Guía para la preparación y uso de medios de Cultivo en placa para el Laboratorio de Microbiología...

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DEMÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

“ZARAGOZA”

Guía para la preparación y uso de medios de Cultivo en placapara el Laboratorio de Microbiología I.

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

P R E S E N T A

MARTHA GARCÍA LÓPEZ

DIRECTOR: ENRIQUE ESCALERA ZÚÑIGA

2011

1

Es bueno dar gracias a Jehová…

Salmos 92:1 a

Los momentos más difíciles, a tu lado son y serán los más bellos de mi vida. Graciaspor ser mi mejor amigo y mi gran compañero en la vida.

Beny

Mi vida es hermosa cuando te veo sonreír.Jael

La ternura de tus manos son la fuerza de mi vida.Dany

La fortaleza y el aguante son tu gran escuela. Gracias por ser mi refugio en todomomento.

A mi madre

En lo bueno y en lo malo, en lo dulce y en lo amargo, siempre unidos siempre amano.Daniel

El trabajo y la honestidad tu forma de vida, Gracias mi viejo.A mi padre

2

AGRADECIMIENTOS

Mi agradecimiento a cuantas personas han hecho posible larealización del presente trabajo, especialmente al Q.F.B. Enrique EscaleraZúñiga por su gran apoyo, confianza, así como todo el tiempo que mededicó y a sus valiosas recomendaciones para mi trabajo. Mi granadmiración a su calidad humana y perseverancia.

Universidad Nacional Autónoma de México

No solo por los conocimientos brindados, sino por los valores adquiridos ylas experiencias vividas en esta gran institución.

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

“Educar no es dar carrera para vivir, sino templar el alma para lasdificultades de la vida." Pitagoras.

Mtra. Dora A. Pérez González por sus amables y valiosassugerencias.

Q.F.B. Carina Gutiérrez Iglesias, Q.F.B. Ma. De Las Mercedez ZamudioDurán y Q.F.B. Gabriel A. Romero Díaz.

Y a todos mis profesores que me brindaron su cariño y confianza durantetoda mi formación.

3

Tabla de contenidoINTRODUCCIÓN.....................................................................................................................4PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................5OBJETIVOS ..............................................................................................................................6FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA...........................................................................................7Capítulo I. Medios de cultivo .....................................................................................................7

1.1 Generalidades ...................................................................................................................71.2 Nutrición...........................................................................................................................81.3 Sustancias químicas y compuestos usados en la formulación de medios.......................101.4 Clasificación de medios de cultivo.................................................................................17

Capítulo II. Aislamiento y medios especiales ..........................................................................202.1 Aislamiento de microorganismos en cultivo puro..........................................................202.2 Medios empleados para aislamiento de bacterias Gramnegativas..................................23

Agar MacConkey..............................................................................................................23Agar EMB ........................................................................................................................26Agar Salmonella y Shigella ..............................................................................................30Agar Verde Brillante ........................................................................................................33

2.3 Medios empleados para aislamiento de bacterias Grampositivas ..................................36Agar para Estafilococos No.110.......................................................................................36Agar Sal Manitol ..............................................................................................................39

2.4 Medio de apoyo ..............................................................................................................42Agar Nutritivo ..................................................................................................................42

2.5 Medios de enriquecimiento y selectivos.........................................................................44Agar Base Sangre ............................................................................................................44Agar Chocolate .................................................................................................................50Agar Mueller Hinton ........................................................................................................54Agar Leche .......................................................................................................................59Agar Tioglicolato..............................................................................................................62

2.6 Medios cromogénicos.....................................................................................................64Capítulo III. Preparación y control de calidad..........................................................................66

3.1 Preparación de medios y control de calidad ...................................................................663.2 Almacenamiento de medios de cultivo...........................................................................72

Anexo 1 ....................................................................................................................................73Rutas Metabólicas ..............................................................................................................73

Anexo 2 ....................................................................................................................................80Normas Oficiales Mexicanas................................................................................................80

Anexo 3 ....................................................................................................................................97Escala de MacFarland...........................................................................................................97

Anexo 4 ....................................................................................................................................99Esterilización por autoclave..................................................................................................99

CONCLUSIONES .................................................................................................................103REFERENCIAS ....................................................................................................................104

4

INTRODUCCIÓN

Sobre la base de su etimología, la Microbiología podría definirsecomo la ciencia que estudia a los seres vivos muy pequeños,concretamente a aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poderresolutivo del ojo humano.

Los inicios de la Microbiología se remontan a épocas muy antiguas,es hasta el siglo XVII con la invención del microscopio cuando estaciencia comienza a desarrollarse, La implementación de nuevosinstrumentos y técnicas permite que hacia finales del siglo XIX se leconsidere como una ciencia especializada.

La Microbiología abarca una enorme heterogeneidad de tiposestructurales, funcionales y taxonómicos, por lo que su estudio esextenso, aunque con una gran coherencia interna.

Así pues esta disciplina estudia a los microorganismos como seresde tamaño microscópico dotados de individualidad, con una organizaciónbiológica sencilla, que necesitan para su estudio de una metodologíapropia y adecuada a sus necesidades.

La necesidad de estudiar a estos microorganismos obliga aldesarrollo de cultivos nutritivos donde se aíslen y den paso a unaadecuada identificación, la cual permite al microbiólogo realizar uninforme al personal especializado para tomar acciones en contra o a favordel crecimiento de las bacterias.

La implementación de los cultivos en placa, ha posibilitado loseñalado anteriormente. El presente trabajo plasma los conceptos sobreel desarrollo, aislamiento e identificación de algunas de las bacteriasutilizadas en el laboratorio de Microbiología General I, así como la técnicade preparación y el control de calidad de los medios de cultivo en placa.

5

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El módulo de Microbiología General I es una incursión en losconocimientos básicos que preparan al alumno para la amplia gama deaplicaciones de ésta área en el mundo laboral.

Específicamente la práctica sobre preparación de medios de cultivoes para ellos el primer contacto con la selección, preparación, uso einterpretación de los medios de cultivo, a fin de realizar una correctaidentificación de los microorganismos estudiados.

Si bien el módulo de Microbiología General I cuenta con un manualque apoya al alumno con el propósito antes señalado es necesario realizarun documento que tenga la finalidad de dar una información másdetallada de los fundamentos teóricos, la preparación, aplicaciones einterpretación de los medios de cultivo, así como las especificaciones queestipula la Secretaría de Salud en la Norma Oficial Mexicana, para esterubro.

Por lo tanto este trabajo tiene como propósito presentar dichainformación de la forma más concisa posible para que el alumno laemplee como una guía para la preparación e interpretación de resultados.

6

OBJETIVOS

Elaborar un manual para el área de Microbiología General I, el cualpermita al alumno:

1. Conocer los medios de cultivo empleados comúnmente para elaislamiento de las bacterias grampositivas y gramnegativasestudiadas en el módulo.

2. Familiarizarse con su clasificación, fundamentos, principios yusos.

3. Conocer las recomendaciones y control de calidad para lapreparación y conservación de los medios de cultivo en placa.

7

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA

Capítulo I. Medios de cultivo

1.1 Generalidades

La Microbiología es la ciencia que estudia a los microorganismos,ésta comienza su desarrollo en el siglo XVII con la invención delmicroscopio por Leewenhoek, su avance paulatino a lo largo de lossiguientes siglos permite que otras ciencias ayuden a conformar losconocimientos sobre las características de tipo bioquímico, estructural,fisiológico, taxonómico, genético, etc. de los microorganismos que estánestrechamente relacionados con los seres humanos, los cuales puedentraer beneficios o problemas que influyen directamente con su entorno,social, económico y de salud, por mencionar algunos.

Por lo cual se han desarrollado técnicas y metodologíasexperimentales, del manejo y control de los microorganismos, así comode aislamientos e identificaciones de agentes patógenos que causan en elhombre múltiples enfermedades, ya sea por colonización en el cuerpohumano o por contaminación de vehículos como alimentos de origenanimal o vegetal. Así como el control a nivel industrial de productos deconsumo humano.

Fue el microbiólogo Robert Koch (1843-1910) quien realizóaportaciones para el aislamiento de cultivos puros de microorganismos enplacas de gelatina sólida (base del método actual), otros grandesinvestigadores a principio del siglo XX desarrollaron los medios de cultivoselectivos y específicos, que hoy día la Microbiología médica, alimenticia eindustrial emplean para el aislamiento de microorganismos patógenosque desean identificar (1).

Existen datos que señalan a Fannie Hesse, como la mujer de uncolaborador de Koch de nombre Walter Hesse quien hacia finales del sigloXIX sugirió este medio para el cultivo de bacterias; ella utilizaba un polvode algas que empleaba para espesar las mermeladas, técnica queaprendió de sus amigos holandeses de Batavia, la cual resultó decisivapara obtener cultivos puros y que permitió un rápido progreso en elcampo de la Microbiología (2).

El trabajo de Koch consistió en apartarse de los cultivos líquidos,con sus meticulosas diluciones y frecuente contaminación, y adaptar una

8

simple pero poderosa técnica que usaba un medio sólido. Al agregargelatina, y posteriormente agar, a su caldo de extracto de carne creó laplaca rayada. Más tarde demostró que al mezclar de forma cuidadosamaterial sospechoso dentro del medio fundido y verterlo en una placa seproducía una valoración cuantitativa de los números bacterianos, unatécnica utilizada, en la forma de placa rayada. Richard Julius Petri unode los asistentes de Koch, reemplazó la placa de vidrio de Koch cubiertacon una campana, por la placa de Petri. Este diseño permaneció sincambio por más de 100 años.

Koch fue consciente de que un medio universal para bacteriaspatógenas era imposible. Mostró también que Mycobacterium tuberculosisno podía crecer sobre el medio de agar de infusión de carne, para éstemicroorganismo utilizó suero coagulado, huevo o papa rebanada. Laadición más importante al caldo de infusión de carne de Koch fue lapeptona, un digerido péptico de proteína que sugirió Loeffler(3). Ésteúltimo también incorporó 0.5% de peso/volumen de cloruro de sodio y sumedio nutritivo, sigue siendo hasta la fecha uno de los medios de cultivocomplejos e indefinidos para microorganismos quimioheterótrofos(aquellos que requieren utilizar compuestos de carbón orgánico, enoposición a las bacterias autótrofas, las cuales no requieren nutrientesorgánicos para crecer).

1.2 Nutrición

Se llama cultivo al proceso de multiplicar microorganismosmediante las condiciones ambientales adecuadas. Los microorganismosen crecimiento realizan copias de sí mismos y requieren los elementosque se encuentran en su composición química, los nutrientes debenproporcionar estos elementos de manera metabólicamente accesible.Además, dichos microorganismos requieren energía metabólica parasintetizar macromoléculas y conservar los gradientes químicos esencialesa través de sus membranas. Los factores que se deben controlar duranteel crecimiento son nutrimentos, pH, temperatura, aireación,concentración de sales y potencial iónico del medio.

Requerimientos para el crecimiento. La mayor parte del pesoseco de los microorganismos consiste en materia orgánica que contienecarbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. Además, serequieren iones inorgánicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcioy cloro para facilitar la catálisis enzimática y conservar los gradientesquímicos a través de la membrana celular.

9

Para que un microorganismo crezca, se requieren todos loselementos contenidos en su materia orgánica y el complemento total deiones necesarios para la producción de energía y la catálisis. Ademásdebe haber una fuente de energía que establezca la fuerza motriz de losprotones y que permita la síntesis macromolecular. Los microorganismosvarían ampliamente en cuanto a sus demandas nutricionales y susfuentes de energía metabólica.

Los tres mecanismos principales para generar energía metabólicason fermentación1, respiración y fotosíntesis. Para poder crecer, elmicroorganismo debe utilizar por lo menos uno de estos mecanismos.

Nutrientes en el medio de cultivo

Los nutrientes en el medio de cultivo deben contener todos loselementos necesarios para la síntesis biológica de nuevosmicroorganismos. En la siguiente descripción se clasifican según loselementos que aportan (4).

Fuentes de carbono. La glucosa puede apoyar el crecimientofermentativo o respiratorio de muchos microorganismos. Es importanteque se proporcionen los sustratos del crecimiento en las concentracionesadecuadas para la cepa microbiana en desarrollo, las concentracionesque apoyan el crecimiento de un microorganismo pueden inhibir el deotro.

Se requiere dióxido de carbono (CO2) para diversas reaccionesbiosintéticas. Muchos microorganismos respiratorios producen dióxidode carbono en cantidad más que suficiente para satisfacer susrequerimientos, pero otros necesitan una fuente del mismo en su mediode crecimiento.

Fuentes de nitrógeno. El nitrógeno es un componente esencial deproteínas, ácidos nucleícos y otros compuestos, llegando a representaraproximadamente 5% del peso neto de una célula bacteriana típica, éstepuede ser suministrado de diferentes maneras y los microorganismos

varían en su habilidad para asimilar nitrógeno (NO3-, NO2, N2O, NH4+, R-

NH2).

1 Ver anexo 1.

10

Fuentes de azufre. Al igual que el nitrógeno, el azufre es uncomponente de muchas sustancias celulares orgánicas. Constituye partede la estructura de diversas coenzimas y se encuentra en las cadenaslaterales de cisteinilo y metionilo de las proteínas. El azufre en su formaelemental puede ser oxidado por algunas bacterias autótrofas a sulfato(SO42-). La mayor parte de los microorganismos puede utilizar el sulfatocomo fuente de azufre mediante la reducción del primero al nivel delácido sulfhídrico (H2S). Algunos microorganismos pueden asimilar H2Sdirectamente del medio de cultivo, pero este compuesto puede ser tóxicopara muchos de ellos.

Fuentes de minerales. Se requieren numerosos minerales para lafunción enzimática. Los iones magnesio (Mg2+) y ferroso (Fe2+) seencuentran también en los derivados de las porfirinas; el magnesio en lamolécula de clorofila y el hierro como parte de las coenzimas de loscitocromos y de las peroxidasas. Tanto el Mg2+ como el K+ son esencialespara la función y la integridad de los ribosomas. Se requiere Ca2+ comoconstituyente de las paredes celulares de las bacterias grampositivas,aunque es innecesario en las bacterias gramnegativas. Muchosmicroorganismos marinos requieren Na+ para crecer. Al formular unmedio para el cultivo de la mayor parte de los microorganismos esnecesario brindarles fuentes de potasio, calcio, magnesio y hierro, por logeneral en forma de iones (K+, Mg2+, Ca2+, y Fe2+) Se requieren tambiénotros minerales (por ejemplo Mn2+, Mo2+, Co2+, Cu2+ y Zn2+), éstos seencuentran a menudo en el agua ordinaria del grifo o comocontaminantes de otros ingredientes del medio de cultivo.

1.3 Sustancias químicas y compuestos usados en laformulación de medios

Las formulaciones empleadas para los diversos medios puedencontener tan poco como tres ingredientes (caldo nutriente de Loeffler) ohasta 10, como muchos medios para microorganismos exigentes. Elnúmero de ingredientes tiene poca relación con su crecimiento. Uncultivo “simple” puede ser complejo y del todo indefinido. Una estructuracomún de los medios de cultivo para agentes patógenosquimioheterótrofos es la siguiente.

11

Base amina - nitrógeno (Hidrolizados de proteínas). Mezcla deaminoácidos libres, péptidos y proteosas que pueden permanecer ensolución después de ser calentadas a 100 ºC.

Existen una gran variedad de éstas debido a las diferentesdemandas de los microorganismos para ciertos aminoácidos y péptidos.En general las proteínas empleadas para la producción de peptonas sonde dos tipos, proteínas animales (incluyendo caseína, gelatina y carne) yproteínas vegetales (soya). Las peptonas se obtienen por diferentes tiposde digestión ya sea ácida, alcalina o enzimática para obteneraminoácidos y péptidos que pueden ser transferidos dentro de la célula yusarse como fuentes de carbón para energía o polimerización de lasproteínas funcionales.

Tabla 1Principales hidrolizados de proteínas empleados en las formulaciones de

medios de cultivo

Hidrolizados deproteínas

Características

Extracto de carne Se emplea en varias fórmulas especiales como cultivo deestreptococos y medios para producción de antígenosfebriles.

Peptona de carne Debido a su alto contenido de azufre es adecuada parapruebas de formación de sulfuro de hidrógeno. Promueve eldesarrollo abundante de una amplia variedad demicroorganismos.

Peptona de caseína Adecuado para el cultivo de muchos grupos de bacteriasincluyendo ciertos microorganismos exigentes.

Peptona de soya Por su alto contenido de carbohidratos es adecuada para elcultivo de una gran variedad de microorganismos. Contieneun alto nivel de vitaminas especialmente de Tiamina.

Fuentes de energía (Hidratos de carbono). Proporcionan unarápida fuente de carbono como energía, además de servir como sustratosde reacciones bioquímicas para la identificación de microorganismosdesconocidos. Los disacáridos más utilizados son: lactosa, sacarosa ymaltosa; las pentosas y hexosas comúnmente empleadas son la dextrosay la xilosa. Algunos alcoholes y carbohidratos complejos.

12

Sales amortiguadoras. Proporcionan un pH estable para elóptimo crecimiento de microorganismos, así como pH de referenciaestándar para aquellos medios en los cuales se usan reacciones ácidas oalcalinas para la identificación de los mismos. Suelen agregarse a lasformulaciones con grandes cantidades de carbohidratos (por ejemplo losque contienen peptona de soya), Desafortunadamente muchosamortiguadores tienden a quelar metales esenciales y deben utilizarsecon cautela. Los péptidos y aminoácidos pueden actuar como agentesamortiguadores a través del efecto zwitterion de las agrupacionesNH2/COOH. Los más usados para este fin son los fosfatos de potasio yde sodio, además de citratos y acetatos.

Factores de crecimiento suplementarios (Enriquecedores). Seemplean para recuperar microorganismos exigentes como Neisseria sp.,Bordetella sp. y Legionella sp., que necesitan factores de crecimientoadicionales. El considerable beneficio de la sangre entera en estosmicroorganismos se atribuyó con anterioridad a los factores decrecimiento agregados. Se considera ahora que el papel principal de lasangre entera es proteger a los agentes patógenos vulnerables de losprocesos tóxicos de la oxidación. Se emplean comúnmente la sangre,suero, hemoglobina, suplementos vitamínicos, nucleótidos y extractos delevaduras.

Agentes selectivos (Inhibidores). El principal propósito alañadirse a un medio selectivo es el de inhibir el crecimiento dedeterminadas especies bacterianas no deseadas y su concentración es desuma importancia para determinar la selectividad del medio. Todos losagentes selectivos poseen cierta toxicidad para algunas especies y esposible que de forma ocasional no supriman a todas las especiesindeseables. Una regla general es que cualquier incremento de losnutrientes en el medio requiere un aumento del agente selectivo yviceversa. Los agentes selectivos pueden interactuar en forma mutuapara acentuar o atenuar su selectividad, por ejemplo, las sales biliaresdisminuyen la toxicidad de los colorantes. Los agentes selectivos puedentambién afectarse por sustancias que secuestran cationes, por ejemplo,ciertos colorantes, sales biliares pueden volverse más tóxicos y casi todoslos amortiguadores. Este efecto puede revertirse con la adición decationes (Mg+/Ca2+). En general se identifican como colorantes deanilina, metales pesados, agentes antimicrobianos, así como ciertassustancias químicas.

13

Indicadores de pH. Son indispensables para medir los cambios depH en medios de prueba resultantes del metabolismo bacteriano dedeterminados sustratos (fermentación, desaminación o descarboxilación)también se incluyen otros indicadores en un medio para detectarproductos bacterianos específicos por ejemplo en H2S. Los medios decultivo cromógenos desarrollados para indicar colonias que producenactividades enzimáticas especificas son casi siempre mezclas decolorantes indicadores. Todos los colorantes requieren cuidadosadosificación para evitar la inhibición selectiva. Algunos son fucsina, azulde metileno, rojo neutro, rojo fenol, púrpura de bromocresol, ionesférricos y ferrosos.

Otros compuestos y sustancias químicas: Se emplea el agarcomo agente solidificante, para medios sólidos y semisólidos, además desustancias como el tiosulfato de sodio como fuente primordial de azufre.

Agar. Etimológicamente la palabra “Agar” debe su origen al vocablomalayo con que se designan las algas rojas del género Eucheuma. El agares una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especiesmarinas de algas rojas (división Rhodophyceae), particularmente de losgéneros Gelidium, Gracilaria, Phteroclaida y Acanthopeltis. Por su calidady uso existen dos grupos de agares: Industriales y Bacteriológicos. Lapared celular de estas algas está diferenciada en una capa interna decelulosa y una externa amorfa de naturaleza péptica, rica en coloidesgelificados. Estas sustancias son indigeribles y constituyen fibra de tiposoluble.

