UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

Departamento de Ingeniería Química

Laboratorio Diseño de Bio-Reactores

LABORATORIO 3: Determinación de Actividad Enzimática Específica

(Enzima Libre) y de Contenido de Proteínas

I. Introducción

La mayoría de las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de

reacciones biológicas. Sus principales características son su gran poder catalítico

y alta especificidad. La catálisis tiene lugar en un centro específico de la enzima

llamado sitio activo. La producción de enzimas es seguida por una purificación

y una estandarización del producto. En la formulación del producto se agregan

diversos excipientes (otras proteínas y azúcares, por ejemplo), por lo que un

preparado enzimático comercial no es 100% puro.

La reacción más simple que pueden catalizar las enzimas está representada por

la ecuación:

Donde E, S y P, representan a la Enzima, Sustrato y Producto, respectivamente.

ES y EP representan a los complejos transitorios Enzima-Sustrato y Enzima-

Producto.

En este práctico trabajaremos con lactasa, la cual es la enzima encargada de

convertir la lactosa en glucosa y galactosa.

Los objetivos son la determinación de la actividad específica enzimática de

lactasa y del contenido de proteínas de una formulación comercial de lactasa a

partir de Aspergillus Oryzae.

En este ensayo se utilizará lactosa como sustrato, y se monitoreará la

concentración de glucosa en el tiempo mediante el método de glucostat.

Para la determinación de proteínas, se utilizará el método de Bradford, por ser

una técnica sencilla, rápida y que presenta menor interferencias que otros

métodos de análisis.

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II. Determinación de Actividad Enzimática Específica

Con respecto a la determinación de la actividad de la enzima, debemos recordar

que la actividad enzimática:

Indica el máximo potencial catalítico de una enzima y está dado por la

velocidad inicial de la reacción.

La velocidad de reacción se mide cuantificando la evolución del

producto o del sustrato de reacción en el tiempo, pero este último es más

dificultoso ya que se utiliza en exceso y las variaciones en corto tiempo

no son notorias.

Se determina en las mejores condiciones para la enzima (T y pH óptimo)

y a concentraciones saturantes de sustrato.

La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de

enzima que permite catalizar 1 mol de sustrato por minuto de reacción

a las condiciones antes mencionadas.

La medición de actividad se ve afectada por los siguientes factores:

o Denaturación de la enzima (por temperatura)

o Reversibilidad de la reacción enzimática.

o Inhibición de la enzima (por producto o inhibidor externo)

o Desaturación de la enzima (baja concentración de sustrato)

Para evitar los tres primeros factores, la medición se realiza a tiempos cortos;

el último factor se evita al utilizar una concentración saturante de sustrato.

Al evitar tales problemas la velocidad de reacción sólo está condicionada por

la cantidad de enzima utilizada en la reacción.

III. Procedimiento Experimental

a. Determinación de la actividad de lactasa de Aspergillus oryzae.

Preparar a partir de una solución patrón de lactasa a 1000 ppm, 2 mL de

la dilución correspondiente a cada grupo.

Adicionar en tubos de ensayo 1,8 mL de lactosa 20 g/L.

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Pre-Incubar durante aproximadamente 3 minutos a 30ºC, para llevar el

sustrato a la temperatura óptima de reacción de la enzima.

Adicionar 0,2 mL de la solución de lactasa previamente diluida.

Incubar durante el tiempo de reacción seleccionado (0, 2, 5, 10, 15

minutos).

Detener la reacción mediante ebullición durante 5 minutos.

Determinar el contenido de glucosa en la muestra mediante el método de

glucostat.

b. La determinación de glucosa se realiza según un Kit enzimático:

A 0,1 mL de muestra (solución inactivada) agregar 1 mL del reactivo.

A 0,1 mL de estándar agregar 1 mL del reactivo.

Incubar a 37ºC por 10 minutos (para realizar la reacción).

Leer el valor de la absorbancia a 505 nm, contra un blanco de buffer y

reactivo. El valor de absorbancia del estándar se mide sólo una vez y

debe ser registrado.

Notas:

*Se utilizarán diferentes concentraciones de enzima para medir la actividad de

ésta.

*Las mediciones deben ser realizadas por duplicado.

*La solución enzimática debe ser realizada en buffer acetato pH 4.5 0.1 M de

manera de mantener la actividad de la enzima.

c. Determinación de la concentración de proteínas

El alumno deberá realizar la dilución correspondiente a partir de una

solución patrón de lactasa (1000 ppm) y determinar su contenido en

proteínas según el protocolo que se indica a continuación:

A 0,1 mL de muestra agregar 1 mL de reactivo de Bradford (entregado

por el ayudante).

Agitar suavemente para homogeneizar la solución y permitir la reacción.

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Esperar por aproximadamente 15 minutos en oscuridad (no más de una

hora).

Leer en espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm contra un

blanco de buffer y reactivo.

Interpolar el valor obtenido en la curva de calibración (entregada por el

ayudante).

Nota:

*Las diluciones en este caso se pueden realizar con agua destilada.

IV. Resultados Fundamentales a entregar en el informe

1. Cada grupo deberá recolectar los resultados obtenidos en las experiencias

hechas por los distintos grupos. Con estos resultados se deberá hacer el informe

del práctico de laboratorio. Deberán obtener de cada grupo la evolución de la

concentración de producto (glucosa) en el tiempo, para la concentración

específica de enzima usada en cada grupo.

2. Con estos resultados se deberán construir 2 gráficas. La primera de ellas

debe mostrar la evolución de la concentración de producto (µmoles/L) en el

tiempo (min) para cada una de las concentraciones de enzima. La segunda

gráfica debe mostrar la evolución de la velocidad inicial de reacción

(µmoles/L.min) en función de las concentraciones de enzima (mg prot/L)

usadas.

3. Se deberá entregar el valor de la actividad enzimática específica del

preparado enzimático original, expresada en UI/mg enzima (proteína).

4. Finalmente se deberá comparar el valor teórico de cantidad de proteína de la

enzima con la experimental.

IMPORTANTE: La concentración de enzima que se usó es de preparado

enzimático y NO de enzima. Para obtener la concentración de enzima considere

que el preparado enzimático contiene un 30% en peso de enzima (el 70%

restante son excipientes azúcares, estabilizantes y otros) por un lado, y por otro

considerar el valor calculado mediante el Método de Bradford.