GUIA_BIOQUIMICA_2012

8/20/2019 GUIA_BIOQUIMICA_2012

1/36

1

UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

GUIA DE PRÁCTICAS

BIOQUIMICA

2012-1

INTRODUCCION


2/36

2

La Bioquímica es una de las ciencias modernas que mayor auge ha alcanzado en losúltimos tiempos, es el arma más poderosa con que se cuenta para interpretar el fenómenobiológico, con una profunda incidencia en numerosas áreas incluyendo la medicina

Cada organismo, en realidad cada macromolécula, tiene propiedades únicas. Unorganismo vivo es la quinta esencia de un sistema sinérgico; esto es, el todo es más quela suma de sus partes. Sin embargo, como la complejidad de los fenómenos bioquímicosimposibilita el análisis de todo el sistema, la bioquímica ha intentado descubrir lossecretos de la función celular estudiando sus partes aisladamente. Por lo tanto, por

necesidad, la bioquímica ha sido siempre una ciencia deductiva

La presente guía de práctica comprende los aspectos básicos necesarios y laaplicación experimental de los conceptos fundamentales.


3/36

3

DISPOSICIONES GENERALES

La presente Guía regula las prácticas de laboratorio en la sede para losestudiantes de la EAPO

Los usuarios de laboratorio, deberán seguir estrictamente, las reglas deseguridad establecidas en el reglamento y aquellas que les recomiende elprofesor responsable

Pasados quince minutos de la iniciación de la práctica no se permitirá elacceso de estudiantes al laboratorio.

Ninguna práctica se realizará sin la presencia del profesor.

Podrán ser retirados de la práctica los estudiantes que incumplan el

reglamento estudiantil

En ninguna circunstancia ingiera alimentos o tome bebidas en ellaboratorio.

El estudiante no podrá recibir visitas de otras personas ajenas allaboratorio durante la práctica.


4/36

4

PRACTICA Nº1

BIOSEGURIDAD

OBJETIVO:

Proveer al alumno de conocimientos básico sobre Bioseguridad que les permitan efectuaruna detección de los riesgos y prevención de los mismos

FUNDAMENTO

La Bioseguridad es la aplicación del conocimiento, técnicas y equipamiento paraprevenir la exposición del personal, el laboratorio y el medio ambiente de agentespotencialmente infecciosos.

Las Medidas de bioseguridad definen las condiciones bajo los cuales los agentesinfecciosos se pueden manipular con seguridad.

El objetivo de las medidas de Bioseguridad es reducir la exposición de las personas quetrabajan en el laboratorio.

La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo demicroorganismo y la manipulación a la que es sometido. Por ello es básico:

1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.

2. Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.

3. Conocer el equipamiento del laboratorio.

4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.

5. Conocer las normas relacionadas con la seguridad biológica.

Para que se produzca un accidente por agente biológico deben concurrir básicamentecuatro elementos:

Un huésped susceptible

Un agente infeccioso

Una concentración suficiente de éste

Una ruta de transmisión apropiada.

De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisión.

Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la inoculacióndirecta, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la percutánea y el contactodirecto con la piel o las mucosas también son posibles.


5/36

5

El Centro para la Prevención y control de Enfermedades (CDC) estableció en 1995 elconcepto de Precauciones Estándar, definiendo a un conjunto de medidas que deben serutilizadas bajo el principio que todo paciente está potencialmente infectado y que todossus fluidos u objetos contaminados con éstos que han sido utilizados en su atención sonpotencialmente infectantes, denominando a este concepto UNIVERSALIDAD. Por lo que

las medidas de Bioseguridad deben aplicarse SIEMPRE que se tenga contacto conpacientes sin importan si tienen o no un diagnostico de enfermedad Infecciosas.

Estas son:

1.- Lavado de manos.

2.- Adecuada ventilación e iluminación natural de Ambientes.

3.- Uso de elementos de barrera según los procedimientos: Uso de guantes,mascarillas, mandiles, batas de protección, lentes protectores, etc

4.- Limpieza, desinfección, esterilización del instrumental y material médico.5.- Manejo y eliminación de objetos afilados o punzantes.

6.- Manejo y eliminación de desechos y de sus recipientes.

7.-Desinfección concurrente y limpieza terminal.

8.- Manejo de accidentes por contacto de sangre o secreciones.

9.- Manejo de accidentes en personal de salud.

10.- Aislamiento y / o flujos para la atención de pacientes con Enfermedades

Infecciosas.

1.- LAVADO DE MANOS

Está demostrado que el lavado de manos es la mejor medida para prevenir la transmisiónde enfermedades no solo dentro del ambiente de trabajo de un laboratorio sino tambiénen la vida diaria.