Agar industrial. El empleo del agar en las industrias alimentarias(conservas cárnicas y vegetales, dulces, chocolates, pasteles, helados,jarabes, sopas, flanes, jaleas etc.) es enorme debido a sus propiedadescomo agente dispersante, estabilizador, espesante o gelificador, etc.Substituye con muchas ventajas a la pectina y al ser una gelatina vegetalde origen marino, viene a ser un perfecto substituto de las gelatinas deorigen animal puesto que el poder gelificante del primero es ocho vecessuperior al de las segundas.

Agar bacteriológico. Es un agar especialmente refinado al que sele ha reducido a un grado óptimo su contenido en sales minerales, estálibre de metales tóxicos y posee una gran fuerza de gel. Se puedenobtener geles bien formados y consistentes a la concentración del 1.0 al1.5% (m/v). No contiene las impurezas encontradas en los agares

14

comerciales (gomas, compuestos nitrogenados, sales insolubles, azúcareslibres, microorganismos muertos, bacterias termófilas, ni pigmentos).

Químicamente el agar es una mezcla de dos polisacáridos agarosa yagaropectina (polímeros de la galactosa). La proporción deagarosa/agaropectina es variable, con valores extremos de 75% deagarosa y 25% de agaropectina, según la clase de algas utilizadas. El agares también una buena fuente de magnesio y hierro, también seencuentran calcio, potasio y yodo.

La agarosa es un polímero lineal, compuesto de unidadesalternadas de D-galactosa y de 3-6 anhidro L-galactosa, enlazadas poruniones alfa-1,3 y beta 1,4 alternadamente.

Fig. 1Estructura molecular de la agarosa.

La agaropectina es una cadena ramificada, por uniones de Dextro yLevo galactosa esterificada por grupos sulfato y que contiene tambiénácidos gulurónico y pirúvico.

El agar puede contener una variedad de impurezas particularmentesales inorgánicas que varían según la fuente del mismo y el método deextracción. Por ejemplo, el agar mexicano (producido en las costas deBaja California) es más rico en ciertas sales que el agar español, lo queles confiere una cierta diferencia en sus propiedades, esto les permitetener la facultad de emplearse en los medios de cultivo especiales paragérmenes exigentes y de difícil desarrollo.

15

Con agua destilada fría, el agar tiene un poder de hinchamientosuperior a 3000%. Esta capacidad de absorción puede alterarsefácilmente por diversos factores físicos tales como la desecación excesiva,calentamiento prolongado, etc. Producidos unas veces durante el procesode fabricación y otras durante su preparación en el laboratorio, causandomodificaciones estructurales. Algunos agentes modificadores de lanaturaleza química de la capacidad de hinchamiento del producto final,son los cambios de pH, las sales disueltas, la temperatura, etc.

La temperatura influye en el caso de la velocidad de hinchamiento,cuando el agua es calentada (entre 40 – 50 ºC) cambia, y las partículasque se mantenían separadas en frío, tienden a unirse, más rápidamente.

En agua hirviendo el agar se disuelve en pocos minutos en sutotalidad. Produciendo un gel perfectamente limpio y transparente, laviscosidad del gel aumenta poco a poco a medida que la solución seenfría, gelificando entre los 35 – 40 ºC.

La gelificación bajo un punto de vista coloidal, se genera cuandolas moléculas de agua se fijan a la micela, ocasionando con la solvataciónun incremento de masa de esta.

El gel de agar, al igual que los demás coloides gelificados, tienetendencia a encoger y a liberar gotitas de agua que arrastran loscomponentes solubles del medio de cultivo existentes en él (agua decondensación). Esta propiedad sinéresis, es inversamente proporcional ala concentración.

Los ácidos diluidos en un medio frío, no alteran sensiblemente elagar, limitando su acción a ligeros cambios en la dureza del gel obtenido.Pero al contrario, operando en caliente o con ácidos concentrados, el agarpuede hidrolizarse total o parcialmente perdiendo su capacidadgelificante. Que solo puede recuperarse parcialmente neutralizando conuna base, pero generando productos de mala calidad.

Las propiedades ópticas de los geles de agar se manifiestanfundamentalmente por la transparencia. Esta propiedad depende de la

16

mayor o menor simetría de hidratación con que se solvatan las micelasdurante la gelificación.

Las características que confiere el agar a los medios de cultivo lepermite ser hasta este momento insustituible en el área de bacteriología,algunas de ellas son:

Su estructura le permite tener una gran estabilidad frente aenzimas microbianas, muy pocas bacterias (prácticamente soloalgunas bacterias marinas como Pseudomonas carragenomora) soncapaces de hidrolizar los enlaces de la molécula de agarosa yagaropectina. Por lo tanto con el resto de las bacterias, lasmoléculas permanecen intactas y por ser insoluble en frío, éstepolisacárido no puede ser utilizado por los microorganismos comofuente de carbono y el o los nutrientes adicionados actúanúnicamente como tales y sin ninguna interferencia del agentegelificante.

Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estadosólido (prácticamente en cultivos de cualquier bacteria) lo cual noocurre con ningún otro de los geles que puedan utilizarse con éstefin.

Su punto de fusión, superior a 80 ºC, permite cultivar en mediosólido bacterias termófilas que se incuban hasta temperaturas de65 ºC, y que por lo tanto no podrían ser cultivadas en mediossólidos con otros gelificantes con menor punto de fusión.

Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 ºC, permitemezclarlo en forma líquida sin que ello suponga la destrucción deproteínas complejas y de factores termolábiles (como en el caso dela sangre, y sin que se produzca la coagulación de la misma).

Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajasconcentraciones, alrededor del 1 – 1.5% (m/v), permitiendo obtenergeles firmes y consistentes, sobre los cuales se realiza elaislamiento de bacterias o purificación de cultivos.

El empleo en concentraciones muy bajas permite la obtención demedios semisólidos en los cuales se pueden realizar con excelentesresultados los controles de movilidad en las bacterias.

17

Su contenido en sales minerales es controlado escrupulosamente loque permite obtener resultados confiables y reproducibles en laspruebas de antibiogramas (impidiendo la formación de quelatos uotra clase de complejos).

1.4 Clasificación de medios de cultivo

Hasta mediados del siglo XX los microbiólogos aceptaron que losmedios de cultivo eran más bien un preparado culinario y noformulaciones científicas. Casi sin excepción todos los ingredientesempleados eran materiales naturales variables indefinidos. Elcomportamiento del crecimiento varió en grado amplio y esto suscitó eldeseo de crear medios que reprodujeran un comportamiento estándar (5).

Entre 1950 y 1975 los microbiólogos intentaron fusionaraminoácidos nucleótidos, vitaminas, minerales y metales seleccionadospara que crecieran agentes quimioheterótrofos al mismo ritmo y con lasmismas características que en medios indefinidos lo que permitió eldesarrollo de los medios sintéticos o químicamente definidos.

Con este avance en la formulación de los medios de cultivo se puedeseñalar la siguiente clasificación2.

Por su composición química

Medios sintéticos o químicamente definidos. La naturalezaquímica y la concentración de los nutrientes es conocida, son medios deelección para el desarrollo y aislamiento de microorganismos conrequerimientos específicos para su crecimiento.

Medios semisintéticos. El gran número de factores de crecimientoexigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un mediosintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En estecaso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extractoorgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.). Ciertos

2 La clasificación de acuerdo a la Secretaría de Salud se encuentra en el anexo 2 en la Norma Oficial MexicanaNOM-065-SSA1-1993, Que establece las Especificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo.

18

gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté,haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas característicasdeterminadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, lasChlamydias, Rickettsias, etc.

Medios complejos o naturales. Son llamados complejos debido aque no se conoce con certeza la composición y la concentración exactade sus nutrientes. El caldo de infusión de carne es un ejemplo. En estetipo de medios no se identifica cual es la fuente de energía, ni los factoresde crecimiento presentes (6).

Por su aspecto físico

Medios líquidos. En los medios líquidos los nutrientes sedisuelven en agua y el crecimiento bacteriano se manifiesta con uncambio en el aspecto del caldo, de límpido a turbio.

Se emplean fundamentalmente para:

Cultivar los microorganismos o bien para obtener la producción demetabolitos específicos.

Estimular y promover la selección de algún o algunosmicroorganismos e impedir que otros se multipliquen.

Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebasbioquímicas.

Medios semisólidos. Se utilizan para identificaciones bioquímicas yaveriguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienenuna consistencia blanda.

Medios sólidos. Se elaboran agregando un agente solidificante a losnutrientes y al agua. El agregado de agar permite la preparación de unmedio sólido.

Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Losmedios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que seemplean en Microbiología.(7)

Por su uso

Es importante destacar que muchos medios utilizados en eldiagnóstico bacteriológico cumplen más de una función.

19

Medios de apoyo. Contienen nutrientes que favorecen el desarrollode la mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales y sinbrindar ventaja alguna en el crecimiento de un microorganismo enparticular.

Medios selectivos. Contienen uno o más agentes que inhiben eldesarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permitenel aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.Los agentes inhibidores utilizados para este propósito son colorantes,sales biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos.

Medios de enriquecimiento. Contienen nutrientes específicosrequeridos para preparar el medio de cultivo y reproducir el ambientenatural del microorganismo deseado, a partir de una mezcla demicroorganismos.

Medios diferenciales. Emplean un factor (o factores) que permiteque las colonias de una especie o tipo bacteriano exhiban ciertascaracterísticas metabólicas o de cultivos que pueden utilizarse paradiferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo medio, puedencontener indicadores de ácido base, redox o sustancias que detecten loscambios en el medio o en las características típicas de las colonias.

Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos. Son medios decultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosiso de microaerofilia.

Medios de transporte. Sirven para transportar los especímenesque contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del productohasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.

Estos medios impiden que se altere la proporción original de la floramicrobiana en los especímenes.

20

Capítulo II. Aislamiento y medios especiales

2.1 Aislamiento de microorganismos en cultivo puro

Para estudiar las propiedades de una bacteria es necesariomanejarla en cultivo puro, libre de otros microorganismos. Para haceresto, debe aislarse una sola célula de todas las demás y cultivarse de talmanera que su progenie también permanezca aislada. Para esto sedispone de varios métodos (8).

Inoculación en placa

El método por estriado en placa, requiere de un alambre deNichrome o platino, con una punta en asa o recta y el otro extremoinsertado en un mango cilíndrico para un uso sencillo.

Estriado en cuatro cuadrantes. La inoculación primaria (fig. 2)puede hacerse con un asa, hisopo estéril u otro dispositivo adecuado,seguido de la diseminación del material con un alambre en asa o recto.El inóculo se disemina con un movimiento hacia atrás y hacia delante encada uno de los cuatro cuadrantes girando la placa a 90º. El asa oalambre debe esterilizarse entre cada diseminación hacia un cuadrante(el alambre debe calentarse al rojo vivo y para enfriarse se recomiendapicar en el contorno de la superficie del agar). Se pretende con estatécnica diluir el inóculo lo suficiente como para obtener colonias aisladaslas cuales puedan subcultivarse de forma individual en otros medios,para llegar a obtener aislamientos puros.

Estriado para recuento semicuantitativo. Se requiere de asas deinoculación de Nichrome o platino (evitar las de tipo ferrosas), calibradaspara contener 0.01 o 0.001 mL de líquido (fig. 3), 1) se sumerge en lamuestra y se retira con la precaución de llevar todo el volumen a lasuperficie del agar, realizando una estría a través del centro, 2) el inóculose disemina en ángulos rectos con respecto a la estría primaria, 3) se girala placa 90º y se continua hasta cubrir la superficie.

21

Fig. 2Patrón en estrías para inocular medios para aislamiento de colonias bacterianas

Figura modificada de Pollack R A (9)

Dilución por extinción

Fig. 3Patrón en estrías para inocular medios para recuento semicuantitavo de colonias bacterianas

1) Inoculación 2) Estrías en ángulos 3)Estrías en ángulos rectosprimaria rectos para producir un crecimiento

en enrejado

22

Este método es menos seguro ya que de la suspensión de lamuestra se hacen diluciones seriadas y se siembra cada una en placa. Sisólo algunos inóculos de una dilución particular tienen desarrollo, sepresume que alguna de las colonias partieron de células únicas. Estemétodo no se usa a menos que por alguna razón sea imposible la siembraen placa. Una desventaja de este método es que sólo se puede utilizarpara aislar el tipo de microorganismo predominante en una poblaciónmixta.

23

2.2 Medios empleados para aislamiento de bacteriasGramnegativas

Agar MacConkey

El agar MacConkey (10) es un agar moderadamente selectivo(primario) y diferencial, empleado principalmente para la detección yaislamiento de organismos gramnegativos de muestras clínicas,productos lácteos, alimentos, agua y muestras de origen industrial ofarmacéuticas.

Es utilizado para el aislamiento y diferenciación de enterobacteriasfermentadoras de la lactosa y las no fermentadoras (11).

El agar MacConkey es usado con un carbohidrato adicionado parala diferenciación de coliformes, basado en las reacciones de fermentación.Las peptonas son fuentes de nitrógeno y otros nutrientes. La lactosa es elcarbohidrato fermentado. Cuando la lactosa es fermentada baja el pH delmedio que es detectado por el indicador (rojo neutro) dando colonias rojoladrillo a rosadas y se observa la precipitación de la bilis. Las salesbiliares y el cristal violeta son agentes selectivos que inhiben elcrecimiento de microorganismos grampositivos. El agar es el agentegelificante.

Fórmula

Fórmula aproximada para 1 L

Peptona 17.0 gMezcla de peptonas 3.0 gLactosa 10.0 gMezcla de sales biliares 1.5 gCloruro de sodio 5.0 gAgar 13.5 gRojo neutro 0.03 gCristal violeta 1.0 mgSolución a 25 ºC pH 7.0 ± 0.2

24

Usos

Medio empleado ampliamente para aislar e identificarselectivamente a enterobacterias como salmonellas, shigellas y coliformesa partir de heces, orinas, aguas negras y diversos alimentos.

Inoculación

El espécimen puede sembrarse directamente en la placa por estríasuperficial o bien inocularlo en medios líquidos de enriquecimiento talescomo Caldo tetrationato o Caldo selenito-cistina, incubar los caldos a 35± 2 ºC de 18 a 24 h. Hacer resiembras de estas en placas de agarMacConkey y volver a incubar.

Medios Alternos

Se recomiendan los siguientes medios que pueden ser óptimos para larecuperación de enterobacterias:

Agar EMB Agar SS Agar Tergitol 7 Agar XLD Agar Entérico Hektoen Agar Sulfito de Bismuto (altamente específico para Salmonella typhi) Agar Verde brillante especial para salmonellas, entre otros.

Resultados

Los microorganismos fermentadores de la lactosa intensos, comoEscherichia sp., Klebsiella sp. y Enterobacter sp. crecen como coloniasrosas - rojo ladrillo, con o sin una zona de precipitado biliar mientras quelos fermentadores lentos o débiles de lactosa, como Citrobacter sp.,Providencia sp., Serratia sp., y Hafnia sp. pueden aparecer como coloniasincoloras después de 24 h o levemente rosadas en 24 – 48 h. Lascolonias no fermentadores crecen incoloras o claras tal es el caso de lasPseudomonas que presentan colonias incoloras – café verdosas, con olordulzón característico, Proteus, Edwarsiella, Salmonella y Shigella sp.Producen colonias incoloras o transparentes, con raras excepciones.

25

Tabla 2Interpretación en Agar MacConkey

Limitaciones

Aunque el medio es selectivo para bacilos gramnegativos entéricos,se recomienda realizar las pruebas bioquímicas para tener unaidentificación completa.

En este medio crecen también bacilos gramnegativos que nopertenecen a la familia Enterobacteriaceae como Pseudomonas yAeromonas. Así mismo pueden desarrollarse algunas colonias deEnterococcus faecalis (enterococos) y estafilococos.

El Agar MacConkey sin sal y sin cristal violeta, puede usarse en ladiferenciación de las especies Mycobacterium fortuitum y Mycobacteriumchelonae.

Microorganismo Cepa Características de las colonias

Escherichia coli ATCC 25922 De rojas a rosadas. No son mucoides.Pueden rodearse de un precipitado opacode sales biliares.

Proteus mirabilis ATCC 12453 Incoloras y transparentes (puedeobservarse un patrón de swarming).

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Incoloras, trasparentes o ambarinas.

Shigella flexneri ATCC 12022 o9199

Incoloras, transparentes o rosa muytenue.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento inhibido o coloniaspuntiformes, rosa pálido, opacas yescasas.

Enterococus faecalis ATCC 29212 Crecimiento inhibido o colonias escasas,puntiformes, rojas opacas y con un haloclaro como de 1 mm de diámetroalrededor de la colonia.

26

Agar EMB

Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento demicroorganismos entéricos gramnegativos de diversas muestras.

En 1904, Endo (11) desarrolla un medio de cultivo para elaislamiento de bacilos causantes de la fiebre tifoidea en heces, este mediofue utilizado por muchos años. Según Holt-Harris y Teague,consideraron como principal desventaja que en el Agar de Endo lascolonias de coliformes desarrollaban un color rojo el cual se difundía através del medio y cuando se presentaba un desarrollo abundante deestas, se enmascaraba el crecimiento de las colonias incoloras (nofermentadores de la lactosa), impidiendo su identificación. En 1916 estosdos científicos reportan el desarrollo de un nuevo medio en el cual seincorporan los colorantes: eosina Y y azul de metileno, su adiciónpermitió la diferenciación entre las bacterias fermentadoras y las nofermentadoras, eliminando la difusión del colorante a través del agar.

La formulación original del Agar EMB de Holt-Harris y Taegue fuemodificada por Levine en 1918. Levine simplifica la fórmula originaladicionando una peptona simple y fosfato dipotásico como soluciónamortiguadora, eliminando la sacarosa e incrementando la concentraciónde lactosa. La concentración de azul de metileno fue reducidaincrementando la pureza del colorante.

El medio Levine EMB se ha convertido en el medio predominantepara el aislamiento de enterobacterias que emplea colorantes comoagentes selectivos, estos colorantes también juegan un papel en ladiferenciación de las bacterias fermentadoras de la lactosa y los nofermentadores. Los microorganismos fermentadores de la lactosa sevisualizan como colonias azules a negras, mientras que las nofermentadoras como Salmonella y Shigella dan colonias incoloras aambarinas y transparentes. Suelen crecer algunas bacteriasgrampositivas como enterococos, estafilococos y algunas levaduras,formando colonias puntiformes. Ciertas bacterias patógenas nofermentadoras de lactosa se pueden desarrollar en este medio y debendistinguirse por pruebas bioquímicas adicionales.

27

Fórmula

Fórmula aproximada para 1 L.

Peptona de gelatina 10.0 gLactosa 10.0 gFosfato dipotásico 2.0 gAgar 15.0 gEosina Y 400 mgAzul de metileno 65 mgSolución a 25 ºC pH 7.1 ± 0.2

Usos

Además de emplearse en Microbiología médica, se utiliza en lastécnicas recomendadas por la Sociedad Americana de Bacteriólogos, en elanálisis microbiológico de productos lácteos, aguas y alimentosdestinados al consumo humano. Así como pruebas de límite microbiano.

Inoculación

El espécimen puede sembrarse directamente en la placa por estríasuperficial, incubar a 35 ± 2 ºC durante 18 a 24 h, protegida de la luz.En caso negativo después de 24 h reincubar por 24 h adicionales.

Medios Alternos

Se recomiendan los siguientes medios que pueden ser óptimos parala recuperación de enterobacterias:

Agar MacConkey Agar SS Agar Tergitol 7 Agar XLD Agar Entérico Hektoen Agar Verde brillante, entre otros.

28

Resultados

Las bacterias que producen ácidos fuertes forman colonias quetienen un brillo metálico, esta aparición es debido a la precipitación delcolorante en las colonias típicas de Escherichia coli. Los fermentadoresdébiles, incluyendo Klebsiella sp. y Enterobacter sp. producen coloniasgrandes de 4 a 6 mm de diámetro, elevadas y mucoides con tendencia aunirse, usualmente no presentan brillo metálico, a la luz transmitidamuestran un centro azul-negro de azul a negro sin brillo metálico. Los nofermentadores de lactosa, incluyendo Proteus sp., Salmonella sp. yShigella sp. producen colonias incoloras y transparentes.

En este medio también es posible la identificación rápida deCandida albicans. Después de 24 a 48 h de incubación en atmósfera deun 10% de CO2 a 35 – 36 ºC y a veces se logra aislar a Nocardia sp.

