del microorganismo en un

tubo que contenga 0.5 ml de PLASMA para pruebas de coagulasa, incubar el

tubo a 35C durante 4hrs y observar si se forma el coagulo inclinando

ligeramente el tubo, si no hay coagulo incubar a T ambiente y leer luego de

18hrs.

Agar DNAsa: Medio de cultivo utilizado para la deteccin de enzimasdesoxirribonucleasas. Es especialmente til para la diferenciacin entre

especies de estafilococos, as como para la diferenciacin

de Serratia spp. de especies de Klebsiella y Enterobacter. Siembra

A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar un

inculo denso, ya sea en estra o por la tcnica de spot.

Incubacin : En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C.

Cubrir la placa con cido clorhdrico 1N, y observar dentro de los primeros 5

minutos. Resultados: Positivo: halo claro, transparente alrededor del

crecimiento bacteriano. Negativo: el medio se observa opaco.

Resistencia a Novobiocina: preparar suspensin o.5 de Mc Farland del

microorganismo a estudiar en caldo o agua destilada estril. Distribuir la

suspensin en la mitad de una placa de agar sangre. Colocar disco de

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Novobiocina en el rea sembrada. Incubar a 35C durante 18-24 hrs.

Interpretacin: Resistente a Novobiocina 12 mm de halo de inhibicin.

Sensible: halo 16 mm.

PYR: sustrato es la pL-pirrolidonil--naftilamida, este compuesto eshidrolizado por una aminopeptidasa especfica bacteriana. La hidrlisis libera

-naftilamida libre, que se detecta por el agregado de N-

dimetilaminocinnamalddehdo, que se une a la naftlamida para formar una

base de Schiff roja.

Test de Camp:Los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) producen una

protena difusible y termoestable (factor CAMP) que aumenta la beta-

hemlisis de Staphylococcus aureus. S. aureus(sembrado desde la parte

superior hasta la parte inferior de la placa) produce esfingomielinasa C que se

puede unir a las membranas de los eritrocitos. Cuando son expuestas al

factor CAMP del grupo B, las clulas sufren hemlisis.

Prueba de sensibilidad a bacitracina y trimetoprim-sulfametaxol

(cotrimazol) (SxT): Identificacin presuntiva de Streptococcus hemolticos

de los grupos A y B. Usar disco de bacitracina (Taxo A, 0.04 unidades/disco) y

disco SxT (1.25g/23.75g). Procedimiento: tomar 3 o 4 colonias y estriar

hasta el centro de la mitad de una placa de Agar Sangre, con hisopo estril o

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asa diseminar el inculo sobre toda la mitad de la placa. Colocar en forma

estril disco TAXO A y SxT sobre el rea sembrada. Incubar por 18-24 hrs a

35C. Interpretacin: Sensible = cualquier tamao de halo, Resistente =

desarrollo hasta el borde del disco. Se informa como estreptococo

betahemoltico presumiblemente grupo A/no grupo A por prueba de

bacitracina-SxT.

Bacitracina SxT IdentificacinS R Presumible grupo A

R R Presumible grupo B

S/R S Ni grupo A ni B

Sensibilidad a Optoquina: Con asa seleccionar 3-4 colonias delmicroorganismo a estudiar, y estriarlas en la mitad de una placa de Agar

sangre. Colocar disco de optoquina en el centro del rea centrada. Incubar a

35C por 18-24 hrs en jarra con vela (3-5%) CO2). Sensible : halo 14 mm

alrededor de disco de 6 mm (Taxo p) o 16 mm alrededor de disco de

10mm(Bacto). *Individuos con halos menores probar solubilidad en bilis.

Tincin de Zihel Neelsen:

Cubrir portaobjetos con fucsina filtrada

Calentar hasta emisin de vapores 3 veces durante 5 min

Lavar con agua

Cubrir con decolorante durante 3 min

Lavar con agua

Cubrir con azul de metileno durante 1 min

Lavar con agua

Secar al aireFundamento: Manifiesta la capacidad de resistir a la decoloracin

gracias al altocontenido de lpidos complejos (cidos miclicos) y ceras

que poseen algunos microorganismos en su pared celular. Los que

resisten la decoloracin se llaman cido alcohol resistentes (AAR) y se

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ven rojos mientras que se tien azul son los no cidoalcohol

reisistentes(no AAR).