Las superficies de las manos tienen pliegues, folículos pilosos, glándulas sebáceas,

sudoríparas, y uñas que contienen microorganismos.Hay flora residente de la piel que convive con nosotros, y flora transitoria, que se adquieretocando elementos o superficies y que luego las manos transportan. Es imposibledeterminar cuantos virus, bacterias, hongos, y otros microorganismos tenemos en la pielde las manos. Se calcula que las concentraciones de microorganismos resistentes crecenen billones por mililitro en secreciones respiratorias o en la materia fecal en pocos días.Por eso es necesario lavarlas continuamente antes y después de cada procedimiento.


6/36

6

Técnica del lavado de manos

Siempre retirar anillos y pulseras; las uñas deben estar cortas y sin esmalte; lasmangas de la ropa o de los uniformes deben ser cortas.

Las manos deben lavarse con jabón común o antiséptico o con solución alcohólica, sino están visiblemente sucias, en las siguientes ocasiones:

1. Antes de tocar al paciente2. Después del contacto con alguna fuente de microorganismos, aunque se hayan

utilizado guantes (Ej: fluidos corporales, piel no intacta, mucosas y objetos delmedio ambiente)

El lavado de manos antiséptico está indicado sin discusión en las siguientes ocasiones:

1. Antes de realizar un procedimiento invasivo.2. Cuando es importante reducir el número de flora residente, además de la

transitoria.

Técnica

Mojar la mano con agua corriente, si se utiliza jabón líquido.Si el jabón es en barra, tomarlo con la mano seca.

Aplicar jabón y distribuirlo por toda la superficie de la mano luego con los dedosentrelazados.

Frotar el dorso de la mano derecha con la izquierda y viceversa. Frotar el primer dedo de ambas manos Frotar las uñas ambas manos en la palma opuesta. Enjuagar profundamente. Secar con papel toalla. Serrar el caño con el papel toalla. Descartar el papel toalla.

Técnica de lavado seco

Aplicar una dosis de solución alcohólica. (Isopropílico o etílico 60% - 70% conemolientes) Distribuirla por toda la superficie de la mano y dedos aproximadamentepor 15 segundos. Friccionar hasta que la piel de las manos quede seca. La piel de lasmanos no debe quedar mojada con alcohol; si es así, la asepsia no fue efectiva. En

lugares donde no hay fuentes o suministro de agua, las soluciones alcohólicas estánindicadas y alcanzan una buena acción antiséptica.


7/36

7

USO DE ELEMENTOS DE BARRERA

GUANTES

Los guantes deben cambiarse entre procedimientos sucios y limpios realizados en el

mismo paciente.

Cuando hay posibilidad de contacto con sangre y otros fluidos corporales. Cuando tiene las manos lastimadas, con heridas o con eczemas. Los guantes deben ser cambiados entre cada paciente. Los guantes NUNCA deben ser lavados y rehusados en otros pacientes, ni con el

mismo paciente. Con los guantes puestos no se deben tocar superficies del ambiente antes o

después de tocar al paciente. Los guantes deben protegerlo de los fluidos corporales. Siempre lave sus manos después de usar guantes, aún si estos permanecen

intactos y sus manos no se mancharon con fluidos corporales; las bacterias de la

piel se desarrollan con facilidad en el calor y la humedad. Algunos estudios han indicado que los microorganismos no siempre se remueven

del guante a pesar del lavado, fricción con antiséptico y secado. Además, el lavadodel guante disminuye la integridad del mismo.

MANDILONES

Los mandilones se utilizan para proveer una barrera efectiva de protección yreducir las oportunidades de transmisión de microorganismos por la sangre ofluidos corporales.

Es importante que el mandilón sea de material resistente a los líquidos, sobre todoen las mangas y pecheras.

Se debe utilizar siempre que se este realizando procedimientos invasivos como latoma de muestra sanguínea. Se tendrá en cuenta retirarlo antes de salir del áreade trabajo y lavar las manos con soluciones antisépticas inmediatamente.

LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN

Se refiere principalmente a las técnicas, procedimientos y sustancias que seemplean para esterilizar Instrumental médico que se va a utilizar para diagnosticoo procedimientos invasivos en pacientes.

En los procedimientos rutinarios de Laboratorio, no se debe reutilizar materiales,

todo debe realizarse en material descartable, ya que NO existen técnicasestandarizadas para reutilizar láminas, recipientes de muestras, tubos para tomade muestras sanguíneas, etc.

Para el proceso de muestras microbiológicas, como tubos y placas, se tendrá queseguir procedimientos que se desarrollaran más adelante.