Tabla 3Interpretación en Agar EMB

Escherichia coli ATCC 25922 Elevadas o ligeramente convexas. De 2 a 3mm de diámetro. Presentan a la luztransmitida un centro azul-negro y brillometálico azul verdoso a la luz reflejada.Algunas cepas no muestran brillo metálico.

Candida albicans ATCC 10231 Pueden presentar colonias rosa pálidoplumosas semejantes a telarañas (atípicas).

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento parcialmente inhibido o coloniaspuntiformes incoloras.

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Crecimiento parcialmente inhibido o coloniaspuntiformes incoloras.

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias incoloras a ambarinas,transparentes.

Shigella flexneri ATCC 12022o 9199

Colonias incoloras a ambarinas,transparentes

Proteus vulgaris ATCC 9484 Cuando no hay “swarming” semejantes aSalmonella y Shigella, incoloras.


29

Limitaciones

Aunque es un medio selectivo para bacilos gramnegativos entéricos,se recomienda realizar las pruebas bioquímicas para tener unaidentificación completa.

En este medio crecen también colonias de Enterococcus faecalis(enterococos) y estafilococos, así como levaduras, por lo que es necesariotener en cuenta las características específicas de cada una de lascolonias.

30

Agar Salmonella y Shigella

El agar Salmonella y Shigella es un medio moderadamente selectivoy medianamente diferencial para el aislamiento de bacilos entéricospatógenos especialmente los que pertenecen al género Salmonella.Aunque este medio no es recomendable para realizar aislamientosprimarios de Shigella ya que hay cepas más exigentes que crecen poco onada.

El agar Salmonella y Shigella (11) es señalado comomoderadamente selectivo por el grado de inhibición de losmicroorganismos grampositivos estos son inhibidos por la granconcentración de sales biliares, los citratos y el verde brillante. Ladiferenciación de los microorganismos entéricos se logra por la adición dela lactosa al medio. Los organismos que fermentan la lactosa producenácido, en la presencia de indicador rojo neutro, obteniéndose coloniasrojas. Los no fermentadores de la lactosa forman colonias incoloras otransparentes. El último grupo incluye a la mayoría de los patógenosintestinales, la Salmonella y Shigella forman parte de este. El tiosulfatode sodio y el citrato férrico permiten la detección de sulfuro de hidrógenoproducido, observándose colonias con centros negros.

Fórmula


Extracto de carne 5.0 gMezcla de peptonas 3.0 gLactosa 10.0 gMezcla de sales biliares 8.5 gCitrato de sodio 8.5 gTiosulfato de sodio 8.5 gCitrato férrico 1.0 gAgar 13.5 gRojo neutro 25.0 gVerde brillante 0.33 mgSolución a 25 ºC pH 7.0 ± 0.2

Usos

Este medio es empleado en Bacteriología sanitaria para aislarSalmonella sp. y Shigella sp. a partir de heces, orina y alimentos diversos,tanto frescos como enlatados, análisis de agua potable y residuales.

31

Inoculación

Debido a su gran poder de inhibición, este medio puede sembrarsecon una buena cantidad del material en estudio, directamente en laplaca por estría superficial a 35 ± 2 ºC de 18 a 24 h protegida de la luz.

Medios Alternos

Se recomiendan los siguientes medios que pueden ser óptimos parala recuperación de enterobacterias:

Agar MacConkey Agar Tergitol 7 Agar XLD Agar Entérico Hektoen Agar de Desoxicolato, entre otros.

Resultados

Las bacterias no fermentadoras de la lactosa (presuntamentepatógenas) dan colonias claras, transparentes e incoloras, en cambio loscoliformes que son bastante inhibidos, forman colonias pequeñas quevarían del rosa al rojo. Tal es el caso de la Enterobacter y Klebsiella quepresentan colonias de crema pálida a roja, siendo mucosas y de mayortamaño que las de Escherichia coli. Algunas cepas de Salmonella arizonaeson fermentadoras de la lactosa y pueden simular E. coli.

Las bacterias formadoras de sulfuros dan colonias que presentanun centro negro y un halo claro alrededor como Proteus (no se observaswarming) y algunas especies de Salmonella.

En la siguiente tabla se describen las características específicas delas colonias de algunas cepas de referencia.

32

Tabla 4Interpretación en Agar Salmonella y Shigella

Limitaciones

Debido a que es un medio con un alto nivel de inhibición, algunascepas de Shigella no crecen en Agar Salmonella-Shigella, por lo cual no esrecomendado para el aislamiento primario de Shigella, el mediorecomendado par a este aislamiento es Agar Entérico de Hektoen y XLD.

Nota: Este medio no requiere esterilización, durante su preparación


Shigella flexneri ATCC 12022 o 9199 Colonias pequeñas, incolorastransparentes.

Escherichia coli ATCC 25922 Marcada inhibición o coloniaspequeñas rosa intenso a rojo, conhalo de precipitación.

Salmonella typhi ATCC 19430 Colonias pequeñas, incolorastransparentes con o sin centronegro.

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias medianas, incoloras ytransparentes, con un centro negrosi producen H2S.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento inhibido.

33

Agar Verde Brillante

El agar Verde Brillante (11) fue descrito por primera vez porKristensen y colaboradores en 1925. En 1935 Kauffmann modifica laformulación. Este medio se clasifica como un medio altamente selectivopara la recuperación de Salmonella con la excepción de la fiebre tifoidea yparatifoidea.

Se incluye en la USP. para su uso en el ejercicio de límitemicrobiano.

El colorante verde brillante inhibe las bacterias grampositivas y lamayoría de los bacilos gramnegativos, el rojo fenol sirve como unindicador de pH, cuando la lactosa y la sacarosa son fermentadas sedetecta la producción del ácido por un cambio de coloración en el medio,a un color amarillo.

Fórmula


Usos

Medio altamente selectivo empleado para aislar Salmonella (exceptoS. typhi y Shigella), de heces, orina, leche y productos lácteos y de otrosalimentos de importancia sanitaria.

Mezcla de peptonas 10.0 gExtracto de levadura 3.0 gLactosa 10.0 gSacarosa 10.0 gCloruro de sodio 5.0 gAgar 20.0 gRojo fenol 0,08 gVerde brillante 12.5 mgSolución a 25 ºC pH 6.9 ± 0.2

34

Inoculación

Debido a que es un medio fuertemente inhibidor, se recomiendainocular las placas con una asada bien cargada con el material enestudio. Cuando se sospecha que el material en estudio contiene bajasconcentraciones de Salmonella es necesario inocular la muestrainicialmente en Caldo tetrationato o Caldo selenito-cistina, para suenriquecimiento.

Sembrar el medio de cultivo con la muestra de ensayo por estríacruzada. Incubar a 35 ± 2 ºC de 24 a 48 h protegido de la luz. En casonegativo después de 24 h, reincubar por 24 h más.

Medios Alternos

Paralelamente se recomienda sembrar en otros medios selectivosmenos inhibidores como:

Agar Desoxicolato SS XLD MacConkey EMB Agar Tergitol 7 Agar Entérico de Hektoen

Resultados

El medio presenta una coloración marrón verdoso al principio, pasaa rojo durante la incubación a 35 ± 2 ºC, los microorganismos quedegradan la lactosa son inhibidos completamente, presentando algunasde las cepas no inhibidas, colonias verde amarillentas, opacas yrodeadas de un halo amarillento. Los microorganismos lactosa negativoscomo Salmonella y ocasionalmente Proteus forman colonias de color rosapálido transparentes y rodeadas de un halo rojo brillante, algunascolonias de Proteus se observan rojas.

35

Tabla 5Interpretación en Agar Verde Brillante

Microorganismos Cepa Características de las colonias

Escherichia coli ATCC 25922 Colonias de color amarillo – amarillo verdoso,rodeado de una zona de color amarillo –verde.

Salmonella enteritidis ATCC 13076 Colonias de color blanco – rojo, opacas yrodeadas por una zona roja.

Salmonella typhi ATCC 19430 No hay crecimiento.

Salmonellatyphimurium

ATCC 14028 Colonias de color blanco – rojo, opacas yrodeadas por una zona roja.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 No hay crecimiento.

Limitaciones

Debido a que es un medio altamente selectivo para salmonellas suuso se limita a esta especie.

36

2.3 Medios empleados para aislamiento de bacteriasGrampositivas

Agar para Estafilococos No.110

Este medio es empleado por ser altamente selectivo para elaislamiento y diferenciación de estafilococos. Se fundamenta en lafermentación del manitol y la actividad de la gelatinasa.

En 1935 Store describe a estafilococos que dan positiva a la pruebade gelatinasa. Chapman y colaboradores, reportan que la especiepatogénica de estafilococos fermenta el manitol, formando pigmentos yproducen gelatinasa (11).

En 1945 Chapman propone adicionar a el Agar rojo fenol y manitoluna concentración de 7.5% de NaCl para hacer un medio de aislamientoselectivo para esta especie de estafilococos. En estudios posterioresChapman desarrolla en medio Agar Estafilococos No.110, este medio esrecomendado para el aislamiento selectivo de estafilococos patógenos.

El agar S-110 contiene peptona como fuente, nitrógeno, vitaminas yminerales, el extracto de levadura suministra las vitaminas del complejoB, las cuales estimulan el crecimiento bacteriano. El cloruro de sodio enaltas concentraciones inhibe otras bacterias. La lactosa y el D-manitolson la fuente de carbohidratos. La gelatina es adicionada para la pruebade licuefacción y el agar es el agente solidificante.

Los estafilococos patógenos coagulasa positivo resisten las altasconcentraciones de sales y forman colonias con una pigmentación que vadel amarillo al anaranjado. Estos microorganismos son fermentadoresdel manitol y producen ácido, licuan la gelatina produciendo zonas clarasalrededor de las colonias.

37

Fórmula


Usos

Para el aislamiento selectivo de cepas de estafilococos a partir dediversas muestras clínicas como procesos purulentos, casos deneumonía, meningitis, forunculosis, uretritis, vaginitis etc. También seemplea este medio para aislar estafilococos que contaminan alimentosdiversos y que producen intoxicaciones alimentarias (12).

Inoculación

Sembrar el medio de cultivo con la muestra de ensayo por estríacruzada. Incubar a 35 ± 2 ºC de 24 – 48 h protegiéndolo de la luz.

Medios Alternos

Agar Sal y Manitol Agar Vogel Johnson Base de Agar Baird-Parker Existen reportados cerca de 20 medios para el aislamiento de

estafilococos (13).

Resultados

Observar la fermentación del manitol, remover la colonia del medioy adicionar una gota de azul de Bromotimol al 0.04% en el área donde la

Peptona de caseína 10.0 gExtracto de levadura 2.5 gGelatina 30.0 g

Lactosa 2.0 gD-Manitol 10.0 gCloruro de Sodio 75.0 gFosfato dipotásico 5.0 g

Agar 15.0 gSolución a 25 ºC pH 7.0 ± 0.2

38

colonia fue removida. Observar la formación del color amarillo (reacciónpositiva).

Observar la reacción de la gelatinasa, cubrir la placa con 5 mL desolución de sulfato de amonio e incubar por 12 minutos para apreciar lahidrólisis de la gelatina. Observar las zonas claras alrededor de lascolonias (Reacción de Stone).

Tabla 6Interpretación en Agar Estafilococos No. 110

Microorganismos Cepa Características de las colonias

Escherichia coli ATCC 25922 Crecimiento inhibido.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Colonias amarillas – anaranjadas, fermentanla lactosa y presentan hidrólisis de lagelatina.

Staphylococcusepidermidis

ATCC 12228 Colonias blancas – crema, no fermentan lalactosa y la hidrólisis de la gelatina es lenta.

Limitaciones

El Enterococcus faecalis puede desarrollarse en este medioformando colonias muy pequeñas que fermentan el manitol. Paradiferenciar estos microorganismos de los estafilococos se debe realizar latinción de Gram y la prueba de catalasa.

La producción de pigmento no es un criterio confiable para ladiferenciación de las especies de estafilococos.

Si se tiene sospecha de estafilococos, se debe realizar un subcultivoen caldo nutritivo, agar sangre, caldo BHI o caldo de fosfato triptosa yobtener la muestra necesaria para poder realizar la prueba de coagulasa,si se obtiene el cultivo del agar Estafilococos-110 puede interferir con losresultados, debido al alto contenido de sal.

39

Agar Sal Manitol

Medio selectivo empleado para aislamiento de estafilococos a partirde diversas muestras.

En 1942 Koch reporta que los estafilococos crecen solo en mediosde cultivo que contienen de cloruro de sodio 7.5%. Chapman estudió conmás detenimiento y concluyó que la adición de cloruro de sodio al 7.5% alAgar Rojo fenol y manitol mejora el aislamiento de estafilococos coagulasapositiva, este medio es considerado como un medio selectivo para elaislamiento de estafilococos coagulasa positivos (11).

El agar Sal manitol es un considerado como medio selectivo ynutritivo, debido a su contenido de peptonas y extracto de carne queproporciona factores de crecimiento esenciales como: el nitrógeno,carbono, azufre y oligoelementos. La elevada concentración de cloruro desodio inhibe a la mayoría de las bacterias que son halo-sensibles yfavorecen a los estafilococos halo-resistentes. La fermentación delmanitol, se observa por un cambio en el indicador rojo fenol, conproducción de ácido cambia el color del medio, de rosado a amarillo.

Fórmula


Peptona 10.0 gExtracto de carne 1.0 gD-manitol 10.0 gCloruro de sodio 75.0 gAgar 13.5 gRojo fenol 25.0 mgSolución a 25 ºC pH 7.0 ± 0.2

Usos

Medio empleado para aislar estafilococos patógenos de materialesclínicos (orina, genitales, heridas, exudados faríngeos y otros). Se empleaen la industria alimenticia de productos lácteos, cárnicos y conservas depescado. También se utiliza en la industria cosmética y la USP.recomienda su uso para las pruebas de límite microbiano (12).

40

Inoculación

El espécimen puede sembrarse directamente en la placa por estríasuperficial, incubar a 35 ± 2 ºC de 18 a 24 h protegiéndolo de la luz.

Aunque también se recomienda una siembra masiva del material deestudio y esperar la incubación hasta unas 36 h. En una atmósferaaeróbica.

Medios Alternos

Se recomienda como medios alternativos para el aislamiento deStaphylococcus aureus los medios:

Agar Vogel Johnson Agar Estafilococos –110 Base de Agar Baird – Parker entre otros.

Resultados

La formación de colonias de estafilococos no patógenos es detamaño pequeño rodeada de una zona roja. Los estafilococos patógenosproducen ácido del manitol, desarrollan colonias más grandes rodeadasde una zona amarilla.

Si se agrega a cada litro de medio, una yema de huevo encondiciones de esterilidad, los estafilococos, que además de fermentar elmanitol producen lipasa, darán un precipitado amarillento de ácidosgrasos alrededor de la colonia. Este fenómeno comprueba la propiedad decoagular el plasma que presentan los estafilococos patógenos coagulasapositivos.

Los micrococos se desarrollan en este medio y se observan comocolonias grandes de color blanco – naranja. Los estreptococospresentan crecimiento inhibido.

41

Tabla 7Interpretación en Agar Sal Manitol

Limitaciones

Debido a que es un medio altamente selectivo para estafilococos, suuso es limitado y específico.


Escherichia coli ATCC 25922 Crecimiento inhibido.

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Crecimiento inhibido.

Proteus mirabilis ATCC 12453 Inhibición parcial.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Colonias con pigmento amarillocaracterístico y halo de color amarillo(manitol positivo) pequeñas a grandes.

Staphylococcusepidermidis

ATCC 12228 Colonias blancas, sin halo amarillo(manitol negativo).

42

2.4 Medio de apoyo

Agar Nutritivo

A principios del siglo XX, la American Public Health Associationpublica la fórmula de este medio de uso general que permite elcrecimiento de una gran variedad de microorganismos poco exigentes.Este fue reconocido como un medio estandarizado para el uso del análisisde agua potable y aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos.Esta fórmula relativamente simple ha sido reconocida con el nombre deAgar Nutritivo y se emplea en el laboratorio para el cultivo ymantenimiento de especies no exigentes (12).

Esta fórmula relativamente simple proporciona los nutrientesnecesarios para el crecimiento de varios microorganismos. El extracto decarne contiene: carbohidratos, vitaminas, nitrógeno y sales. Laspeptonas son la principal fuente de nitrógeno orgánico, particularmentede aminoácidos y péptidos de cadenas largas. El agar es el agentesolidificante.

Fórmula


Peptona 5.0 gExtracto de carne 3.0 gAgar 15.0 gSolución a 25 ºC pH 6.8 ± 0.2

Usos

Medio utilizado para el cultivo de microorganismos poco exigentes.Se emplea en bacteriología sanitaria (para el recuento de bacterias enagua potable y agua residuales), bacteriología médica e industrial (lechey otros alimentos), en pruebas de esterilidad y para multiplicarmicroorganismos en la producción de vacunas y antígenos. También seemplea como base para preparar medios de cultivo más ricos adicionadoscon otros nutrientes específicos. Lo mismo que en pruebas bioquímicas,por ejemplo indol - descarboxilasa y lisina – descarboxilasa (12).

43

Inoculación

En tubo inclinado es utilizado para el cultivo primario ymantenimiento de cultivos puros.

El espécimen puede sembrarse directamente en la placa porsiembra masiva o por estría superficial, incubar a 35 ± 2 ºC de 18 a 48 hprotegido de la luz.

Medios Alternos

Sin sugerencias.

Resultados

Tabla 8Interpretación en Agar Nutritivo

Limitaciones

Únicamente puede emplearse para mantenimiento y cultivo demicroorganismos poco exigentes.


Escherichia coli ATCC 25922 Colonias grandes, crema brillante y lisas.

Enterococcus faecalis ATCC 1943329212

Colonias pequeñas, crema opacas y lisas.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Colonias grandes ligeramente amarillas,brillantes y lisas.

44

2.5 Medios de enriquecimiento y selectivos

Agar Base Sangre

El Agar base sangre con la adición de sangre estéril desfibrinada,es un medio empleado para el aislamiento primario (11), cultivo ydetección de la actividad hemolítica de los estreptococos y otrosmicroorganismos exigentes (bacilos tuberculosos).

Este medio se ha empleado como una base para la preparación deagar sangre. En un estudio de la viabilidad de los estreptococos, Snavelyy Brahier realizaron estudios comparativos con sangre de caballo, conejoy carnero en agar base sangre y encontraron que la sangre de carnerotiene las mejores características de hemólisis, las colonias son claras ymás confiables en 24 y 48 h. En el curso de la investigación, alrededor de1,300 aislamientos de estreptococos fueron hechos con agar base sangrey 5% de sangre de carnero desfibrinada.

El agar base sangre es un medio nutritivo en donde; las peptonas,la infusión de músculo cardiaco, caseína y el extracto de levadura,proporcionan las fuentes de nitrógeno, carbono, aminoácidos y vitaminas,contiene cloruro de sodio para mantener el equilibrio osmótico y el agares el agente solidificante. El suplemento con sangre (5 – 10%)desfibrinada provee de factores de crecimiento para microorganismosexigentes, y es la base para la determinación de reacciones hemolíticas.Las concentraciones de sangre menores producen reacciones hemolíticasdifíciles de distinguir, en tanto que las mayores pueden ocultartotalmente la hemólisis. La actividad hemolítica puede variar por lasangre de animal utilizado y la base del medio empleado (11).

Las siguientes fórmulas son empleadas para la preparación delAgar sangre en agares comerciales, dependiendo de los laboratorios quelos distribuyan (13).

45

Fórmula

Agar Sangre


Peptona de caseína 15.0 gPeptona de soya 5.0 gCloruro de sodio 5.0 gAgar 15.0 gSangre de carnero desfibrinada 50.0 mLSolución a 25 ºC pH 7.6 ± 0.2

Base de agar sangre


Peptona 10.0 gExtracto de carne 10.0 gCloruro de sodio 5.0 gAgar 15.0 gSangre de carnero desfibrinada 50.0 mLSolución a 25 ºC pH 7.3 ± 0.2

Agar Sangre No. 2


Proteosa peptona 15.0 gInfusión de hígado 2.5 gExtracto de levadura 5.0 gCloruro de sodio 5.0 gAgar 12.0 gSolución a 25 ºC pH 7.4 ± 0.2

46

Base de agar sangre (Agar Infusión)


Infusión de músculo cardiaco 2.0 gPeptona de caseína 13.0 gExtracto de levadura 5.0 gCloruro de sodio 5.0 gAgar 15.0 gSolución a 25 ºC pH 7.3 ± 0.2

Agar Infusión (FDA medio M21)


Infusión de músculo cardiaco 375.0 gPeptona de carne 10.0 gCloruro de sodio 5.0 gAgar 15.0 gSolución a 25 ºC pH 7.3 ± 0.2

Usos

Este medio de cultivo adicionado de sangre de carnero desfibrinadaestéril es adecuado para el aislamiento de bacterias exigentes a partir dediversas muestras e investigar su actividad hemolítica.