8/36

8

Definiciones

Desinfectante. Sustancia química que destruye los microorganismos y que seaplica sobre material inerte sin alterarlo de forma sensible

Antiséptico. Sustancia química de aplicación tópica sobre tejidos vivos (piel intacta,mucosas, heridas, etc.), que destruye o inhibe los microorganismos sin afectar

sensiblemente a los tejidos donde se aplica Limpieza. Empleo de un procedimiento fisicoquímico encaminado a arrastrar

cualquier material ajeno al objeto que se pretende limpiar. Desinfección de bajo nivel. Empleo de un procedimiento químico con el que se

pueden destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, algunosvirus y hongos, pero no el Mycobacterium tuberculosis ni las esporas bacterianas.

Desinfección de nivel intermedio. Empleo de un procedimiento químico con el quese consigue inactivar todas las formas bacterianas vegetativas, el complejoMycobacterium tuberculosis, así como la mayoría de los virus y hongos, pero queno asegura necesariamente la destrucción de esporas bacterianas.

Desinfección de alto nivel. Empleo de un procedimiento químico con el que seconsigue destruir todos los microorganismos, excepto algunas esporasbacterianas.

Esterilización. Empleo de un procedimiento fisicoquímico dirigido a destruir toda laflora microbiana, incluidas las esporas bacterianas, altamente resistentes.

Dentro de los agentes químicos se diferencia entre antisépticos, que son losgermicidas de baja toxicidad y que por lo tanto se pueden emplear sobre la piel yotros tipos de tejidos; y los desinfectantes, entendidos como germicidas de mayortoxicidad y que se emplean sobre los objetos, ambiente y superficies inanimadas.

Dependiendo del nivel de bioseguridad del Laboratorio se utilizaran diferentesmétodos de esterilización.

Manejo de material de vidrio Reciclable

CUESTIONARIO

1.- Cuales son los principios de bioseguridad?

2.- Explique la eliminación de desechos?

3.- Esquematice el lavado de manos


9/36

9

PRACTICA N°2

MATERIALES DE LABORATORIO

OBJETIVO

Demostrar y explica el uso correcto de los materiales y equipos de uso rutinario enun laboratorio. Aprender el manejo correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un

laboratorio.

FUNDAMENTO

Para realizar con éxito las practicas programadas para el curso, se requiere dediferentes materiales de laboratorio como son pipetas, fiola, probeta y otros. Así mismoel uso de equipos e instrumentos como potenciómetro, balanza, espectrofotómetro yotros. Estos materiales y equipo tienen condiciones básicas para su uso como el estar

calibrados, limpios y que sea el material correcto según nuestras necesidades.

PIPETAS:

Son materiales graduados que se emplean para medir o trasvasar volúmenes de líquidos.Primero deberá identificar si es una pipeta terminal (graduación llega a la punta) o noterminal (graduación finaliza antes de la punta). Luego identificar el volumen que puedemedir con la pipeta (capacidad de la pipeta).

Modo de uso: Introduzca la pipeta en el líquido sin tocar el fondo del recipiente, aspirar

con la ayuda de una propipeta succionando suavemente hasta el volumen que requiere,tapar la pipeta CON EL DEDO INDICE, si se sobrepaso el volumen relaje lentamente sudedo y deje salir el líquido hasta que logre enrazar el líquido (nivel deseado).

El profesor le enseñará el correcto uso de las pipetas.

MICROPIPETAS:

Son pipetas muy especiales que se emplean para medir volúmenes muy pequeños en elrango de los microlitros (uL), pueden medir un volumen fijo o medir diferentes volúmenes(regulables) se emplean con un aditamento en la punta llamado TIP o puntera, que esespecífico según la capacidad de la micropipeta.

Modo de uso: Coloque el tip correspondiente, ajústelo, regule el volumen a medir girandoel mando del émbolo, coloque el pulgar atravesado sobre el mando de la micropipeta,presione suavemente e introduzca el tip al líquido a medir, suelte suavemente el émbolo yobserve que el líquido llene el tip, para depositar el contenido presione el émbolocompletamente y el líquido será expulsado del tip. Para eliminar el tip usado presione elmando expulsor. RECUERDE QUE CUANDO SE EMPLEA CUALQUIER MUESTRABIOLOGICA EL TIP DEBE SER ELIMINADO DENTRO DE UN DESINFECTANTE COMOLA LEJIA O SIMILAR.


10/36

10

El profesor le enseñará el correcto uso de las micropipetas y demás materiales y equiposde laboratorio.

Cuestionario

1. Los materiales de vidrio son elaborados en vidrio de Borosilicato, describa lascaracterísticas de este material.2. Describa los equipos que debe emplear para preparar soluciones.3. El lavado es una parte importante del trabajo en el laboratorio, describa la formacorrecta para el lavado de materiales de vidrio.4. Describa cada uno de los materiales mostrados durante la práctica y explique suuso.


11/36

11

PRACTICA Nª3

pH

FUNDAMENTO

El concepto de pH fue dado a conocer por primera vez en 1909 por SORENSEN, y lodefinió como el logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrógeno es decir:

pH = - log (H) ó = [H + ] = 10 – pH ó = - log ( 1 )

H

Donde la concentración del hidrogenión es dada en unidades moles.

La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y más

utilizados en bioquímica puesto que esta medida determina características notables de laestructura y la actividad de las macromoléculas biológicas, por consiguiente, la conductade las células y de los organismos.

CALCULO DEL PH DE UNA SOLUCION:

Procedimiento.-

Consiste en calcular la concentración de iones hidrógeno [H+]

Calcular el logaritmo de base 10 de [H+]

El pH es el logaritmo negativo que ha sido encontrado en (1)

Soluciones Buffer, tampón o amortiguadores :

Son aquellas soluciones que se caracterizan por ser mezclas de ACIDOS y BASESDEBILES y sus sales, las cuales impiden las variaciones bruscas de pH; permitiendo queel cambio de este no sea el más mínimo.

APLICACIONES:

En organismos vivientes, por ejemplo:Para conocer las alteraciones producidas en la composición química de la sangre.

Para conocer las alteraciones del pH de otros líquidos biológicos: saliva, lagrimas, sudor,líquido cefalorraquídeo, etc.En ciertos fenómenos fisiológicos: respiración, aplicación de enzimas (catalizadores), etc.En química:Para determinar el pH de una solución.Para determinar el punto final de una titulaciónDemostración: reacciones químicas con liberación o consumo de iones H +.Otros


12/36

12

Competencias

Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH y la acción de los sistemas buffer. Utiliza las técnicas para medir el pH.

METODOS DE DETERMINACION DEL pH:

Existen varios procedimientos:Mediante indicadoresMediante cintas o papel de pH universalMediante el potenciómetro o pHmetro

DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES:

Indicadores.-Son soluciones o cuerpos químicos que se agregan a los líquidos paradosar, con el fin de ver el momento preciso del término de la reacción; manifestándosepor la aparición, desaparición o modificación del color. Estas sustancias químicaspertenecen al grupo de los ácidos y bases débiles. Según Glaser, se clasifican en tresgrupos:

1ero: Para valorar bases débiles con ácidos fuertes. Ejemplo: anaranjado de metilo, rojode congo, etc.2do: Para valorar bases y ácidos fuertes. Ejemplo : Tornasol, paranitrofenol, etc.3ero: Para valorar ácidos débiles con bases fuertes. Ejemplo: fenolftaleina, etc.

Aplicación:1) En determinar el pH de una solución deseada.2) En determinar el punto final de una titulación (volumétrica)3) En determinar reacciones químicas con liberación o consumo de H

Comprende:Elección de un indicador para una titulación, para lo que se debe tener en cuentaconceptos básicos sobre disociación de sales, la que está sujeta a una constante (pK) y auna variación de colores dependiente a su mayor o menor disociación de pK; el pK seemplea y se define como el log (1/Ka) ó el –log Ka para definir la fuerza de un ácido o deuna base.

Un ácido cuya constante de ionización sea

10 –4 tiene un pKa de 4. De igual forma pKb es – log Kb, para cualquier constante deequilibrio Kb. (Ka constante de ionización de un ácido; Kb, constante de ionización de unabase).

Determinación del pH mediante el uso del papel indicador :

El papel Indicador:

Es un papel especial que contiene absorbidos indicadores en serie o a lo largo, que alponerse en contacto con la solución a evaluar da un color que corresponde al pHaproximado de la solución problema. En el comercio existen diferentes tipos de papeles


13/36

13

indicadores, por ejemplo: el papel indicador universal (pH de 1 a 10); PH – YDRIEN papel(pH del 10 a 14)

Podemos observar la siguiente tabla de indicadores:

TABLA DE INDICADORES :