Inoculación

Sembrar las placas sobre la superficie del medio de cultivo porestría cruzada y picadura sobre las estrías, lo que permite observar conmayor claridad la actividad hemolítica como resultado de la acciónbacteriana. Incubar a 36 ºC ± 2 de 24 a 48 h protegido de la luz.

Medios Alternos

Base de Agar Sangre con bajo pH, es un agar con un pH de6.8, adicionado con 1% de glicerol y de un 15 – 20% desangre desfibrinada proporciona un medio excelente para el

47

aislamiento de neumococos, gonococos, meningococos.También está indicado para estudiar reacciones de hemólisis.

Para el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis, la base deagar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre humana y100 unidades por mililitro ha sido empleada con buenosresultados.

Base de Agar Sangre con azida, es un medio selectivo paraaislar estreptococos y estafilococos. Puede ser usado solo ocon adición de sangre de carnero desfibrinada (5%) paraestudiar simultáneamente las reacciones hemolíticas, estemedio puede usarse para la preparación de cultivos primariosen placa, para descubrir y aislar estreptococos y estafilococosen aguas de drenaje, aguas de albercas, alimentos y otrasfuentes con flora mixta. La azida sódica inhibe losmicroorganismos gramnegativos.

Resultados

Después de 18 a 24 h de incubación, las colonias de estreptococosdel grupo A tienen aproximadamente 0.5 mm de diámetro, sontranslúcidas o transparentes y tienen una superficie lisa o mate. El halode -hemólisis es habitualmente igual a 2 – 4 veces el diámetro de lacolonia. Las colonias son convexas y con bordes enteros.

Los grupos C y G tienen un aspecto similar, aunque las colonias dealgunas cepas del grupo G pueden tener una coloración dorada, los halosde hemólisis son muy grandes.

Los estreptococos grupo B forman colonias más grandes, el halo dehemólisis es comparativamente menor para los estreptococos grupo B quepara los demás estreptococos -hemolíticos, y la hemólisis es en generalmás débil y menos evidente. Una proporción importante de estreptococosgrupo B (11 % aproximadamente) pueden ser no hemolíticos.

Las colonias del grupo D tienden a ser más grandes de 0.5 –1.0 mmDespués de 12 h de incubación, son -hemolíticos o no hemolíticos. Lascolonias son grises, lisas y con bordes enteros.

48

Los estreptococos del grupo F forman colonias muy pequeñas enpunta de alfiler con un gran halo de -hemólisis. Estas coloniasextremadamente pequeñas de denominan colonias diminutas.

Streptococcus pneumoniae presenta diferentes tipos de colonias, cuyoaspecto depende del grado de capsulación. Estas colonias se encuentranen general rodeadas por un gran halo de -hemólisis intensamente verde.Las colonias de cepas con grandes cápsulas pueden tener variosmilímetros de diámetro, son de aspecto mucoides, grisáceo y puedenparecerse a gotas de aceite sobre la superficie del agar. Las colonias decepas con cápsulas más pequeñas son más chicas. Por incubaciónprolongada, la zona central de la colonia puede colapsarse y adoptar lacaracterística forma de “ficha de damas”, algunas pueden colapsarse ensu totalidad y aparecerán como “la cabeza de una tachuela” sobre lasuperficie del agar.

Tabla 9Interpretación en Base de agar sangre


Streptococcuspyogenes

ATCC 19615 o 12375 Ccolonias grisáceas, translucidas-opacas, pequeñas (1mm), o coloniasmate, mucoides (2 – 4mm) rodeada por

una zona de - hemólisis.Streptococcuspneumoniae

ATCC 6305 o 6301 Colonias planas, lisas, translucidas -grisáceas y pueden ser mucosas,rodeada por una zona de -hemólisis.

Staphylococcusaureus

ATCC 25923 Colonias cremosas opacas, de blanco -amarillo dorado con o sin una zona de-hemólisis.

Haemophilusinfluenzae

ATCC 19418 No hay desarrollo.

49

Tabla 10Identificación de la hemólisis (7).

Limitaciones

Las colonias de Haemophilus haemolyticus son β-hemolíticos en agar sangre de caballo y agar sangre de conejo, en ambos se distinguenlas colonias de estreptococos β-hemolíticos. Debido a que la sangre de carnero es deficiente en nucleótidos de piridina y no soporta elcrecimiento de esta especie bacteriana.

Observaciones

La sangre humana (de bancos de sangre) deben evitarse por losefectos posibles: antibióticos, anticuerpos (antiestreptolisina) yanticoagulantes, los cuales pueden causar inhibición total o parcial de losmicroorganismos aislados.

Se recomienda el uso de sangre desfibrinada ya que el empleo de lasangre no coagulada por el uso de citrato como anticoagulante, puedeinhibir a los estreptococos.

Tipo dehemólisis

Características

Lisis parcial de los eritrocitos que rodean una colonia,produciendo un cambio de color gris verdoso o amarronado delmedio de cultivo.

Lisis completa de los glóbulos rojos que rodean una colonia,produciendo la eliminación total de la sangre del medio de cultivo.

Ausencia de hemólisis y en consecuencia, no se observa alteracióndel color del medio que rodea a una colonia. Los microorganismosque no producen hemólisis se denominan habitualmente “nohemolíticos”.

Un pequeño halo de eritrocitos intactos, adyacentes a la colonia,con un halo de hemólisis completa que rodea el halo de eritrocitos

intactos. Este tipo de hemólisis puede confundirse con la –hemólisis. Se denomina también – hemólisis de halo amplio.

50

Agar Chocolate

Es un medio desarrollado para el aislamiento y cultivo demicroorganismos exigentes, especialmente del género de Neisseria yHaemophilus así como de otras especies, las cuales no se desarrollan enagar sangre de carnero.

El agar chocolate mantiene el mismo principio que el agar sangreexcepto que durante la preparación los glóbulos rojos son lisados cuandose agrega el agar base fundido. Esta lisis libera nutrientes intracelularescomo hemoglobina, y otros factores para ser utilizadas por las bacteriasexigentes. La lisis de los glóbulos rojos otorga al medio un color castaño-chocolate que da su nombre a este agar.

Carpenter y Morton describen un medio mejorado para elaislamiento de los gonococos en 24 h (11). La eficiencia de este medio,Agar GC con un suplemento de hemoglobina y concentrado de levadura,fue demostrado en un estudio de doce medios hasta entonces usadospara el aislamiento de los microorganismos. El medio fue mejorado alremplazar el concentrado de levadura con un aditivo químicoIsoVitale®3 (BBL Microbiology Systems, MD) y Supplement B ® (DifcoLaboratories, MI), definido químicamente como un suplemento que proveedel factor V (la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido o NAD),vitaminas (B12, clorhidrato de tiamina) coenzimas, dextrosa, minerales(hierro, magnesio) y otros factores (cisteína y glutamina), especiales parael desarrollo de Neisseria gonorrhoeae.

La Base de Agar contiene nutrientes nitrogenados en la forma decaseína y peptona de carne, solución amortiguadora de fosfatos quemantienen la estabilidad del pH y almidón de maíz, el cual neutraliza losácidos grasos tóxicos que puede presentarse en el agar. La hemoglobinaes la fuente del factor “X” (hemina) necesario para el desarrollo deespecies de Haemophilus. Y los aditivos de polienriquecimiento semencionaron con anterioridad.

Existen varias fórmulas de base de agar para la preparación delAgar chocolate se enlistan algunas de ellas que pueden encontrarse enforma comercial (13).

3 ISOVITALE Y SUPPLEMENT B® son marcas registradas.

51

Fórmula

Agar Chocolate


Peptona proteosa No.3 15.0 gAgar 10.0 gCloruro de sodio 5.0 gFosfato dipotásico 4.0 gAlmidón de maíz 1.0 gFosfato monopotásico 1.0 gHemoglobina 100.0 mLSuplemento de enriquecimiento 10.0 mLSolución a 25 ºC pH 7.0 ± 0.2

Agar Chocolate enriquecido

Medio base GC 740.0 mLSolución de hemoglobina 250.0 mLSuplemento 10.0 mL

Medio base GC


Peptona proteosa No.3 15.0 gAgar 20.0 gCloruro de sodio 5.0 gFosfato dipotásico 4.0 gGlucosa 1.5 gAlmidón de maíz 1.0 gFosfato monopotásico 1.0 gSolución a 25 ºC pH 7.0 ± 0.2

52

Agar Chocolate II con Hemoglobina e Iso Vitale X®

Agar base GCII 990.0 mLIso Vitale X® 10.0 mL

Agar Base GCII


Agar 12.0 gHemoglobina 10.0 gCaseína pancreática 7.5 gPeptona de carne 7.5 gCloruro de sodio 5.0 gFosfato dipotásico 4.0 gAlmidón de maíz 1.0 gFosfato monopotásico 1.0 gSolución a 25 ºC pH 7.3 ± 0.2

Usos

Los medios de cultivo elaborados a partir de ésta base, se utilizanpara el aislamiento de bacterias de los géneros Neisseria, Haemophilus yGardnerella.

Inoculación

Sembrar en la superficie del medio de cultivo una zona pequeñamasivamente y a partir de ésta aislar por estría cruzada, en forma suavey ligera a fin de obtener colonias aisladas. Incubar en atmósfera parcialde CO2 (Técnica de la vela) a 35 ºC ± 2de 24 a 48 h protegido de la luz.

Medios Alternos

Los medios recomendados son: Agar de Thayer-Martín modificado (MTM)

53

Agar Martín-Lewis (ML) Agar NYC entre otros

Resultados

Una prueba que contribuye a identificar las colonias del géneroNeisseria consiste en demostrar la producción de oxidasas, vertiendounas gotas de solución al 0.5% de N:N: dimetilparafenilendiamina. Unareacción positiva se manifiesta por la aparición de una coloración rosadaque posteriormente se oscurece, dando lugar a la muerte de las bacteriasen la colonia.

Tabla 11Interpretación en Agar Chocolate

Limitaciones

En este medio no se pueden determinar las propiedades hemolíticasde H. haemolyticus y el H. parahaemolyticus, lo que elimina una formaimportante a través de la cual estos microorganismos puedendiferenciarse del H. influenzae. También se requiere experiencia paradiferenciar visualmente colonias de Haemphilus de otras bacterias quecrecen en cultivos mixtos.


Haemophilus influenzae ATCC 49247 Pequeñas (1mm), húmedas, perladas conolor característico.

Streptococcuspneumoniae

ATCC 6305 o6301

Buen desarrollo.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Pequeñas, blancas a grisáceas, mucoides.

54

Agar Mueller Hinton

En la década de 1960 en los laboratorios de Microbiología clínica seutilizaban una amplia variedad de procedimientos para la determinaciónde la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos y compuestosquimioterapéuticos, Kirby-Bauer y otros colaboradores desarrollaron unprocedimiento en el cual el Agar Mueller Hinton fue seleccionado como elmedio más apropiado. Un estudio posterior confirmó el valor de esteagar para el propósito requerido; la simplicidad de la fórmula, una buenareproducibilidad y el valor de los datos experimentales obtenidos lespermite emplearlo como medio de pruebas de susceptibilidad. El métodode Kirby-Bauer, es uno de los métodos que el CLSI (Clinical andLaboratory Standards Institute) recomienda para la determinación de lasensibilidad bacteriana a los antimicrobianos (11).

El procedimiento de Kirby-Bauer es recomendado para las pruebasde crecimiento rápido de bacterias patógenas aerobias y anaerobiasfacultativas tales como estafilococos, enterobacterias, bacilos aerobiosgramnegativos, por ejemplo Pseudomonas sp. y Acinetobacter sp., Vibriocholerae y enterococos. El procedimiento es modificado para especiesexigentes con sangre de carnero al 5%.

El hidrolizado ácido de la caseína y el extracto de carne suministranaminoácidos y otras sustancias nitrogenadas, minerales, vitaminas,carbono y otros nutrientes que permiten el crecimiento de losmicroorganismos. El almidón actúa como un coloide protector contrasustancias tóxicas que pueden estar presentes en el medio. La hidrólisisdel almidón durante el tiempo de esterilización en el autoclaveproporciona una pequeña cantidad de dextrosa, que es una fuente deenergía. El agar es el agente solidificante.

El procedimiento de Kirby–Bauer (14) se basa en la difusión a travésde un gel de agar de sustancias antimicrobianas que se impregnan endiscos de papel. En contraste con los métodos anteriores que empleabandiscos con concentraciones altas y bajas de antibióticos y seinterpretaban por la presencia o ausencia de zonas de inhibición. Laconcentración del antibiótico en la interface entre bacterias encrecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica yse aproxima a la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). Obtenida pormétodos de dilución.

55

En este método se utiliza una muestra del microorganismo, seaplica sobre toda la superficie del medio. Los discos impregnados de losantibióticos o agentes antimicrobianos se colocan en la superficie delmedio, tan pronto estos entran en contacto con la humedad del agar, elfiltro absorbe agua y el antibiótico difunde radialmente a través delespesor del agar a partir del disco, formándose un gradiente deconcentración. Transcurridas de 18 a 24 h de incubación, los discosaparecen rodeados por una zona de inhibición. La determinación de lasensibilidad, sensibilidad intermedia o la resistencia a un agente serealiza mediante la comparación de tamaños de zonas obtenidos a loscriterios de la CLSI M-100. En el trabajo de laboratorio de rutina losdiscos se adquieren comercialmente y el fabricante proporciona loscriterios para la lectura de los resultados.

Se han identificado a diversos factores que influyen en la difusióndel disco. Estos son el medio, el exceso de humedad en la superficie delmedio, la profundidad de agar, la potencia del disco, la concentración delinóculo, pH y la producción de -lactamasas.

Fórmula


Extracto de carne 2.0 gPeptona de caseína ácida 17.5 gAlmidón 1.5 gAgar 17.0 gSolución a 25 ºC. pH 7.3 ± 0.1

Usos

El agar Mueller Hinton es recomendado para pruebas desensibilidad a antibióticos de uso frecuente (antibiograma), el crecimientorápido de las bacterias en este medio fue originalmente desarrollado parael cultivo de microorganismos patógenos como Neisseria. Sin embargoeste microorganismo puede ser aislado con medios selectivos específicos(12).

56

Procedimiento

1. Preparar el medio de Mueller Hinton y depositaraproximadamente 25 mL del medio sobre las placas estérilesde 90 mm de diámetro (si las placas son de mayor diámetro,calcular el volumen necesario para obtener un grosor del agarde 4 mm aproximadamente). Las placas pueden guardarse enrefrigeración hasta su uso evitando en lo posible almacenenagua de condensación.

2. Recoger con una asa bacteriológica 3 a 5 colonias iguales de laplaca de cultivo de 18 a 24 h de incubación y sembrarlas en 5mL de medio líquido (Infusión cerebro corazón, Caldo ToddHewitt, Caldo soya tripticasa, etc.) e incubar a 35 ºC durante 2a 6 h, hasta conseguir o superar una turbidez del 0.5 de laescala de MacFarland4, si la turbidez es superior, se realiza elajuste necesario con solución salina estéril.

3. Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado elinóculo, introducir un hisopo de algodón estéril dentro de lasuspensión y al retirarlo rotar varias veces contra la pared deltubo por encima del nivel del líquido con la finalidad deeliminar el exceso de inóculo.

4. Inocular las placas de agar Muller Hinton completamente sindejar ninguna zona libre. Esto se consigue deslizando elhisopo por la superficie del agar tres veces, rotando la placaunos 60º cada vez y pasándola por último por la periferia delagar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a5 minutos antes de colocar los discos.

5. Colocar los discos5 con dispensadores o manualmente conpinzas estériles. Es necesario asegurarse de hacer un contactocompleto con la superficie del medio, por lo que debenpresionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No debencolocarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y debendistribuirse de forma que no se produzca superposición de loshalos de inhibición.

6. Antes de transcurrir 15 minutos de la aplicación del discoinvertir la placa e incubar a 35 ºC

7. Revisar las placas después de 16 –18 h de incubación.

4 ver anexo 35 La FDA recomienda las siguientes especificaciones para los discos: deben medir 6.5 ± 0.5 mm de diámetro y elpeso del papel debe ser de 30 mg ± 4 cm2.

57

Medios Alternos

Sin sugerencias.

Resultados

Después de 18 h de incubación leer el diámetro de las zonascompletas de inhibición con una regla. Las zonas de los mediostransparente se miden sobre el reverso de la placa y los medios quecontienen sangre, sobre la superficie del agar.

Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibición, puedetratarse de mutantes resistentes, contaminaciones, poblacionesheterogéneas o cultivos mixtos y conviene volver a identificarlas y realizarotra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana.

Comparando los diámetros del halo de inhibición con las CMIs yestableciendo las correspondientes rectas de regresión, se han fijado unoscriterios para clasificar las cepas estudiadas. De esta forma se han fijadotres categorías: Sensible (S), Intermedia (I) y Resistente (R).

Las interpretaciones están establecidas por el CLSI, pero por reglageneral, un diámetro de inhibición de 30–35 mm es indicativo de unacepa altamente sensible mientras que diámetros de zona de inhibicióninferiores a 15 mm son los que presentan las cepas resistentes.

58

Tabla 12Clasificación de la sensibilidad de los halos de inhibición

Limitaciones

Un gran número de factores pueden afectar los resultados: eltamaño del inóculo, la tasa de crecimiento del microorganismo, laformulación del medio, el pH, el contenido del disco y el tipo de fármaco,el tiempo de incubación, la velocidad de difusión y la lectura del puntofinal. Por lo tanto es indispensable se realice el método señalado por elfabricante del medio y de los discos.

Es recomendable utilizar el método de suspensión directa decolonias para el estudio de microorganismo de crecimiento difícil enmedios líquidos (Haemophilus sp., Neisseria sp. y estreptococos) y enestafilococos en los que se requiera detectar la resistencia a oxacilina.

Clasificación Resultados

Sensible Indica que la infección ocasionada por la cepa para la que seha determinado la CMI o su correspondiente halo deinhibición puede tratarse de forma adecuada empleando lasdosis habituales del antimicrobiano.

Intermedio Indica que el halo traducido en valores de CMI se aproxima alas concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangrey que puede esperarse eficacia clínica en aquellaslocalizaciones en que se alcanzan altas concentraciones deantimicrobiano o cuando se emplean dosis más elevadas de lohabitual.

Resistente Aquellos microorganismos que no se inhiben por lasconcentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidosdel correspondiente antimicrobiano, o aquellosmicroorganismos en los que existen mecanismos deresistencia específicos para el agente estudiado.

59

Agar Leche

El agar Leche es recomendado por la British Standards Institutepara el recuento de microorganismo en la leche líquida, helados, leche enpolvo y suero (11).

La leche líquida es un alimento altamente perecedero con una vidaútil de sólo 5 -10 días Después de la pasteurización. La contaminaciónpuede surgir por diversos factores, la suciedad o las ubres enfermas delos bovinos, inadecuada limpieza en el ordeño y equipos dealmacenamiento.

La mastitis o inflamación de la ubre puede causar contaminacióncon Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichiacoli o más raramente, Yersinia enterocolitica y Leptospira especie. Laexcreción de estos organismos puede aumentar la leche a granel hasta enuna cuenta de 105 organismos/mL.

La limpieza deficiente de las instalaciones de ordeño puede causarcontaminación con micrococos, estreptococos, coliformes o cepas deBacillus, dando un aumento del recuento de leche a granel de 5 × 104

organismos/ mL.

El deterioro de la leche pasteurizada o cruda por bacteriaspsicrófilas proteolíticas puede ocurrir en almacenamientos prolongadospor debajo de 7 °C.

La peptona y el extracto de levadura proporcionan los nutrientesesenciales y la leche descremada en polvo es una fuente de caseína. Ladextrosa es la fuente de carbono. El agar es el agente solidificante.

Las bacterias proteolíticas pueden rodearse por una zona claradebido a la conversión de la caseína en compuestos nitrogenadossolubles.

60

Fórmula


Triptona 5.0 gExtracto de levadura 2.5 gDextrosa 1.0 gLeche en polvodescremada(s/antibióticos)

1.0 g

Agar 12.5 gSolución a 25 ºC pH 6.9 ± 0.1

Usos

El Agar Leche es empleado para realizar recuentos de bacterias enleche, helados, productos lácteos y aguas de lavado de equipo empleadoen su fabricación.

Inoculación

Este medio puede sembrarse con una buena cantidad del materialen estudio, directamente en la placa por estría superficial o bien puedenprepararse diluciones de 1/10, 1/100, 1/1000 en solución de Ringer. Sedistribuyen en las placas 1 mL de cada dilución y se adiciona de 10 – 12mL de Agar Leche a una temperatura de 45 °C, se mezcla y se distribuyehomogéneamente en toda la caja, esperar a solidificar e incubar a 30 ± 2ºC por 72 h protegida de la luz.

Medios Alternos

No hay sugerencias.

Resultados

Se seleccionan las placas que contengan de 10 a 300 colonias. Losresultados se expresan como colonias por mL de producto probado.

61

Las colonias se pueden observar mejor inundando las placas conuna solución de ácido clorhídrico al 1% o ácido acético al 10% y seretirando el exceso de la misma. Se realiza el recuento de las coloniasrodadas de zonas claras.

En la siguiente tabla se describen las características específicas delas colonias de algunas cepas de referencia.

Tabla 13Interpretación en Agar Leche

Limitaciones

Empleado únicamente para productos lácteos.


Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595 Buen desarrollo.

Lactococcus lactis ATCC 19435 Buen desarrollo.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Buen desarrollo.

Streptococcusthermophilus

ATCC 19258 Buen desarrollo.

62

Agar Tioglicolato

El medio líquido de tioglicolato fue diseñado por Brewer para elcultivo rápido tanto de anaerobios como aerobios. La incorporación depeptona de caseína fue introducida por Vera en 1944. En el caso delagar Tioglicolato se aumenta la cantidad de agar pero el fundamento essimilar (15).

Las peptonas, la levadura y la dextrosa proporcionan los factoresde crecimiento necesarios para el desarrollo bacteriano, El tioglicolatosódico y la L-cistina son agentes reductores que previenen laacumulación de peróxidos, que son letales para algunosmicroorganismos. La resazurina es un indicador de oxido – reducción,presenta un color rosa con la muestra oxidada y es incolora cuando estáreducida (15).


Agar 20.0 gHidrolizado de caseína 15.5 gDextrosa 5.5 gExtracto de levadura 5.0 gCloruro de sodio 2.5 gTioglicolato de sodio 0.5 gL-cistina 0.5 gResazurina 0.001 gSolución a 25 ºC pH 7.2 ± 0.2

Usos

Recomendado para el cultivo de microorganismos aerobios yanaerobios en pruebas de esterilidad.

Inoculación

La muestra puede sembrarse directamente en la placa por estríasuperficial, incubar a 35 ± 2 de 40 a 48 h en condiciones anaerobias.

63

Medios Alternos

No hay sugerencias.

Resultados

Tabla 14Interpretación en Agar Tioglicolato

Limitaciones

Empleado para pruebas de esterilidad y bajo condicionesanaerobias.


Clostridium perfringens ATCC 12924 Desarrollo abundante.

Clostridium sporogens ATCC 11437 Desarrollo abundante.

Clostridium botulinum ATCC 25763 Desarrollo abundante.

64

2.6 Medios cromogénicos

En los últimos años, se han producido avances importantes en laformulación de los medios de cultivo diferenciales con la aparición demedios cromogénicos, los cuales posibilitan un diagnóstico más rápido ycon mayor eficiencia. Los mismos poseen combinaciones de sustratoscromogénicos y fluorogénicos, que permiten la detección de actividadesenzimáticas específicas de ciertos microorganismos, eliminando lanecesidad de subcultivos y pruebas bioquímicas adicionales para lograruna identificación precisa. De ese modo, se mejora también lasensibilidad y especificidad del diagnóstico con respecto a los mediosconvencionales.

Estos medios incluyen en su composición sustratos cromogénicosde enzimas específicas bacterianas. Cuando la enzima actúa sobre estoscromógenos, estos sufren un cambio en su estructura, formándose unanueva estructura molecular coloreada. La interacción entre losmicroorganismos y los sustratos cromogénicos, depende del tipo desustrato usado, pues la sustancia coloreada producida puede quedarabsorbida en el interior de la célula bacteriana coloreando la colonia odifundir en el medio de cultivo produciendo un cambio de color.

Los O-glicósidos derivados de cumarinas e indoles son muy usadoscomo sustratos fluorogénicos y cromogénicos para detectar la presenciade bacterias patógenas (coliformes, E. coli, Enterococcus sp.) tanto en laclínica como en diferentes productos para el consumo humano: agua,alimentos, etc. Los siguientes cromogénos son utilizados a nivel mundial(16).

El 4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido. El ácido 4-metilumbeliferil--D-glucopiranosidurónico. El 5-bromo-4-cloro-1H-indol-3-il -D-galactopiranósido. El 6-cloro-1H-indo-3-il-β-D-galactopiranósido. La sal de ciclohexilamonio del ácido 5-bromo-6-cloro-1H-indo-3-il-

β-D-glucuronido.

La intensidad y la especificidad de dichos colores en las coloniascultivadas en los medios cromogénicos optimizan la enumeraciónhaciendo más fácil la rápida identificación de las colonias bacterianas.Los resultados se pueden obtener en 24 – 48 horas y la interpretaciónresulta más fácil mediante el color de las colonias.

65

Actualmente casi todos los fabricantes a nivel mundial yacomercializan este tipo de medios de cultivo que sin duda optimiza eltiempo y costo para los laboratorios de Microbiología que dependen dediagnósticos rápidos y precisos. Algunos de los medios encontrados en elmercado se enlistan y tal como es el caso de los medios de cultivotradicionales cada fabricante tiene diferentes denominaciones.

Identificación para estafilococos. Identificación de especies de Candida. Identificación de Salmonella sp. y sus serotipos. Identificación de patógenos del tracto urinario. Identificación del grupo de bacterias: Klebsiella sp., Enterobacter,

Serratia y Citrobacter. Identificación de Clostridium perfringens en agua. Identificación de E.coli. y coliformes.

Recomendaciones

El almacenamiento de los medios de cultivo deshidratados es hastade 2 años, pero se recomienda almacenar las placas preparadas hasta 3meses y placas de filtración hasta 6 meses en temperaturas de 2 – 8 °C,protegidas de la luz y fuentes de calor. Sin embargo es necesario observarlas especificaciones de cada fabricante.

Después de usar, las placas deben tratarse como materialcontaminado y deben eliminarse según la buena praxis microbiológica.Esto puede hacerse mediante autoclave o bien de acuerdo a la normavigente.

66

Capítulo III. Preparación y control de calidad

3.1 Preparación de medios y control de calidad

La preparación de medios

Es de suma importancia el que se proteja la calidad de los mediosde cultivo con la finalidad de obtener buenos resultados en el laboratoriomicrobiológico. La preparación de los medios, el almacenamientoapropiado y las pruebas de control de calidad pueden asegurar medios decultivo de buena calidad.

La elección de los medios de acuerdo a la necesidad propia de cadalaboratorio implica la adquisición de medios deshidratados o mediospreviamente fabricados, estos se acompañan con la fórmula einstrucciones de preparación de cada fabricante, es de especial interéspara el presente trabajo hacer hincapié en que los distintos tipos demedios pueden tener diferentes requisitos de preparación (calentamiento,aditivos, ajustes de pH etc.) y es importante seguir las instrucciones paraasegurar la preparación de medios de buena calidad. En el caso de losmedios fabricados deben estar acompañados de un certificado de análisisdonde se encuentren los siguientes datos: fecha de caducidad ycondiciones sugeridas de almacenamiento, en ciertos casos algunosproveedores incluyen en sus resultados los organismos de control decalidad empleados para la promoción de crecimiento y pruebas deselectividad para esos medios.

Método

Todos los fabricantes de medios de cultivos tienen especificadas lascantidades reales para la preparación de un litro del medio, por lo cual sedebe considerar la cantidad que se necesite preparar y realizar loscálculos necesarios.

Para disolver el medio se recomienda adicionar el polvo al matrazErlenmeyer6 e inclinarlo, adicionar el agua fría por las paredesprocurando girar el matraz para ir resuspendiendo todo el sólido7, dejarreposar de 10 – 15 minutos hasta que se hidrate completamente, añadirla cantidad de agua necesaria de acuerdo a los cálculos realizados y

6 Con una capacidad de más del 50% de la cantidad a preparar, esto con la finalidad de realizar una buenaagitación sin la preocupación de derrames.7 Evitar que el agua caiga sobre el polvo, ya que se generaran grumos imposibles de solubilizar.

67

agitar. Es posible emplear agua caliente en vez de fría, esto acelera lasolubilización del medio.8

Se recomienda el uso de guantes de carnaza para evitarquemaduras y trabajar en una mesa con un área de no menor a unmetro, para tener el espacio y la libertad de manipular el materialnecesario.

El siguiente paso de acuerdo con las instrucciones de losfabricantes es calentar a ebullición por un minuto, aunque no existedocumentada una razón específica para realizar este paso, pudierainfluir en la calidad de la transparencia y limpieza de los mediosresultantes.9 Este paso tiene que realizarse con sumo cuidado,acercando por unos instantes el matraz a la llama del mechero Fisher yretirando, con la finalidad de mantenerlo en ebullición por un minutopero evitando los derrames que se presentan cuando hay uncalentamiento permanente y brusco, esto se debe realizar con unaagitación continua para evitar quemar el medio.

Colocar la torunda de algodón forrada con gasa en la boca dematraz, procurando quede fijo pero no apretado y cubrir con un gorro depapel Kraft e identificar el medio.

Esterilizar en autoclave o en olla de presión bajo las condicionesrequeridas 121 ºC (15 lbs. de presión) por 15 minutos (en algunosmedios no es necesario este paso, por lo cual siempre se tiene que revisarlas indicaciones del fabricante).

Enfriar el medio a temperatura ambiente hasta 45 ºCaproximadamente (se puede comprobar esta, acercando el matraz a lamejilla, cuando la temperatura es tolerable en este momento se puedevaciar el medio).

Vaciar en las cajas estériles, en condiciones asépticas (la zona detrabajo previamente sanitizada y en la proximidad de la llama de dosmecheros Bunsen o en campana de flujo laminar, así como proteccióncon cubre bocas y cofia por parte del usuario), aproximadamente 30 mL

8la técnica que sugiere la F.E.S. Zaragoza para cantidades mayores a 300 mg es hervir tres cuartas partes de agua

destilada y suspender el medio deshidratado en el resto de agua fría, teniendo cuidado de que todo el medio seasuspendido uniformemente, entonces la suspensión se añade al agua hirviendo hasta que la solución sea completa(17).9

la técnica de preparación de los medios de cultivo de la Facultad de Química de la UNAM indica que se puede

realizar la disolución calentando a baño maría (18).

68

del agar. Es necesario realizarlo con rapidez para evitar la solidificacióndel medio, si esto sucediera basta con calentarlo ligeramente. Las cajasse mueven en forma de ocho para distribuir uniformemente el medio yuna vez solidificadas se invierten.

Conservar las cajas apiladas una sobre otra y envolverlas conpelícula de plástico adherente Ega Pack (empleado para cubrir alimentos)a una temperatura de 2 – 8 ºC.

NOTA: Cada medio requiere de indicaciones específicas, en el casodel agar chocolate y el agar sangre, la adición de la sangre se realiza a los80 y 45 ºC respectivamente Después de la esterilización por lo que esnecesario que se revise las indicaciones del fabricante.

Control de Calidad

La preparación uniforme de medios requiere de algunos cuidadosen el procedimiento (19).

El agua empleada en los medios es agua destilada o desionizada,siempre es necesario registrar el volumen de agua empleada.

El peso de los medios deshidratados o los constituyentes requierende exactitud, los utensilios y recipientes de pesado deben estar limpiospara evitar contaminaciones que alteren la composición de los mediosterminados, además de llevar registros de los pesos de cada componente.

Los medios deshidratados deben disolverse bien en agua antes desu esterilización y dispensación. En algunos casos se necesitacalentamiento para disolver los medios, se debe tener cuidado de nosobrecalentar, puesto que todos los medios de cultivo, en mayor o menormedida son sensibles al calor, además de que se podría presentar unburbujeo que derramaría parte de la mezcla. Es recomendable seguirexactamente las instrucciones especificadas por el fabricante impreso enlas etiquetas de los envases. Una indicación general desobrecalentamiento es el oscurecimiento de los medios (reacción tipoMaillard), reacción no enzimática que produce la aparición de un coloramarronado. Otro factor importante es la mezcla adecuada del medioDespués de agregar los suplementos requeridos. Por lo tanto los equiposutilizados en la preparación de estos deberían ser los adecuados paracontrolar el calentamiento, la agitación y la mezcla de los medios.

69

El material de vidrio utilizado para la preparación de medios queno estén completamente limpios, puede ocasionar la introducción desustancias que sean inhibitorias, éstas pueden originarse si quedanresiduos del detergente Después del lavado de los recipientes de vidrio o apartir de materiales usados previamente en los recipientes. En lalimpieza de los recipientes de vidrio se recomienda remover todos losmateriales o sustancias extrañas y enjuagar bien el detergente con aguapurificada.

La esterilización10 de los medios debe realizarse dentro de losparámetros provistos por el fabricante o validados por el usuario. Latécnica de esterilización empleada es el autoclave por calor húmedo,excepto para casos en los que se requiere ebullición para evitar eldeterioro de los componentes termolábiles de los medios, la esterilizaciónpor filtración puede ser también apropiada para algunas formulaciones.Los medios preparados comercialmente deben proveer documentaciónacerca del método de esterilización empleado. Idealmente el fabricantedebería proveer el nivel de garantía de esterilidad de los medios contra unindicador biológico conocido, SAL por sus siglas en inglés (SterilityAssurance Level).

Los efectos del método de esterilización y las condiciones en losmedios deben validarse mediante pruebas de esterilidad y de promociónde crecimiento de los medios. Adicionalmente, si se esterilizan por calorhúmedo el ciclo del autoclave debe validarse para asegurar la distribuciónadecuada de calor para cargas y volúmenes seleccionados. Por lo generallos fabricantes recomiendan que se use un ciclo de 121 ºC (15 lbs. depresión) por 15 minutos empleando un equipo validado. Estascondiciones refieren al tiempo en el que el medio permanece a latemperatura indicada. Como la capacidad de la carga del autoclaveinfluye en la velocidad del calentamiento, puede que se necesiten ciclosmás largos para cargas de mayor tamaño. Sin embargo, el tiempo deesterilización dependerá del volumen de los medios y de la carga delautoclave. Los ciclos de esterilización en los que el autoclave se calientadespacio puede ocasionar el sobrecalentamiento de los medios. Enconsecuencia, se debe tener cuidado al validar un ciclo de esterilizaciónpara que se genere el mínimo requerido de un SAL, balanceando lanecesidad de obtener un medio estéril contra la tendencia de los medios adegradarse debido al excesivo calentamiento. Después que se hayan

10 Ver anexo 4.

70

enfriado no es recomendable almacenar medios en el autoclave trascompletarse el ciclo de esterilización ya que se pueden dañar los medios.El calentamiento o condiciones de esterilización inadecuados para mediospreparados en el laboratorio o comercialmente pueden originardiferencias, cambio de color, pérdida de transparencia, consistenciaalterada del gel o variación de pH del intervalo recomendado por elfabricante.

Después de que se hayan enfriado a temperatura ambiente (25 ºC)se debería confirmar el pH de cada lote del medio mediante la extracciónaséptica de una muestra para la prueba. Para superficies de agar, serecomienda usar una sonda plana para medir el pH y un dispositivo deinmersión para medir los líquidos. El pH de los medios debería estar enun intervalo de ± 0.2 del valor indicado por el fabricante, a menos que elmétodo del fabricante o el método validado por el laboratorio acepte unintervalo mayor.

Los medios preparados deben revisarse mediante una inspecciónadecuada de las placas y tubos en los siguientes aspectos:

Envases y cierres rotos Cumplir con el volumen de llenado Deshidratación que genere grietas o hundimientos (hoyuelos) en la

superficie de un medio sólido Hemólisis Oscurecimiento excesivo o cambio de color Formación de cristales debido a posible congelamiento Cantidad excesiva de burbujas Contaminación microbiana Estado de indicadores redox (si corresponde) Verificación y registro del número y fecha de caducidad del lote Esterilidad de los medios.

71

Causas probables de error en la preparación de medios de cultivodeshidratados

FALLA CAUSA PROBABLEProblemas de pH y cambios de

color en el medio de cultivoSobrecalentamiento.Mezclado inadecuado.Exceso de tiempo al esterilizarlo.Recipientes y material de vidriocontaminados.Agua con impurezas y de mala calidad.Fundición del medio en varias ocasiones.Almacenamiento a temperaturas altas.Hidrólisis de los ingredientes.

Solubilidad incompleta Calentamiento inadecuado.Mezclado incompleto por lo que sesobrecalientan algunas porciones del medio.Agua de mala calidad.Recipientes demasiado pequeños, por lo queno es posible homogeneizar el líquido.NOTA: En ciertos casos, existe unprecipitado después de esterilizar el medio,por lo que es necesario agitar suavemente elmatraz antes de vaciarlo en las cajas.(Ejemplo: Agar EMB, agar de MuellerHinton).

Oscurecimiento (reacción tipoMaillard)

Sobrecalentamiento al disolver el agar o alesterilizarlo.

Falta de dureza en el agar Mezclado ineficiente.Pesado erróneo del polvo deshidratado.pH demasiado ácido. Ejemplo: Agar Extractode Malta, con un pH muy ácido no permitela gelificación del medio.Por fundir el agar varias ocasiones.

Pérdida de las propiedadesnutricionales o cambios en lascaracterísticas del crecimiento.

Por fundir el agar en varias ocasionesCalentamiento prolongado o excesivo,Material quemado en las paredes delrecipiente.Mezcla inadecuada.

72

3.2 Almacenamiento de medios de cultivo

En el caso de los medios de cultivo deshidratados, los frascos con elpolvo deben almacenarse en un lugar fresco y seco evitando la luzdirecta. Todos los medios de cultivo son higroscópicos por lo que una vezque han sido abiertos, tienden a tomar la humedad del medio ambiente.Es particularmente importante cerrar lo antes posible el tapón interior yla tapa exterior firmemente después de usar cada frasco.

Se recomienda no colocar los frascos en lugares en donde seencuentren aparatos de calentamiento o ventanas, ya que esto puedeprovocar reacciones indeseables.

Para los medios de cultivo en placa se deben etiquetaradecuadamente con el número de lote, fecha de preparación y decaducidad e identificación de los mismos. Los medios se debenalmacenar conforme a las instrucciones del fabricante en el caso de losmedios ya preparados.

Los medios preparados en el laboratorio deben almacenarse bajocondiciones validadas de 2 – 8 ºC, empaquetadas en película de plásticoadherente Ega pack (empleado para cubrir alimentos). Esta es preferiblea las bolsas de polietileno que retienen la humedad en la forma deacumulaciones de líquido en cada bolsa. No almacenar un agar atemperaturas iguales o bajo cero ya que el congelamiento podríaperjudicar la estructura del gel. Proteger a los medios almacenados desu exposición a la luz y temperaturas excesivas. Si los medios están bienempaquetados y en la temperatura correcta, la vida útil de estanteríapuede ser de muchos meses. No deben conservarse o usarse las placastras ese lapso. Una inspección útil consiste en medir la pérdida de aguadurante el almacenamiento. Una pérdida de peso de 5% sugiere que lasplacas alcanzaron un estado terminal.

Para eliminar los medios de cultivo usados así como los medioscaducos se beben seguir los procedimientos de seguridad de riesgobiológico de la norma vigente.11

11 Ver anexo 2: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCIÓN AMBIENTAL - SALUDAMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS - CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONESDE MANEJO.

73

Anexo 1

Rutas Metabólicas

Los hidratos de carbono (20) se clasifican en:

Monosacáridos, aldehídos polhidroxilados o cetonas. Polisacáridos u oligosacáridos, productos de condensación de dos o

más monosacáridos (polímeros de monosacáridos). Alcoholes polihídricos y ciclitoles, productos de la reducción de

monosacáridos.

Un monosacárido o azúcar simple por lo común contiene entre 1 y 6átomos de carbono:

1. Tetrosa (C4H8O4), la eritrosa es un azúcar de 4 carbonos.2. Pentosas (C5H10O5), son azúcares de 5 carbonos: la ribosa,

ribulosa, xilosa y arabinosa.3. Hexosas (C6H12O6), son azúcares de 6 carbonos: la glucosa

(dextrosa), galactosa y manosa, son aldosas y la fructosa(levulosa) es un compuesto cetosa.