INDICADOR Pk LIMITES COLOR

Azul de timol 1.50 0.5 – 2.8 rojo – amarillo

Azul de bromofenol 3.98 3.0 – 5.0 amarillo – azul

Verde de bromofenol 4.68 3.7 – 5.7 amarillo - azul

Anaranjado de metilo 4.00 3.5 – 4.5 anaranjado –amarillo

Rojo de clorofenol 5.98 5.0 – 7.0 amarillo – rojo

Púrpura de bromocresol 6.30 5.3 – 7.3 amarillo – púrpura

Azul de bromotimol 7.00 6.0 – 8.0 amarillo – azul

Rojo de fenol 7.90 6.9 – 8.9 amarillo – rojo

Fenolftaleína 9.20 8.2 – 10.2 incoloro – rojo

Rojo de metilo 5.10 4.4 - 6.0 rojo – amarillo

DETERMINACIÓN DE pH MEDIANTE EL POTENCIÓMETRO O pHMETRO:Fundamento.-

Se fundamenta en la generación de una diferencia de potencial que se establece cuandose emplean dos soluciones ioniozadas de diferente concentración en las cuales se hacepasar una corriente eléctrica, es decir la diferencia de potencial es proporcional a ladiferencia de concentración(es) entre las soluciones.

Partes que lo constituyen.-

1.-Electrodo de vidrio: Es un pequeño bulbo de vidrio soldado a un vástago de vidrio deborosilicato (pirex) dentro de él existe una solución de KCl 0.1N en la que está sumergidoun electrodo de referencia interna que puede ser de plata cloruro de plata o de Calomell,


14/36

14

quedando aislada dicha celda mediante un cierre hermético constituido por un dieléctricode cera o plástico y un casco de metal o plástico.2.-Un electrodo de referencia externa de Calomell3.-Un tablero de control con diales que regulan el funcionamiento del equipo.

PARTE OPERATIVA:

La calibración consiste en darle información al equipo mediante el uso de estándares depH, o sea soluciones cuyo pH es conocido y certificado.Pasos previos: Verificar la instalación correcta del equipo, su conexión con la corrientegeneral. Calibrar la temperatura ambiente con la del equipo, lavando repetidas veces conagua destilada y secando los electrodos con papel filtro.Retirar cuidadosamente el jebe de seguridad del electrodo de vidrio.

La aplicación se realiza luego, enjuagando los electrodos con agua destilada, secándoloscon papel absorbente y sumergiéndolos en la solución problema, obteniéndose su pH quese leerá en el lector en una escala de 0 a 14.

Actualmente se usan pHmetros portátiles, que funcionan con baterías o con una corriente

alterna de 100 a 200 voltios, digitales, otros.DESCRIPCION:

1. Determinación del pH:

El alumno deberá medir el pH de las diferentes muestras solicitadas por el profesor(leche, gaseosas, yogurt, saliva, orina, otras) empleando los métodos descritos en lapráctica.

2. Titulación Acido-Base:

2.1.-Titular una base (NaOH 0.1N) con un ácido:

Colocar en un Beacker 10 mL de NaOH (hidróxido de sodio) 0.1N y tres gotas defenolftaleínaEnrazar una bureta de 25mL con H2SO4 (ácido sulfúrico) 0.1N

Comience a titular dejando caer gota a gota el H2SO4 0,1N sobre NaOH 0,1N, agitandoconstantemente hasta que cambie el color.

Anotar la cantidad (mL) de H2SO4 0,1N que se gastó en la titulación (gasto)

2.2.-Titular un ácido (H2SO4 0,1 N) con una base:

Colocar en un Beacker 10mL de H2SO4 0,1N y tres gotas de anaranjado de metilo.

Enrazar una bureta de 25mL con NaOH 0,1N.

Comience a titular dejando caer gota a gota el NaOH 0,1N sobre el H 2SO4 0,1N, agitandoconstantemente hasta que cambie el color.

Anotar la cantidad (mL) de NaOH 0,1N que se gastó en la titulación (gasto)


15/36

15

3. Cambios de pH en un sistema Buffer:

3.1. El agua como buffer

Colocar en un beaker, 10 mL de agua destilada y tres gotas de anaranjado de metilo.

Enrasar una bureta de 25mL con HCl 0,1N.

Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0,1N, agitando constantemente hastaque cambie el color.

Anotar la cantidad (mL) de HCl 0,1N que se el gastó en la titulación.

3.2. Un ácido débil y su respectiva sal en diferentes proporciones:

Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,5 mL de ácido acético 0.1N, 0,5mL deacetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.

Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.

Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hastaque cambie el color.

Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación.

3.3. Un ácido débil y su respectiva sal en iguales proporciones:

Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,0mL de ácido acético 0.1N, 1,0mL deacetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.

Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hastaque cambie el color.

Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación.

Cuestionario

1.-Mencione el pH normal de: Sangre, orina, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo,

líquido amniótico, saliva y su correlación con alguna patología.

2.-Principales sistemas buffer orgánicos.


16/36

16

PRÁCTICA N° 04

ESPECTROFOTOMETRÍA

OBJETIVO

El alumno comprende los fundamentos de la espectrofotometría, adquiere habilidades ydestrezas en el manejo del espectrofotómetro, instrumento auxiliar y de apoyo en ladeterminación de los análisis bioquímicos, valora la importancia de esta metodología en laprevención y mantenimiento de una salud óptima.

FUNDAMENTO Una de las propiedades de las moléculas es que pueden absorber energía luminosa yalmacenarla en forma de energía interna. Esto se puede apreciar con se inicio de ciclosvitales de muchos organismos, como es evidente el de la fotosíntesis en plantas ybacterias. La Mecánica Cuántica nos explica que la luz está compuesta de fotones cadauno de los cuáles tiene una energía:

Efotón = h .ν = h.c /λ ,

Donde c es la velocidad de la luz, ν es su frecuencia, λ su longitud de onda y h= 6.6 10-

34 J⋅s es la constante de Planck. Así si decimos que una sustancia química absorbe luzde longitud de onda λ, significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones deesa longitud de onda.En esta práctica estudiaremos la absorción de luz en el ultravioleta cercano (λ≈325-420nm) y en el visible (λ≈420-700 nm). Cuando una molécula absorbe un fotón en esteintervalo espectral, se excita pasando un electrón de un orbital del estado fundamental aun orbital excitado de energía superior. De está manera la molécula almacena la energía

del fotón, y lo hace en sus enlaces:

A + h.ν → A* E(A*) = E(A) + Efotón 11

Como la energía se conserva, la diferencia de energía entre el estado fundamental de lamolécula (A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energía del fotón.Es decir, una molécula sólo puede absorber fotones cuya energía h.ν sea igual a laenergía de un estado molecular excitado. Cada molécula tiene una serie de estadosexcitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrónica y que ladistinguen del resto de moléculas. Como consecuencia, el espectro de absorción, esdecir, la luz absorbida en función de la longitud de onda, constituye una verdadera seña

de identidad de cada sustancia o molécula.En este sentido la Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales másutilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión,sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes,biomoléculas, etc.) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos.Se denomina fotocolorímetría al método óptico de absorción que nos permite cuantificarsustancias y esta basada en la medición de la intensidad de la luz monocromática


17/36

17

(seleccionada según la longitud de luz deseada), trasmitida a través de una solucióncoloreada, ya sea que se trate de sustancia naturalmente coloreadas o que se han hechode tal cálida mediante reacciones químicas adecuada.La mayoría de los cuerpos en solución tiene una capacidad de absorción selectiva sobredeterminadas radiaciones luminosas, cuando ésta absorción se realiza en la zonaespectral visible, las soluciones las ve el observador de un color que es producido por las

radiaciones que no han sido absorbidas.Cuando un haz de luz (Luz Incidente, I0) atraviesa una solución, una parte de la radiaciónqueda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de suintensidad (Luz Transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorción de dichasmoléculas, otra parte de la radiación se pierde por fenómenos físicos como reflexión,refracción y difracción de la luz.

La longitud de onda en la que las moléculas de dichas sustancias absorbe con mayorintensidad la luz, se denomina “longitud de Máxima Absorción” o “Lambda Máximo”. Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada de luz, la intensidad de laluz transmitida por una solución disminuirá en relación con el número de molécula que seinterpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este número varía de acuerdo conla concentración del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solución, estosfactores están considerados en la “Ley de Lambert y Beer”, que rigen los principios dela Colorimetría y cuyas formas de expresión son:

Log (lo / lt) = є l c = A = D.O.

Donde:Io = Intensidad de la Luz Incidentelt = Intensidad de la Luz transmitida.Є = Coeficiente de Extinción Molar. Valor constante dependiendo de la naturaleza de lasustancia y de la longitud de onda.l = Espesor del recipiente en cm.C = Concentración de la solución.A = D.O. = Absorbancia = Densidad Óptica = Extinción.La Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la tramitancia (T) y la relación entre

ambas es logarítmica.

CUESTIONARIO 1.- ¿En que consiste la espectrofotometría?2.- ¿Cuál es el significado de la luz en esta metodología?3.- ¿Que factores alteran la ley de Lambert- Beer?4.- ¿Tiene alguna utilidad la espectrofotometría?.