Los disacáridos (C12H22O11) son polisacáridos (oligosacáridos)compuestos por dos unidades de monosacáridos, glucosa más otromonosacárido.

Glucósido es un término general que denota un disacárido, sintener en cuenta el azúcar presente.

74

El trisacárido contiene tres monosacáridos, la rafinosa (C18H32O16)está compuesta por glucosa, fructosa y galactosa.

Un polisacárido está compuesto por muchos polímeros demonosacáridos un ejemplo es la inulina, su unidad es la fructosa.

Los alcoholes que se denominan en conjunto “azúcares” sonalcoholes polihídricos (productos de la reducción de un monosacárido),entre ellos están el adonitol, dulcitol, manitol y sorbitol.

El inositol es un sustrato orgánico que no pertenece a los hidratosde carbono.

Los polisacáridos, trisacáridos y disacáridos son demasiadocomplejos para penetrar en una célula bacteriana para su degradación,Si pueden ser metabolizados por una especie bacteriana particular,primero son catabolizados a monosacáridos menos complejos porenzimas exocelulares (permeasa) para que puedan ser incorporados alinterior de la célula.

La fermentación es un proceso metabólico anaerobio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como el aceptor final dehidrógeno (aceptor de electrones) en lugar de oxígeno. La fermentación desustratos orgánicos como los hidratos de carbono da por resultadoproductos finales reducidos y oxidados. Los productos finalesprovenientes de las fermentaciones de hidratos de carbono dependen devarios factores: a) el microorganismo que lleva a cabo el proceso defermentación, b) el sustrato a ser fermentado, y c) en algunas ocasionesfactores ambientales como la temperatura y la acidez. Los hidratos decarbono y alcoholes, en conjunto denominados “azúcares”, rinden pocosproductos finales de fermentación: dos gases, hidrógeno y dióxido decarbono, unos pocos ácidos, unos pocos alcoholes y una cetona.

Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa en anaerobiosis,otras oxidan la glucosa (21). Algunas pueden utilizar ambos mecanismospara su metabolismo, mientras que otras no pueden utilizar la glucosapor ningún mecanismo. No todos los monosacáridos son degradados portodas las especies bacterianas, sus patrones de fermentación difieren, loque ayuda a la identificación en grupos, géneros o especies. Lasbacterias también difieren en las vías metabólicas utilizadas parafermentar el mismo sustrato, lo que da por resultado distintos productos

75

finales, la manera y la magnitud por las cuales un sustrato escatabolizado dependen de las especies bacterianas y de las condiciones decultivo.

El proceso de fermentación más común produce como productofinal ácido láctico, sin embargo, ocurren otras vías de fermentación, quedifieren con respecto al sustrato metabolizado o al producto finalproducido. Se pueden utilizar pruebas de hidratos de carbono pararevelar los patrones de fermentación de una especie bacteriana particularpor la observación de: a) la ausencia de glucósidos y/o b) la ausencia demonosacáridos en disacáridos, trisacáridos y polisacáridos máscomplejos, las cuales demuestran que la glucosa fue metabolizada.

Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono por lo comúnson anaerobias facultativas. En el proceso de fermentación, un hidratode carbono se degrada y fracciona en dos triosas, (moléculas de carbono),que con posterioridad se degradan a una cantidad de compuestos de 1, 2,3 y 4 carbonos. Los productos finales varían con cada especiebacteriana, lo que depende del sistema enzimático presente en la especiey de las condiciones ambientales. El criterio importante es que antes desu degradación, la glucosa es fosforilada a un compuesto glucosa 6-fosfato. La fermentación requiere un compuesto orgánico como aceptorfinal de electrones.

La vía principal fermentativa de degradación de la glucosa es la víade Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), aunque la degradación puede ocurrirpor vía o en combinación con la desviación (shunt) de la pentosa (víaWarburg-Dickins, desviación de la hexosa monofosfato (HMP) o vía deEntner-Doudoroff (ED). Sin embargo, las tres vías requieren lafosforilación inicial de la glucosa antes de que pueda ocurrir ladegradación (Fig. 4).

El ácido pirúvico (CH3COCOOH) es el intermediario principal en ladegradación de la glucosa y el catabolismo del ácido pirúvico involucramuchos mecanismos diferentes que forman una variedad de productosfinales característicos de las fermentaciones bacterianas. Losmonosacáridos son catabolizados como resultado de la oxidación a ácidopirúvico a través de una secuencia de pasos metabólicos mediados porenzimas específicas. Las bacterias pueden utilizar vías diferentes paraformar ácido pirúvico y más de una vía puede ocurrir de manerasimultánea en el mismo microorganismo.

Los productos finales característicos de la fermentación bacterianason:

ácido láctico ácidos acético y fórmico ácido láctico y alcohol etílico (etanol) etanol acetilmetilcarbinol (acetoína) y CO ácido succínico a ácido propiónico y CO CO2 y acetona a alcohol isopropílico (isopropanol) ácido butírico a alcohol butílico (butanol).

Las bacterias producen clases diversas de patrones fermentación deacuerdo con los productos finales formados característicos. Según la

Los productos finales característicos de la fermentación bacteriana

s acético y fórmicoácido láctico y alcohol etílico (etanol)

acetilmetilcarbinol (acetoína) y CO2

ácido succínico a ácido propiónico y CO2

y acetona a alcohol isopropílico (isopropanol)ácido butírico a alcohol butílico (butanol).

Fig. 4 Tres vías de fermentación fosforilada


76

Los productos finales característicos de la fermentación bacteriana


77

mayoría de los autores, los grupos más importantes de bacterias exhibenuno de los cinco tipos principales de patrones de fermentación.

Fermentación alcohólica

Glucosa pirúvico acetaldehído 2 etanol+ CO2

Las bacterias alcohólicas degradan la glucosa a ácido pirúvico porla vía metabólica de Embden-Meyerhof-Parnas.

Fermentación del ácido láctico

Las bacterias que producen ácido láctico pueden ser divididas endos subgrupos: fermentadoras homolácticas y heterolácticas. En el casodel ácido homoláctico o ácido láctico simple, las bacterias degradan laglucosa por la vía de EMP casi exclusivamente a ácido láctico, sólo conrastros de otros productos finales. Las fermentadoras heterolácticas aveces se denominan fermentadoras mixtas del ácido láctico. Estosmicroorganismos pueden catabolizar la glucosa por una de las tres víasde degradación (EMP, desviación de la pentosa o proceso de Entner-Duodoroft) para dar los productos finales característicos: ácido lácticomás ácido acético y ácidos fórmicos, etanol y CO2 y a veces glicerol.

Una única especie bacteriana puede exhibir tanto la fermentaciónhomoláctica como la heteroláctica. Los factores de control son el pH y elsustrato presente para la actividad bacteriana.

acetaldehído ácido acéticoÁcido pirúvico

ácido succínico ácido propiónico + CO2

78

Fermentación del ácido propiónico

Los productos finales principales del ácido pirúvico son el ácidopropiónico (propionato) y CO2 por la vía del ácido succínico, aunquepuede producirse ácido acético. Los microorganismos anaerobios llevana cabo la fermentación propiónica.

Fermentaciones del grupo coliforme

Los integrantes del grupo coliforme a menudo se denominanfermentadores mixtos de ácidos fermentadores del ácido fórmico obacterias colónicas-disentéricas-tifoideas (grupo CDT). La fermentaciónmixta de ácidos es característica de los miembros de la familiaEnterobacteriaceae y estos microorganismos degradan la glucosa en unadiversidad de productos finales.

El grupo coliforme puede subdividirse en dos categorías:a) Los microorganismos que rinden diversos productos mixtos de ácidos.b) Los que elaboran butilenglicol como principal producto final. El tipo

o las combinaciones y cantidades del producto final producidasdependen del género o de las especies que se prueban.

Los productos de los microorganismos que elaboran varios ácidosincluyen los siguientes: ácidos fórmico, acético, láctico y succínico, etanoly CO2 e H2, pero no butilenglicol (butanodiol). El alcohol se forma por lafermentación alcohólica; el ácido láctico, el ácido acético y el CO2 seforman por la fermentación láctica a través de la dismutación del ácidopirúvico. En la dismutación, una molécula de ácido pirúvico es reducidapara dar ácido láctico y la otra molécula es oxidada y se forma ácidoacético y CO2. Entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae,Escherichia coli exhibe este tipo de fermentación.

2 moléculas de ácido pirúvico ácido acético + ácido láctico + CO2

El segundo grupo está compuesto por microorganismos cuyoprincipal producto final es el butilenglicol. Entre los miembros de lafamilia Enterobacteriaceae, los grupos Klebsiella-Enterobacter muestraneste tipo de fermentación.

79

Fermentación del alcohol butílico (butanol)

La fermentación del butanol es llevada a cabo por las bacteriasanaerobias como Clostridium sp. Los diversos productos finales formadosson ácido acético, ácido fórmico, etanol, ácido butírico, butanol, acetona,isopropanol y una gran cantidad de CO2 y H2. La combinación y lascantidades de los productos finales formados dependen del género y delas especies bacterianas. Algunos microorganismos producen sobre todoácidos butírico y acético, CO2 e H2, otros producen butilenglicol, acetona,butanol e isopropanol. Sin embargo, no se forma ácido láctico.

Las pruebas de fermentación de hidratos de carbono puedenutilizarse para determinar qué productos finales se han formado pero nolas vías metabólicas utilizadas. Asimismo, el medio contiene otrosconstituyentes para el crecimiento que pueden degradarse para dardiversos productos finales similares a los producidos por la degradaciónde los hidratos de carbono mientras que el microorganismo estáutilizando alguno de los carbonos producidos por la degradación delhidrato de carbono para producir nuevas células.

El indicador de pH utilizado con más frecuencia para demostrar lafermentación del hidrato de carbono es el rojo fenol, ya que la mayoría delos productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono sonácidos orgánicos. Con el rojo fenol, el cambio de color ocurre cerca delpH original del medio (pH ácido 6.8, neutro pH 7.4).

La peptona en el medio también es degradada por las especiesbacterianas y produce sustancias alcalinas. El ácido producido por lafermentación de un hidrato de carbono se observa por un cambio de pHsólo cuando se produce más ácido por la degradación del hidrato decarbono que sustancias alcalinas provenientes de la degradación de lapeptona. La observación de un cambio de color que denota acidez estáinfluenciada por dos factores a) el indicador del pH utilizado y b) laspropiedades buffer del medio.

Productos por una mol Glucosa

Ruta de las Pentosas 12 NADPH + 12H+ + ATPEntner-Doudoroff 2 NADPH + ATP

80

Anexo 2

Normas Oficiales Mexicanas

Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece lasEspecificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo.

Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaríade Salud.

LUIS MOUREY VALDES, Director General de Control de Insumos para la Salud, por acuerdodel Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, confundamento en los artículos 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 38fracción II, 45, 46 fracción II, 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 8o.fracción IV y 12 fracción II del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud.

INDICE

PREFACIO1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION2. REFERENCIAS3. DEFINICIONES, SIMBOLOS Y ABREVIATURAS4. CLASIFICACION5. ESP.ECIFICACIONES6. MUESTREO7. METODOS DE PRUEBA8. ETIQUETADO9. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES10. OBSERVANCIA DE ESTA NORMA11. VIGENCIA

PREFACIO

Participaron en la elaboración de esta Norma Oficial Mexicana: DirecciónGeneral de Control de Insumos para la Salud de la Secretaría de Salud,Instituto Mexicano del Seguro Social, Cámara Nacional de la IndustriaFarmacéutica (CANIFARMA): Sección de Productos Auxiliares para la Salud,y las siguientes empresas: Merck México, S.A., Becton Dickinson, S.A. deC.V., Anachem, S.A. de C.V., Alfonso Marx, S.A. de C.V., Dibico, S.A. de C.V.

1. Objetivo y campo de aplicación1.1 Objetivo.Esta Norma tiene por objeto determinar las especificaciones mínimas que deben tener losmedios de cultivo para microorganismos en general.1.2 Campo de aplicación.

81

Esta Norma es de observancia obligatoria en todas las industrias, laboratorios yestablecimientos dedicados al proceso de estos productos en el territorio nacional.2. ReferenciasLa presente Norma se complementa con las siguientes normas oficiales mexicanas:NOM Z-13 "Guía para la redacción, estructuración y presentación de las Normas OficialesMexicanas".NOM-008-SCFI-93 "Sistema General de Unidades de Medida".3. Definiciones, símbolos y abreviaturas3.1 Definiciones.3.1.1 Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar yaislar los microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad.3.1.1.1 Generalmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular.3.1.1.2 Puede presentarse también hidratado y preparado.3.1.2 Se entiende por proceso el conjunto de actividades relativas a la obtención,elaboración, fabricación, preparación, conservación, mezclado, acondicionamiento,envasado, manipulación, transporte, distribución, importación, exportación,almacenamiento y expendio o suministro al público de los dispositivos médicos.3.2 Símbolos y abreviaturas.ATCC Colección Americana de Cultivos TipoNOM Norma Oficial MexicanaSI Sistema Internacional de UnidadesSSA Secretaría de SaludENCB Escuela Nacional de Ciencias BiológicasIMSS Instituto Mexicano del Seguro Social4. Clasificación4.1 Por su aspecto físico, los medios de cultivo preparados pueden ser:Líquidos,Semisólidos,Sólidos.4.1.1 Medios líquidos.Se emplean fundamentalmente para:- Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien laproducción de metabolitos específicos.- Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir queotros se multipliquen.- Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.4.1.2 Medios semisólidos.- Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil.Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda.4.1.3 Medios sólidos.- Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios sólidosconstituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiología.4.2 Por su uso, se clasifican en:4.2.1 Medios selectivos.Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunosmicroorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación delgermen o grupo de gérmenes de interés.4.2.2 Medios selectivos de enriquecimiento.Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado eimpiden o inhiben la reproducción de otros.4.2.3 Medios diferenciales.

82

Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectancambios en el medio o en las características típicas de las colonias.4.2.4 Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis ode microaerofilia.4.2.5 Medios de cultivo para medir la potencia de los antibióticos.4.2.6 Medios de transporte.Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio dela toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en losespecímenes.4.2.7 Medios para filtración a través de membrana.Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual ypermiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión denutrientes del medio de la membrana.4.2.8 Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.4.2.9 Medios especiales para cultivo de protozoarios.5. EspecificacionesEl fabricante debe especificar en cada medio:5.1 Contenido de humedad (medio deshidratado).5.2 Composición del medio.5.3 Método de preparación.5.4 Condiciones de presión y temperatura para la esterilización del medio preparado (enautoclave).5.5 Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso.5.6 Características de desarrollo de los microorganismos en el medio.5.7 Advertencia sobre la conservación de los medios preparados.5.8 Resultados de las pruebas de estabilidad del medio.5.9 Resultado de las pruebas de viabilidad del medio.5.10 pH del medio preparado.5.11 Fuerza de gel (si procede).6. Muestreo6.1 El muestreo del producto debe estar de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-Z-12"Muestreo para la Inspección por Atributos", partes 1 y 2.7. Métodos de prueba7.1 La viabilidad de los medios debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de laATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas.Centros de Referencia de Cultivos Tipo de la SSA, ENCB o IMSS.8. Etiquetado8.1 El etiquetado sobre el envase del medio de cultivo debe ser en idioma español, concaracteres claros y legibles, de conformidad con lo establecido en la Ley General de Salud,su Reglamento en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productosy Servicios y las normas oficiales mexicanas que se emitan al efecto, debiendo incluirademás:- Nombre comercial del producto.- Uso.- La leyenda "Agente de Diagnóstico".- Presentación.- Datos de conservación y almacenaje.- Fecha de caducidad.- Número de lote.

83

- Número de Registro SSA.- Nombre y domicilio del fabricante.- Nombre y domicilio del distribuidor.- Método de preparación y pH final.- Fórmula.9. Concordancia con normas internacionalesEsta Norma no concuerda con ninguna norma internacional.10. Observancia de esta NormaLa vigilancia del cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretaría de Salud,cuyo personal realizará la verificación y la vigilancia que sean necesarias.11. VigenciaEsta Norma entrará en vigor al día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de laFederación.Sufragio Efectivo. No Reelección.México, D.F., a 5 de septiembre de 1994.- El Director General de Control de Insumos para laSalud, Luis Mourey Valdés.- Rúbrica.

Fecha de publicación: 27 de febrero de 1995

84

NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002,Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrososbiológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones demanejo.

Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.-Secretaríade Medio Ambiente y Recursos Naturales.

CASSIO LUISELLI FERNANDEZ, Presidente del Comité Consultivo Nacional deNormalización de Medio Ambiente y Recursos Naturales, y ERNESTO ENRIQUEZ RUBIO,Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización, de Regulación y FomentoSanitario, con fundamento en lo dispuesto en los artículos 32 bis fracciones I, II, IV, V y 39fracciones I, VIII y XXI de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 de la LeyFederal de Procedimiento Administrativo; 5 fracciones V, VI y XIX, 15, 36, 37, 37 Bis, 150,151, 151 Bis, 160 y 171 de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección alAmbiente; 3 fracciones XIII y XIV, 13, apartado A) fracción I, 45, 116, 117, 118, 128, 129 y393 de la Ley General de Salud; 38 fracción II, 40, fracciones I, III, V, IV, X y XI, 41, 43, 44y 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 1o., 2o. y 4o. fracciones II, III y IV,5o., 6o. y 58 del Reglamento de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección alAmbiente en materia de Residuos Peligrosos; 2 fracción I incisos a) y c), y 7o. y 66 delReglamento de la Ley General de Salud en materia de Control Sanitario de Actividades,Establecimientos, Productos y Servicios; 10 del Reglamento de la Ley General de Salud enmateria de Prestación de Servicios de Atención Médica; 28, 31 fracción II, 33 y 34 delReglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 8 fracción V del ReglamentoInterior de la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales; 2 literal C fracción II delReglamento Interior de la Secretaría de Salud y 2, fracciones I, II, III, VII, VIII y IX, 7fracción XVI, y 12 fracción VI del Decreto por el que se crea la Comisión Federal para laProtección contra Riesgos Sanitarios, ordenan la publicación en el Diario Oficial de laFederación de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protecciónambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación yesp.ecificaciones de manejo, y

CONSIDERANDO

Que en cumplimiento a lo establecido en la fracción I del artículo 47 de la Ley Federalsobre Metrología y Normalización, con fecha 1 de noviembre de 2001 se publicó en el DiarioOficial de la Federación, con carácter de proyecto la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-087-ECOL-SSA1-2000, Protección ambiental- Salud ambiental-Residuos peligrososbiológico-Infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo, mismo que fue elaborado demanera conjunta con la Secretaría de Salud, con el fin de que dentro de los 60 díasnaturales siguientes a su publicación, los interesados presenten sus comentarios ante elComité Consultivo Nacional de Normalización para la Protección Ambiental, sito en bulevarAdolfo Ruiz Cortines número 4209, piso 5o., colonia Jardines en la Montaña, código postal14210, Delegación Tlalpan, Distrito Federal o se enviaron al correo electrónico o al fax quese señalaron. Durante el citado plazo, la Manifestación de Impacto Regulatoriocorrespondiente estuvo a disposición del público en general para su consulta en el citadodomicilio, de conformidad con el artículo 45 del citado ordenamiento.

Que en el plazo de los 60 días antes señalado, los interesados presentaron suscomentarios al proyecto en cuestión, los cuales fueron analizados por el citado Comité,

85

realizándose las modificaciones procedentes al mismo. La Secretaría de Medio Ambiente yRecursos Naturales publicó las respuestas a los comentarios recibidos en el Diario Oficialde la Federación el día 20 de enero de 2003.

Que habiéndose cumplido con el procedimiento establecido en la Ley Federal sobreMetrología y Normalización, el Comité Consultivo Nacional de Normalización para laProtección Ambiental aprobó la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002,Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo, misma que abroga a su similar NOM-087-ECOL-1995 y su aclaración publicada en el citado órgano informativo el 12 de junio de 1996, Queestablece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección,transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciososque se generan en establecimientos que presten atención médica, actualizando el año de suexpedición. Por lo expuesto y fundado se expide la siguiente:

INDICE

0. Introducción1. Objetivo y campo de aplicación2. Referencias3. Definiciones y terminología4. Clasificación de los residuos peligrosos biológico-infecciosos5. Clasificación de los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos6. Manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos7. Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales y con las normasmexicanas

tomadas como base para su elaboración8. Bibliografía9. Observancia de esta Norma

Apéndice normativo

0. IntroducciónLa Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, define como residuos

peligrosos a todos aquellos residuos que por sus características corrosivas, reactivas,explosivas, tóxicas, inflamables y biológico-infecciosas, que representan un peligro para elequilibrio ecológico o el ambiente; mismos que serán manejados en términos de la propialey, su Reglamento y normas oficiales mexicanas que expida la Secretaría de MedioAmbiente y Recursos Naturales previa opinión de diversas dependencias que tengan algunainjerencia en la materia, correspondiéndole a la citada SEMARNAT su regulación y control.

Con fecha de 7 de noviembre de 1995, se publicó en el Diario Oficial de la Federación laNorma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para laseparación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposiciónfinal de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos quepresten servicios de atención médica.

Los establecimientos de atención médica son regulados por la Secretaría de Salud por loque en la revisión de la norma mencionada, se incluye a los representantes del sector.

Esta revisión consideró las características de los diferentes tipos de unidades médicasque prestan atención a poblaciones rurales.

Los residuos peligrosos biológico-infecciosos se han venido manejando en términos de lasregulaciones ambientales antes señaladas, sin embargo fue necesario actualizar la NOM-

86

087-ECOL-1995, tomándose en consideración las experiencias y competencias de lossectores involucrados en su cumplimiento, con el fin de que sus disposiciones seanoperativas y adecuadas para proteger el medio ambiente y la salud de la población engeneral.

1. Objetivo y campo de aplicaciónLa presente Norma Oficial Mexicana establece la clasificación de los residuos peligrosos

biológico-infecciosos así como las especificaciones para su manejo.Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria para los establecimientos que

generen residuos peligrosos biológico-infecciosos y los prestadores de servicios a tercerosque tengan relación directa con los mismos.

2. ReferenciasNorma Oficial Mexicana NOM-052-ECOL-1993, Que establece las características de los

residuos peligrosos, el listado de los mismos y los límites que hacen a un residuo peligrosopor su toxicidad al ambiente, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 22 deoctubre de 1993. Esta Norma contiene la nomenclatura en términos del Acuerdo Secretarialpublicado el 29 de noviembre de 1994, por el cual se actualiza la nomenclatura de 58normas oficiales mexicanas.

3. Definiciones y terminologíaPara efectos de esta Norma Oficial Mexicana, se consideran las definiciones contenidas en

la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, su Reglamento enmateria de Residuos Peligrosos, la Ley General de Salud, sus Reglamentos, y las siguientes:

3.1 Agente biológico-infecciosoCualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando está presente en

concentraciones suficientes (inóculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en unhospedero susceptible y en presencia de una vía de entrada.

3.2 Agente enteropatógenoMicroorganismo que bajo ciertas circunstancias puede producir enfermedad en el ser

humano a nivel del sistema digestivo, se transmite vía oral-fecal.3.3 BioterioEs un área o departamento especializado en la reproducción, mantenimiento y control de

diversas especies de animales de laboratorio en óptimas condiciones, los cuales sonutilizados para la experimentación, investigación científica y desarrollo tecnológico.

3.4 Carga útilEs el resultado de la sustracción del peso vehicular al peso bruto vehicular.3.5 Centro de acopioInstalación de servicio que tiene por objeto resguardar temporalmente y bajo ciertas

condiciones a los residuos peligrosos biológico-infecciosos para su envío a instalacionesautorizadas para su tratamiento o disposición final.

3.6 CepaCultivo de microorganismos procedente de un aislamiento.3.7 Establecimientos generadoresSon los lugares públicos, sociales o privados, fijos o móviles cualquiera que sea su

denominación, que estén relacionados con servicios de salud y que presten servicios deatención médica ya sea ambulatoria o para internamiento de seres humanos y utilización deanimales de bioterio, de acuerdo con la tabla 1 del presente instrumento.

3.8 IrreconociblePérdida de las características físicas y biológico-infecciosas del objeto para no ser

reutilizado.3.9 ManejoConjunto de operaciones que incluyen la identificación, separación, envasado,

almacenamiento, acopio, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de losresiduos peligrosos biológico-infecciosos.

87

3.10 Muestra biológicaParte anatómica o fracción de órganos o tejido, excreciones o secreciones obtenidas de un

ser humano o animal vivo o muerto para su análisis.3.11 ÓrganoEntidad morfológica compuesta por la agrupación de tejidos diferentes que concurren al

desempeño de un trabajo fisiológico.3.12 Prestador de serviciosEmpresa autorizada para realizar una o varias de las siguientes actividades: recolección,

transporte, acopio, tratamiento y disposición final de residuos peligrosos biológico-infecciosos.

3.13 Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI)Son aquellos materiales generados durante los servicios de atención médica que

contengan agentes biológico-infecciosos según son definidos en esta Norma, y que puedancausar efectos nocivos a la salud y al ambiente.

3.14 SangreEl tejido hemático con todos sus elementos.3.15 SEMARNATSecretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales.3.16 SSASecretaría de Salud.3.17 SeparaciónSegregación de las sustancias, materiales y residuos peligrosos de iguales características

cuando presentan un riesgo.3.18 TejidoEntidad morfológica compuesta por la agrupación de células de la misma naturaleza,

ordenadas con regularidad y que desempeñan una misma función.3.19 TratamientoEl método físico o químico que elimina las características infecciosas y hace

irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos.4. Clasificación de los residuos peligrosos biológico-infecciososPara efectos de esta Norma Oficial Mexicana se consideran residuos peligrosos biológico-

infecciosos los siguientes:4.1 La sangre4.1.1 La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los

derivados no comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y lasfracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).

4.2 Los cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos4.2.1 Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así

como los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos.4.2.2 Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos

de agentes biológico-infecciosos.4.3 Los patológicos4.3.1 Los tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la

cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en formol.4.3.2 Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e

histológico, excluyendo orina y excremento.4.3.3 Los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes

enteropatógenos en centros de investigación y bioterios.4.4 Los residuos no anatómicosSon residuos no anatómicos los siguientes:4.4.1 Los recipientes desechables que contengan sangre líquida.

88

4.4.2 Los materiales de curación, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquierade los siguientes fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural,líquido Céfalo-Raquídeo o líquido peritoneal.

4.4.3 Los materiales desechables que contengan esp.uto, secreciones pulmonares ycualquier material usado para contener éstos, de pacientes con sospecha o diagnóstico detuberculosis o de otra enfermedad infecciosa según sea determinado por la SSA mediantememorándum interno o el Boletín Epidemiológico.

4.4.4 Los materiales desechables que estén empapados, saturados o goteando sangre, osecreciones de pacientes con sospecha o diagnóstico de fiebres hemorrágicas, así como otrasenfermedades infecciosas emergentes según sea determinado por la SSA mediantememorándum interno o el Boletín Epidemiológico.

4.4.5 Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sidoexpuestos a agentes enteropatógenos.

4.5 Los objetos punzocortantes4.5.1 Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biológicas

durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujasde jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje,bisturís y estiletes de catéter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio,el cual deberá desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.

5. Clasificación de los establecimientos generadores de residuos peligrososbiológico-infecciosos

5.1 Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana, los establecimientos generadores seclasifican como se establece en la tabla 1.

TABLA 1

NIVEL I NIVEL II NIVEL III

Unidades hospitalarias de1 a 5 camas einstituciones deinvestigación conexcepción de losseñalados en el Nivel III.

Laboratorios clínicos ybancos de sangre querealicen análisis de 1 a 50muestras al día.

Unidades hospitalariaspsiquiátricas.

Centros de toma demuestras para análisisclínicos.

Unidades hospitalariasde 6 hasta 60 camas;

Laboratorios clínicos ybancos de sangre querealicen análisis de 51 a200 muestras al día;

Bioterios que sedediquen a lainvestigación conagentes biológico-infecciosos, o

Establecimientos quegeneren de 25 a 100kilogramos al mes deRPBI.

Unidades hospitalarias demás de 60 camas;

Centros de producción einvestigación experimentalen enfermedadesinfecciosas;

Laboratorios clínicos ybancos de sangre querealicen análisis a más de200 muestras al día, o

Establecimientos quegeneren más de 100kilogramos al mes de RPBI.

5.2 Los establecimientos generadores independientes del Nivel I que se encuentrenubicados en un mismo inmueble, podrán contratar los servicios de un prestador de servicioscomún, quien será el responsable del manejo de los residuos peligrosos biológico-infecciosos.

89

6. Manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos6.1 Los generadores y prestadores de servicios, además de cumplir con las disposiciones

legales aplicables, deben:6.1.1 Cumplir con las disposiciones correspondientes a las siguientes fases de manejo,

según el caso:a) Identificación de los residuos.b) Envasado de los residuos generados.c) Almacenamiento temporal.d) Recolección y transporte externo.e) Tratamiento.f) Disposición final.

6.2 Identificación y envasado6.2.1 En las áreas de generación de los establecimientos generadores, se deberán separar

y envasar todos los residuos peligrosos biológico-infecciosos, de acuerdo con suscaracterísticas físicas y biológicas infecciosas, conforme a la tabla 2 de esta Norma OficialMexicana. Durante el envasado, los residuos peligrosos biológico-infecciosos no deberánmezclarse con ningún otro tipo de residuos municipales o peligrosos.

TABLA 2

TIPO DE RESIDUOS ESTADO FISICO ENVASADO COLOR

4.1 Sangre Líquidos Recipientes herméticos Rojo

4.2 Cultivos y cepas deagentes infecciosos

Sólidos Bolsas de polietileno Rojo

4.3 Patológicos Sólidos Bolsas de polietileno Amarillo

Líquidos Recipientes herméticos Amarillo

4.4 Residuos no anatómicos Sólidos Bolsas de polietileno Rojo

Líquidos Recipientes herméticos Rojo

4.5 Objetos punzocortantes Sólidos Recipientes rígidospolipropileno

Rojo

a) Las bolsas deberán ser de polietileno de color rojo traslúcido de calibremínimo 200 y de color amarillo traslúcido de calibre mínimo 300,impermeables y con un contenido de metales pesados de no más de unaparte por millón y libres de cloro, además deberán estar marcadas con elsímbolo universal de riesgo biológico y la leyenda Residuos PeligrososBiológico-Infecciosos (Apéndice Normativo), deberán cumplir los valoresmínimos de los parámetros indicados en la tabla 3 de esta Norma OficialMexicana.

Las bolsas se llenarán al 80 por ciento (80%) de su capacidad, cerrándose antes de sertransportadas al sitio de almacenamiento temporal y no podrán ser abiertas o vaciadas.

90

TABLA 3

PARAMETRO UNIDADES ESP.ECIFICACIONES

Resistencia a la tensión Kg/cm2 SL: 140

ST: 120

Elongación % SL: 150

ST: 400

Resistencia al rasgado G SL: 90

ST: 150

SL: Sistema longitudinal.ST: Sistema transversal.

6.2.2 Los recipientes de los residuos peligrosos punzocortantes deberán ser rígidos, depolipropileno color rojo, con un contenido de metales pesados de no más de una parte pormillón y libres de cloro, que permitan verificar el volumen ocupado en el mismo, resistentesa fracturas y pérdidas de contenido al caerse, destructibles por métodos físicos, tenerseparador de agujas y abertura para depósito, con tapa(s) de ensamble seguro y cierrepermanente, deberán contar con la leyenda que indique "RESIDUOS PELIGROSOSPUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS" y marcados con el símbolo universal deriesgo biológico (Apéndice Normativo).

a) La resistencia mínima de penetración para los recipientes tanto parapunzocortantes como para líquidos, debe ser de 12.5 N (doce punto cincoNewtons) en todas sus partes y será determinada por la medición de la fuerzarequerida para penetrar los lados y la base con una aguja hipodérmicacalibre 21 x 32 mm mediante calibrador de fuerza o tensiómetro.

b) Los recipientes para los residuos peligrosos punzocortantes y líquidos sellenarán hasta el 80% (ochenta por ciento) de su capacidad, asegurándose losdispositivos de cierre y no deberán ser abiertos o vaciados.

c) Las unidades médicas que presten atención a poblaciones rurales, conmenos de 2,500 habitantes y ubicadas en zonas geográficas de difícil acceso,podrán utilizar latas con tapa removible obotes de plástico con tapa de rosca, con capacidad mínima de uno hasta doslitros, que deberán marcar previamente con la leyenda de "RESIDUOSPELIGROSOS PUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS".

6.2.3 Los recipientes de los residuos peligrosos líquidos deben ser rígidos, con tapahermética de polipropileno color rojo o amarillo, con un contenido de metales pesados de nomás de una parte por millón y libres de cloro, resistente a fracturas y pérdidas de contenidoal caerse, destructible por métodos físicos, deberá contar con la leyenda que indique“RESIDUOS PELIGROSOS LIQUIDOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS” y marcados con elsímbolo universal de riesgo biológico (Apéndice Normativo)

91

En caso de que los residuos líquidos no sean tratados dentro de las instalaciones delestablecimiento generador, deberán ser envasados como se indica en la tabla 2 de estaNorma Oficial Mexicana.

6.3 Almacenamiento6.3.1 Se deberá destinar un área para el almacenamiento temporal de los residuos

peligrosos biológico-infecciosos.Los establecimientos generadores incluidos en el Nivel I de la tabla 1 de esta Norma

Oficial Mexicana, quedan exentos del cumplimiento del punto 6.3.5 y podrán ubicar loscontenedores a que se refiere el punto 6.3.2 en el lugar más apropiado dentro de susinstalaciones, de manera tal que no obstruyan las vías de acceso.6.3.2 Los residuos peligrosos biológico-infecciosos envasados deberán almacenarse en

contenedores metálicos o de plástico con tapa y ser rotulados con el símbolo universal deriesgo biológico, con la leyenda "RESIDUOS PELIGROSOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS".

6.3.3 El periodo de almacenamiento temporal estará sujeto al tipo de establecimientogenerador, como sigue:

(a) Nivel I: Máximo 30 días.

(b) Nivel II: Máximo 15 días.

(c) Nivel III: Máximo 7 días.

6.3.4 Los residuos patológicos, humanos o de animales (que no estén en formol) deberánconservarse a una temperatura no mayor de 4°C (cuatro grados Celsius), en las áreas depatología, o en almacenes temporales con sistemas de refrigeración o en refrigeradores enáreas que designe el responsable del establecimiento generador dentro del mismo.

6.3.5 El área de almacenamiento temporal de residuos peligrosos biológico-infecciososdebe:

a) Estar separada de las áreas de pacientes, almacén de medicamentos ymateriales para la atención de los mismos, cocinas, comedores, instalacionessanitarias, sitios de reunión, áreas de esparcimiento, oficinas, talleres ylavanderías.

b) Estar techada, ser de fácil acceso, para la recolección y transporte, sinriesgos de inundación e ingreso de animales.

c) Contar con señalamientos y letreros alusivos a la peligrosidad de losmismos, en lugares y formas visibles, el acceso a esta área sólo se permitiráal personal responsable de estas actividades.

d) El diseño, construcción y ubicación de las áreas de almacenamientotemporal destinadas al manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos enlas empresas prestadoras de servicios, deberán ajustarse a las disposicionesseñaladas y contar con la autorización correspondiente por parte de laSEMARNAT.

e) Los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos que no cuenten con espacios disponibles para construir unalmacenamiento temporal, podrán utilizar contenedores plásticos o metálicos

92

para tal fin, siempre y cuando cumplan con los requisitos mencionados enlos incisos a), b) y c) de este numeral.

6.3.6 Los residuos peligrosos biológico-infecciosos podrán ser almacenados en centros deacopio, previamente autorizados por la SEMARNAT. Dichos centros de acopio deberánoperar sistemas de refrigeración para mantener los residuos peligrosos biológico-infecciososa una temperatura máxima de 4°C (cuatro grados Celsius) y llevar una bitácora deconformidad con el artículo 21 del Reglamento en materia de Residuos Peligrosos de la LeyGeneral del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente. El tiempo de estancia de losresiduos en un centro de acopio podrá ser de hasta treinta días.

6.4 Recolección y transporte externo6.4.1 La recolección y el transporte de los residuos peligrosos biológico-infecciosos

referidos en esta Norma Oficial Mexicana, deberá realizarse conforme a lo dispuesto en losordenamientos jurídicos aplicables y cumplir lo siguiente:

a) Sólo podrán recolectarse los residuos que cumplan con el envasado,embalado y etiquetado o rotulado como se establece en el punto 6.2 de estaNorma Oficial Mexicana.

b) Los residuos peligrosos biológico-infecciosos no deben ser compactadosdurante su recolección y transporte.

c) Los contenedores referidos en el punto 6.3.2 deben ser desinfectados ylavados Después de cada ciclo de recolección.

d) Los vehículos recolectores deben ser de caja cerrada y hermética, contarcon sistemas de captación de escurrimientos, y operar con sistemas deenfriamiento para mantener los residuos a una temperatura máxima de 4°C(cuatro grados Celsius).

Además, los vehículos con capacidad de carga útil de 1,000 kg o más debenoperar con sistemas mecanizados de carga y descarga.

e) Durante su transporte, los residuos peligrosos biológico-infecciosos sintratamiento no deberán mezclarse con ningún otro tipo de residuosmunicipales o de origen industrial.

6.4.2 Para la recolección y transporte de residuos peligrosos biológico-infecciosos serequiere la autorización por parte de la SEMARNAT. Dicho transporte deberá darcumplimiento con los incisos a), b), d) y e) del numeral 6.4.1 de esta Norma OficialMexicana.

6.5 Tratamiento6.5.1 Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físicos

o químicos que garanticen la eliminación de microorganismos patógenos y deben hacerseirreconocibles para su disposición final en los sitios autorizados.

6.5.2 La operación de sistemas de tratamiento que apliquen tanto a establecimientosgeneradores como prestadores de servicios dentro o fuera de la instalación del generador,requieren autorización previa de la SEMARNAT, sin perjuicio de los procedimientos quecompetan a la SSA de conformidad con las disposiciones aplicables en la materia.

6.5.3 Los residuos patológicos deben ser incinerados o inhumados, excepto aquellos queestén destinados a fines terapéuticos, de investigación y los que se mencionan en el inciso

93

4.3.2 de esta Norma Oficial Mexicana. En caso de ser inhumados debe realizarse en sitiosautorizados por la SSA.

6.6. Disposición finalLos residuos peligrosos biológico-infecciosos tratados e irreconocibles, podrán disponerse

como residuos no peligrosos en sitios autorizados por las autoridades competentes.6.7 Programa de contingenciasLos establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos y los

prestadores de servicios deberán contar con un programa de contingencias en caso dederrames, fugas o accidentes relacionados con el manejo de estos residuos.

7. Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales y con lasnormas mexicanas tomadas como base para su elaboración

7.1 Esta Norma Oficial Mexicana no concuerda con ninguna Norma Internacional por noexistir referencia en el momento de su elaboración, ni existen normas mexicanas que hayanservido de base para su elaboración.

8. Bibliografía8.1 Althaus H, Sauerwald M, Schrammeck E. Hygienic aspects of waste disposal Zbl Bakt

Mikr Hyg, I Abt Orig B. 1983; 178:1-29.8.2 Anglin AM Collmer JE. Loving TJ. Beltran KA. Coyner BJ. Adal K. Jagger J. Sojka NJ,

Farr BM. An outbreak of needlestick injuries in hospital employees due to needles piercinginfectious waste containers. Infect Control Hosp. Epidemiology 1995; 16:570-6.

8.3 Belkin NL. Medical Waste a minimal Hazard. Infect Control Hosp. Epidemiol 1993;13:75-76.

8.4 Brenniman GR. Allen RJ. Impact of repackaging hazardous (infectious) hosp.italwaste on the indoor air quality of a hosp.ital. Science of the Total Environment. 1993;128:141-9.

8.5 Birnaum D. Medical Waste Applied Epidemiology. Letters to the Editor. Infect ControlHosp. Epidemiol 1993; 14:7-8.

8.6 Cimino JA. Health and safety in the solid waste industry. Am J Public Health 1975;65:38-46.

8.7 Collins CH. Treatment and disp.osal of clinical and laboratory waste. Med Lab Sci1991; 48:324-31.

8.8 Crow S. Infectious waste. Infect Control Hosp. Epidemiology 1984; 5:149-50.8.9 Crow S. Dissolving the problem of infectious medical waste. Infect Control Hosp.

Epidemiology. 1996; 17:434-7.8.10 Daschner FD. Chemical Disinfection of medical waste. Infect Control Hosp.