18/36

18

PRÁCTICA Nº 05:

DETERMINACION DE GLUCOSA

OBJETIVO

El alumno identifica los carbohidratos, determina, explica e interpreta a través de métodosexperimentales las propiedades los fundamentos en la comprobación de carbohidratos,valora la importancia de estas sustancias orgánicas, que forman parte de nuestrasestructuras, que nos proporciona la energía para nuestra subsistencia

FUNDAMENTO Los hidratos de carbono, compuestos por carbono, hidrógeno y oxígeno, representan laprincipal fuente de energía celular y son también constituyentes estructurales importantesde las paredes celulares y de sustancias intercelulares. Los compuestos de carbono seclasifican de acuerdo con el número de monómeros que contienenEn estos compuestos el carbono, hidrogeno y oxigeno se encuentran en proporción de 2 a1, los carbohidratos comprenden desde azucares simples con peso molecular bajo, comola glucosa y la fructosa, hasta moléculas grandes de peso molecular alto, como el almidóny la celulosa.Una prueba general para el reconocimiento de carbohidratos es la de Molish, en ella elácido sulfúrico con las pentosas y las hexosas en caliente dan furfural o 55-hidroximetilfurfural. Estos furfurales con el α – naftol se condensan formando cromógenos, que con elácido sulfúrico dan compuestos quinoides. Otras pruebas como la de Benedict da unaestimulación semicuantitativa de la cantidad del azúcar reductor existente y la prueba delugol indicara la presencia de almidón, glucógeno o de un monosacárido o disacárido.

MATERIALES Y REACTIVOS Solución de glucosa al 1 %Solución de almidón al 1 %Jugo de naranjaReactivo de MolishReactivo de Benedict

Ácido clorhídrico concentradoHidróxido de sodio al 10%Lugol5 tubos de ensayoGradillasPinzas de madera

PROCEDIMIENTO

Reacción de Molish En un tubo de ensayo se toman 2 ml. De la sustancia problema, se agrega 2 gotas delreactivo de Molish recién preparado y se mezcla bien. Se inclina el tubo y se añadecuidadosamente por las paredes aproximadamente 2 ml de ácido sulfúrico concentrado.La formación de un anillo violeta en la interfase indicara resultado positivo.

Con la Solución de Benedit En un tubo de ensayo se toman 0.5 ml. De la solución de Benedict, luego se añade 1 mlde la solución problema y e calienta a ebullición durante dos min. Luego se deja enfriar.


19/36

19

La formación de un precipitado verde amarillo o rojo ladrillo indicara la presencia de unazúcar reductor, según se encuentre en mayor o menor cantidad.

Prueba de Reconociendo del Almidón.En un tubo limpio y seco se coloca 3 ml. De una solución de almidón al 1%, se añade 5gotas de ácido clorhídrico concentrado. Se mezcla cuidadosamente y se lleva al calor

hasta que hierva durante dos minutos anotar los resultados.Luego se toma una alícuota (3 gotas) y se mezcla con una gota de solución de lugol.

Anotar el resultado.Se vierte en un tubo 3 gotas de la muestra problema, se añade 4 ml. De agual destilada ydos gotas de solución de lugol. Observar la coloración azul violeta. Anotar.El tubo de la muestra problema con ácido clorhídrico se continúa con la ebullición durantedos minutos o más repetir la prueba con la solución de lugol. Observa una coloración rojoparado. Anotar.Continuar la ebullición por 2 o 3 minutos y repetir la prueba con solución de lugol por 2 a 3veces más. Anotar. Al final la reacción negativa (color del reactivo) debido a que elproducto final de la hidrólisis del almidón es la glucosa.El hidrolizado se neutraliza con solución de NaOH al 10% y se realiza la prueba de

Benedict.

CUESTIONARIO 1.- Cual es el producto final de la digestión del almidón por la amilasa salival?2.- Como se demuestra que el almidón sufrió la acción de la amilasa salival en laexperiencia realizada3.- Cual es el fundamento del reconocimiento de los azúcares monosacáridos en lareacción con el benedict?4.- ¿Cuál es el fundamento de la reacción de los almidones con el lugol?


20/36

20

PRACTICA° N° 6

DETERMINACION DE PROTEINAS

OBJETIVOS

- Introducir en la determinación de la concentración de proteínas en plasma sanguíneo.- Entender y practicar los principios de la espectrofotometria.- Aprender a manejar pipetas automáticas