Epidemiology 1993; 14:306.8.11 Daschner FD. Disinfection of Medical Waste. Letters to the Editor authors reply

Infect Control Hosp. Epidemiology 1993; 14:306.8.12 Daschner FD. The Hosp.ital and Pollution: Role of the Hosp.ital Epidemiologist in

Protecting the Environment. In Wenzel R. Prevention and Control of Nosocomial Infection.Third edition William & Wilkins USA 1997; pag. 595-605.

8.13 Decker MD and Schaffer W. The relationship between the Hosp.ital and theCommunity in Hospital Infection Bennnett JV and Brachman editors. Philadelphia 1998.Fourth edition Lypincott-Raven Press. pag 181-188.

8.14 Gardner JS, Favero MS. CDC Guideline for handwashing and hosp.italenvironmental control, 1985. Infect Control Hosp. Epidemiology 1986; 7:231-33.

8.15 Gerberding JL. Limiting the risks of health care workers. In Sande MA andVolberding PA. The Medical Management of AIDS. W.B. Saunders Company. United States.Fifth edition 1997; pag. 75-85.

8.16 Gerberding JL. Management of occupational exposures to blood-borne viruses, NEngl J Med 1995; 332:444-51.

94

8.17 G.P. Youmans P. y Paterson H. Sommers. Manual de Infectología. Ed.Interamericana McGraw-Hill 1982; pág. 15.

8.18 Henderson DK et al. Risk for occupational transmission of HIV-1 associated withclinical exposures. Ann Intern. Med 1990; 113:740-746.

8.19 Honeycutt TW. Disinfection off Medical waste. Infect Control Hosp. Epidemiol. 1993;14:305-6.

8.20 Infective Waste in Occupational Health; section seven in Friede A, O´Carrol PW,Nicola RM, Teustch MW. in CDC Prevention Guidelines. Williams and Wilkins USA, 1997;pag. 1266-70.

8.21 Jager E, Xander L, Ruden H. Hospital wastesl. Communication: microbiologicalinvestigations of hospital wastes from various ward of a big and of smaller hospitals incomparison to household refuse Zbl Hyg. 1989; 188:343-364.

8.22 Keene JH. Medical Waste: A Minimal Hazard. Infect Control Hosp. Epidemiol 1991;12:682-5.

8.23 Ley General de Salud publicada en el Diario Oficial de la Federación el 7 defebrero de 1984 (última reforma 4 de junio de 2002).

8.24 Makosfshy D. Cone JE. Installing needle disposal boxes closer to the bedsidereduces needle-recapping rates in hospital units. Infect Control Hosp. Epidemiol. 1993;14:140-4.

8.25 Mc Veigh P. OR nursing and environmental ethics. Medical Waste reduction, reuseand recycling. Todays OR-Nurse. 1993; 15:13-8.

8.26 Mose JR, Reinhaler F. Microbial contamination of hospital waste and householdrefuse. Zbl Bakt Mikr Hyg, I Abt Orig B. 1985:181-98-110.

8.27 Organización Panamericana de la Salud. Manual de Prevención y Control deInfecciones Hospitalarias en la serie HSP.-UNI/Manual Operativo PALTEX, 1996, 4: pág. 87-90.

8.28 Petithory JC. De Loye J. Guesnu M. Pariente P. Milgram M. Tardy M. Provoost JP.Prevention of AIDS transmission by syringes and needles in France and Africa. [French]Bulletin de l Academie Nationale de Medecine. 1989; 173(4):415-9.

8.29 Resnick et al. Stabillity and inactivation of HTLV III/LAV under clinical andlaboratory environments JAMA 1986; 255:1887-1891.

8.30 Rutala WA, Sarubbi FA. Management of Infectious Waste from Hospitals. InfectControl Hosp. Epidemiol 1983; 4:198-201.

8.31 Rutala WA, Weber DJ. Infectious Waste. N Engl J Med 1991; 325:58378-582.8.32 Rutala WC, Mayhall G. The Society for Hospital Epidemiology of America; Medical

Waste Infect Control Hosp. Epidemiology. 1991; 12:38-48.8.33 Strain BA and Groschel DHM. Laboratory Safety and Infectious Waste management.

In Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH editors. Manual of ClinicalMicrobiology. ASM Press Washington D.C. Fifth edition 1995; pag. 75-85.

8.34 Streed SA. The Medical Waste Condrum Revisted. Infect Control Hosp. Epidemiol1992; 13:385-6.

8.35 Thornton J. McCally M. Orris P. Weinberg J. Hosp.ital and plastics. Dioxinprevention and medical waste incinerators. Public Health Reports. 1996; 111:299-313.

8.36 Volkow P, Jacquemin B, Vilar-Compte D, Castillo JR. Contact with blood and bodyfluids of hospital syringes. Implications for regulated medical waste. Salud Pública deMéxico.

8.37 Volkow P. Rangel-Frausto S. Ponce de León Rosales S. Basura hospitalaria:comentarios sobre sus riesgos y su regulación. Enf Infec y Microbiol 1999; 19:1-4.

8.38 Weber DJ, Rutala WA. Environmental Issues and Nosocomial Infection in Wenzel R.Prevention and Control of Nosocomial Infection. Third edition William & Wilkins USA 1997;pag. 492-514.

95

8.39 Weinstein S, Kotilainen HR, Moore D Gantz, N. Microbiologic contamination ofhospital trash from patients on isolation precautions versus standard care. Am J Infect.Control 1988; 16:76.

8.40 Who/PEP/RUD/94.1. General. Managing Medical Wastes in Developing CountriesWorld Health Organization 1994.

8.41 Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Control Sanitario de laDisposición de Organos, Tejidos y Cadáveres de Seres Humanos publicado en el DiarioOficial de Federación el 20de febrero de 1985.

8.42 Censo de Universo de Trabajo 1999/INEGI/estimaciones CONAPO.9. Observancia de esta Norma9.1 La SEMARNAT, a través de la Procuraduría Federal de Protección al Ambiente y la

SSA, a través de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios en elámbito de sus respectivas atribuciones y competencias, vigilarán del cumplimiento de lapresente Norma Oficial Mexicana de conformidad con las Bases de Colaboración quecelebren entre SSA y SEMARNAT, mismas que se publicarán en el Diario Oficial de laFederación. Las violaciones a la misma se sancionarán en los términos de la Ley Generaldel Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, y su Reglamento en materia deResiduos Peligrosos, la Ley General de Salud y sus Reglamentos, así como los demásordenamientos jurídicos aplicables.

9.2 Los gobiernos del Distrito Federal, de los estados y de los municipios, podrán realizaractos de vigilancia para la verificación del cumplimiento de esta Norma Oficial Mexicana,previa la publicación en el Diario Oficial de la Federación de los Acuerdos de Coordinaciónque se celebren con la SEMARNAT.

9.3 Dentro del marco de los Acuerdos de Coordinación para la Descentralización Integralde los Servicios de Salud, las entidades federativas verificarán el cumplimiento de estaNorma Oficial Mexicana.TRANSITORIOS

PRIMERO.- Provéase la publicación de esta Norma Oficial Mexicana en el Diario Oficialde la Federación.

SEGUNDO.- La presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor a los 60 díasposteriores al de su publicación en el Diario Oficial de la Federación.

TERCERO.- Los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos deben cumplir con la fase de manejo señalada en el punto 6, a los 90 díasposteriores al de la entrada en vigor de la presente Norma, tiempo en el cual seguirásurtiendo sus efectos legales en lo conducente la NOM-087-ECOL-1995.

CUARTO.- La presente Norma Oficial Mexicana ABROGA a su similar NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento,recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atención médica, publicada enel Diario Oficial de la Federación el 7 de noviembre de 1995 y su aclaración publicada enel citado órgano informativo el 12 de junio de 1996.

México, Distrito Federal, a los veintidós días del mes de enero de dos mil tres.- ElPresidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Medio Ambiente y RecursosNaturales, Cassio Luiselli Fernández.- Rúbrica.- El Presidente del Comité ConsultivoNacional de Normalización, de Regulación y Fomento Sanitario, Ernesto Enríquez Rubio.-Rúbrica.APENDICE NORMATIVOSIMBOLO UNIVERSAL DE RIESGO BIOLÓGICO

RESIDUOS PELIGROSOS

BIOLOGICO–INFECCIOSOS


96


97

Anexo 3

Escala de MacFarland

La escala de MacFarland es una serie de patrones de turbidezpreviamente calibrados. Consiste en 10 tubos de vidrio cerradosherméticamente que contienen suspensiones de partículas de sulfato debario o látex que permiten la comparación visual de la turbidez delprecipitado con la densidad bacteriana (ver tabla 15). Para cada cepabacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cadatubo y la masa o la concentración de bacterias (en células/mL) quegenera una turbidez similar. Comercialmente se pueden encontrardisponibles y generalmente incluyen una tarjeta de Wickerham, la cualcontiene líneas paralelas en negro como se observa en la Fig.5

El estándar de sulfato de MacFarland (22), se prepara mezclando:0.54 mL de cloruro de bario 0.048 M (1.175 p/v de cloruro de bariodihidratado) con 99.5 mL de H2SO4 al 1% v/v se debe mantener agitaciónconstante para mantener la suspensión. Un estándar de 0,5 McFarlandes equivalente a una suspensión de bacterias que contienen entre 1 x 108

y 2 x 108 UFC / ml de E. coli.

Verificar la densidad correcta del estándar midiendo la absorbanciade la turbidez, en un espectrofotómetro a 625 nm, el rango deabsorbancia debe ser de 0,08 a 0,13 para el estándar de 0.5 deMacFarland. Se debe tapar bien el tubo y guardarlo en un lugar oscuro atemperatura ambiente.

El uso del estándar de McFarland en el procedimiento de Kirby-Bauer

Para la prueba de susceptibilidad siguiendo el procedimiento deKirby-Bauer (23), la suspensión bacteriana del organismo de pruebadeber ser similar al estándar de 0,5 McFarland.

La preparación del inóculo en un tubo se debe realizarsuspendiendo las colonias bacterianas en solución salina y comparandola suspensión resultante con el estándar de 0.5 MacFarland. Estacomparación se realiza con la tarjeta de Wickerham (en una área bieniluminada) a no más de 1 pulgada de la superficie de esta, observando através de las líneas ambas suspensiones. Si la suspensión de bacteriasparece más diluida que el estándar de 0.5 MacFarland, se deben

98

adicionar más colonias bacterianas, si la suspensión tiene un aspectomás denso se agrega solución salina con el fin de diluir la suspensión a ladensidad adecuada.

Fig. 5Estándares de MacFarland (de izquierda a derecha) 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, situados frente a una tarjeta de

Wickerham. Se utilizan para preparar las suspensiones bacterianas a una turbidez específica.

Tabla. 15Preparación de los estándares de MacFarland

Estándar de Sulfato de Bario

TuboNúm.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BaCl21% (mL)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4

1% (mL)9.9. 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

99

Anexo4

Esterilización por autoclave

La esterilización comprende todos los procedimientos físicos,mecánicos y químicos, que se emplean para destruir, inactivar o retenergérmenes en general y patógenos en particular.

Dentro de los métodos físicos más empleados está la esterilizaciónpor calor húmedo, la técnica utilizada para la preparación de los mediosde cultivo (24).

Calor húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización ycoagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dosrazones:

El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructurasbiológicas (DNA, RNA, proteínas, etc.) son producidas porreacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversaspodrían dañar a la célula a causa de la producción de productostóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de lasproteínas se estabilizan mediante uniones de puentes de hidrógenointramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotas por el aguaa altas temperaturas.

El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calormucho más elevado que el aire. Por lo que, los materiales húmedosconducen el calor mucho más rápidamente que los materiales secosdebido a la energía liberada durante la condensación.

Antecedentes: El primer antecedente fue la marmita de Papin en1681, semejante a una olla a presión que permitía mantener el agua porencima de los 100 °C.

En 1830 William Henry, médico de Manchester; trataba ropa y otrosutensilios provenientes de personas infectadas exponiéndolos en unavasija a vapor recalentado y aire caliente obteniendo el material libre deinfección.

Pasteur en 1876, Koch y Wolffhugel en 1881 dan los fundamentosde la esterilización por calor seco y calor húmedo: 30 minutos a 110 –

100

120 °C de exposición al vapor eran equivalentes a una hora de calor secoa 130 – 150 °C.

En 1884 aparece en París con el nombre de Chamberland (25) unequipo para usar en laboratorio, el que luego se emplearía en todos loslaboratorios biológicos.

El autoclave es el aparato comúnmente utilizado en loslaboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formenemulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturasmayores a 100 °C. El modelo más usado es el de Chamberland. Unatemperatura de 121 °C (una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo deexposición mayor a 15 minutos sirve para destruir organismosformadores de esporas.

Fig. A 4.1Equipo de Autoclave

Fig. 6Equipo de Autoclave

Equipo:

Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externametálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o poruna resistencia eléctrica.

101

La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de broncesujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tresorificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en formade robinete (también llamado espita) y el tercero, para una válvula deseguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento y método:

1. Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel noalcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla ocanasta de metal.

2. Se cierra asegurando la tapa, ajustando las mariposas deseguridad y se enciendo el termostato, dejando abierta laválvula de escape hasta que todo el aire se desaloje ycomience la salida de vapor en forma de chorro continuo yabundante.

3. Se cierra la válvula de escape y se espera hasta que llegue ala temperatura adecuada. A partir de allí se cuenta el tiempode esterilización, luego del cual se debe esperar al descensode la temperatura para abrir la válvula de escape y la tapa delautoclave nuevamente.

Este proceso de esterilización es el que mejor resultados da enMicrobiología. El vapor de agua a fuerte presión actúa a mayorestemperaturas. La tabla 16 muestra la temperatura que alcanza el equipoa determinadas atmósferas de presión.

Tabla 16Influencia de la descarga incompleta de aire en la temperatura del autoclave (26)

Presión[atm]

Temperatura[°C]

Descarga completa delaire

Descarga de 2/3 delaire

Descarga de 1/2 delaire

Sin descarga delaire

1/3 109 100 90 72

2/3 115 109 100 90

1 121 115 109 100

4/3 126 121 115 109

5/3 130 126 121 115

2 133 130 126 121

102

Tiempo de esterilización en autoclave: Del tiempo, temperatura ypresión usados en la esterilización depende el éxito alcanzado.Generalmente los datos presión y temperatura están establecidos, y elúnico factor que se varía es el tiempo. Los materiales necesitan diferentestiempos de esterilización dependiendo de su textura, porosidad, y otrascaracterísticas propias de cada material. Algunos materiales como elhule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal quirúrgiconecesitan más.

Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bienordenados, para que haya buena penetración de vapor en el material.

No incluir dentro del mismo paquete material con diferentestiempos de esterilización.

El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar elmantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durantesu almacenamiento.

Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que hayauna libre circulación de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclavehasta sobrecargarlo).

Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipienteno poroso de material seco. Esto permite un pronto desplazamiento delaire y un rápido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y sucontenido. También facilita el secado.

Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales.

La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes bocaabajo u horizontales.

103

CONCLUSIONES

La información recopilada en este manual sobre una técnica deaislamiento de bacterias en placas de agar, cuenta con los fundamentosteóricos, una guía para su preparación la cual involucró no solorecomendaciones de fabricantes, sino también las recomendaciones depersonal profesional en esta área e información sobre el control decalidad necesario en este procedimiento.

Es necesario señalar que solo se mencionaron algunos de loscientos de medios de cultivo en agar sólido empleados en el áreamicrobiológica, pero con información detallada de cada uno de ellos, asícomo su interpretación, esto con la finalidad de que el alumno tengaherramientas necesarias y al docente le permita tener una guía en la cualapoyarse, en el proceso de enseñanza y aprendizaje práctico en ellaboratorio de Microbiología General I.

104

REFERENCIAS

1. Stainer RY, Ingraham LJ, Wheelis ML, Painter PR. The microbialworld. 5th ed. Englewood cliffs, New Jersey: Prentice–Hall; 1986.

2. Beck RW. A chronology of microbiology in historical Context.Washington D.C.: ASM; 2000.

3. Crocker J, Burnett D. La ciencia del diagnóstico de laboratorio.2ª ed. México D.F.: McGrawHill Interamericana; 2007

4. Brooks FG, Carroll CK, Butel JS, Morse AS. Microbiologíamédica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 19ª ed. México: ElManual Moderno; 2008.

5. Bauer JD. Análisis clínicos; métodos e interpretación. Barcelona:Reverté; 1986.

6. Pommerville JC. Alcamo’s fundamentals of microbiology. 7th ed.Sudbruy, Massachusetts: Jones and Bartlett; 2004.

7. Forbes AB, Sahm FD, Weissfeld SA. Bailey and Scott diagnósticomicrobiológico. 11ª ed. Buenos Aires, Argentina: MédicaPanamericana; 2004.

8. Koneman WE, Allen SD, Dowell VR, Janda WM, Sommers HM,Winn WC. Diagnóstico Microbiológico. 3ª ed. México: MédicaPanamericana; 1998.

9. Pollack RA. Laboratory exercises in microbiology. 3rd ed.Hoboken, New Jersey: J. Wiley; 2009.

10. Medios de Cultivo Deshidratados y Preparados para UsoMicrobiológico. [Internet]. 2010 [consultado 2010 Ene 5];Disp.onible en: http://www.dibico.com/productos.php?t=med&m=d&IdCat=1

11. DifcoTM & BBLTM Manual of Microbiological Culture Media.[Internet]. 2009 [consultado 2010 Ene 9]; Disponible en:http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/difcoBdManual.asp.

12. Manual BIOXON de medios de cultivo Vol. 1 y 2(editores).México:1990

13. Atlas RM. Handbook of microbiological media. 2th ed. BocaRaton: Lawrence C. Parks; 1997.

14. Gutiérrez R A. MULTIBAC-I.D. Instructivo (editores). MéxicoD.F.: Investigación Diagnóstica; 2008.

15. Agar Tioglicolato [Internet]. [consultado 2011 May 30];Disponible en:www.biosystems.com.br/arquivos/productos/684pdf.

16. López LM, Balbuzano DA, Mesa HM, Fernández VA.Obtención de sustratos fluorogénicos y cromogénicos para la

105

industria farmacéutica cubana. [Internet]. 2009 [consultado2010 Nov 10]; Disponible en:http://files.sld.cu/boletincnscs/files/2009/03/resumen-cromogénicos.pdf

17. Arellano PB, González MJ, Gutiérrez RA, Martínez FM,Romero DG, Saucedo CJ. Manual de prácticas para ellaboratorio de Microbiología general I de la carrera de QFB 6 °semestre. México D.F.: Facultad de Estudios SuperioresZaragoza UNAM; 2005.

18. Ramírez GR, Manual de Prácticas de Microbiología General.México D.F.: Facultad de Química UNAM; 2006.

19. Farmacopea de los Estados Unidos de América USP. 30/2007Formulario nacional: 25. Vol. I. Baltimor: City Press; 2007.

20. Hicks GJ. Bioquímica. 2ª ed. México: McGraw HillInteramericana; 2006.

21. MacFaddin JF. Pruebas Bioquímicas para la Identificación deBacterias de Importancia Clínica. 3ª ed. Buenos Aires: MédicaPanamericana; 2003.

22. Krisher K, Callihan DR, Jones RN, Lupers DC, Miller JM,Sharp SE. Quality Control for Commercially PreparedMicrobiological Culture Media; Approved Standard. Vol 24,Num 19. 3th ed. [Internet]. 2004 [consultado 2010 Jul 9];Disponible en : http://www.clsi.org/source/orders/free/m22-a3.pdf

23. Hudzicki J. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility TestProtocol. [Internet]. 2009 [consultado 2010 Jun 7]; Disponible en:

http://microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3189-kirby-bauer-disk-diffusion-susceptibility-test-protocol.

24. Seminario de esterilización. [Internet]. 2009 [consultado 2011jun 9]; Disponible en:http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/Seminarioesterilizacion.htm

25. Ern E. Téchnique de Sterilisation á lúsage despharmaciens.Paris: Vigot frères;1950. [Internet]. 2005 [consultado 2011 jun9]; Disponible en:www.archive.org/stream/techniquedestri00grgoog/techniquedestri00grgoog_djvv.txt.

26. Botta R. Métodos de esterilización en el laboratorio químico.[Internet]. 2004 [consultado 2011 jun 10]; Disponible en:http://www.monografias.com/trabajos24/esterilizacion-laboratorio/esterilizacion-laboratorio.shtml

Guía para la preparación y uso de medios de Cultivo en placa para el Laboratorio de Microbiología...

Documents

Transcript of Guía para la preparación y uso de medios de Cultivo en placa para el Laboratorio de Microbiología...