FUNDAMENTO

La sangre está formada por una solución acuosa que contiene moléculas de tamañovariable y diversos tipos de elementos celulares. Los elementos formes de la sangre seencuentran en suspensión en una solución acuosa denominada plasma. Aunque elplasma es el medio natural de las células sanguíneas, la mayoría de las determinacionesquímicas se hacen en suero. Las proteínas del plasma pueden clasificarse en dosgrupos: las que son sintetizadas por el hígado (albúmina) y las inmunoglobulinas(producidas por las células plasmáticas de la médula ósea). El plasma humano tiene unaconcentración en proteínas de 60-80 g/L (frecuentemente se expresa en g/dL; 6-8 g/dl).Casi la mitad de esta proteína plasmática es albúmina, cuyo rango de concentración es35-45 g/L. Es una proteína de 62.000 D que actúa como proteína de reserva, además deimportante transportador (ácidos grasos, bilirrubina y fármacos) y regulador osmótico.Es producida por el hígado. Su concentración aumenta en casos de deshidratación ydisminuye en casos de ascitis/edema, y daño hepático severo.La determinación de la concentración de proteínas en sangre puede ser llevada a cabopor diferentes métodos. En esta práctica vamos a utilizar dos de los métodos que seutilizan con mas frecuencia: Biuret y Bradford. Los dos métodos tienen en común que ladisolución de proteína se mezcla con algún reactivo que determina que aparezca o seintensifique un color (azul) que se cuantifica midiendo la absorbancia a una determinadalongitud de onda frente a un blanco de reactivo. El color generado es poco estable ydepende de las condiciones de reacción, por lo que hay que realizar una curva patróncon soluciones de una proteína de concentración conocida (albúmina bovina).La base teórica de la aplicación de la espectrofotometria para medir la concentración deuna sustancia en solución y las instrucciones para el uso del Espectrofotómetro

Materiales-Soluciones de suero sanguíneo A y B de concentración desconocida.-Soluciones de proteína patrón (albúmina de suero bovina) de concentraciones conocidas-Reactivo de Bradford-Reactivo de Biuret-Pipetas-Tubos-Agitadores-Rotulador-Espectrofotómetros (Colorímetros)

Determinación por el método de BiuretLa concentración de proteínas se medirá utilizando el método del Biuret, que se basa enla formación de un compuesto coloreado o cromóforo, de color azul-púrpura, debido a la


21/36

21

formación de un complejo entre el ión cobre y los enlaces peptídicos a pH alcalino. Serequiere un mínimo de dos enlaces peptídicos para la formación del complejo coloreado,que se mide a 550 nm. Es un método poco sensible pero muy preciso, ya que laabundancia de grupos peptídicos (por unidad de masa de proteína) es prácticamente lamisma en cualquier proteína.

Método1) Numerar 7 tubos2) Añadir al tubo 1 100 µl de agua destilada (tubo “blanco”)

" " 2 100 µl de solución de proteína 20 g/L" " 3 " µl " " " " 40 g/L" " 4 " µl " " " " 60 g/L“ 5 " µl " " " " 80 g/L " " 6 " µl " " " " problema A" " 7 " µl " " " " problema B

3) Añadir 4 ml de reactivo de Biuret a todos los tubos.

4) Mezclar el contenido de cada tubo.4) Esperar 5 min. para que se desarrolle el color. Medir la absorbancia a 550 nmajustando a cero con el tubo 1 (blanco).

Resultados- En una hoja de papel milimetrado construir una gráfica de A550 (eje y) frente aconcentración de proteína (eje x) de las soluciones patrón (tubos 2-5). Marcar el eje delas x en g/l de proteína.- Determinar la concentración de las soluciones problema A y B interpolando en la gráficapatrón los valores de las soluciones problema A y B. Expresarlo en g/L


22/36

22

PRACTICA Nª7

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL

OBJETIVO

Reconocer la estructura del colesterol, determina experimentalmente en suero los valoresde colesterol total, HDL-Colesterol y triglicéridos, para lo que se utilizarán kitscomerciales, valora la importancia del conocimiento de la determinación del colesterol

FUNDAMENTOEl colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructuraCiclopentanofenantreno. Aunque se le considera un lípido, no sirve, como fuente deenergía para el metabolismo, el organismo no puede degradar el anillo de colesterol.Las Lipoproteínas LDL transportan de 65 al 75 % del colesterol plasmático. Lahipercolesterolemia esta casi siempre asociada con la elevación del colesterol LDL (tipoIIa). Es muy raro que la elevación este asociada con incremento en el colesterol HDL. Laselevaciones del colesterol LDL pueden ser el resultado de alteraciones monogénicas,alteraciones poligénicas o secundario a otras enfermedades. Ejemplos:hiprcolesterolemia familiar, defecto familiar de Apo B100, hipercolesterolemia poligénica,cáncer de cabeza de páncreas, diabetes, hipotiroidismo, síndrome nefrótico, etc.El colesterol de la dieta se absorbe parcialmente y también se sintetiza en el hígado yotros tejidos. El colesterol se excreta a la bilis como tal o tras su transformación en salesbiliares primarias y secundarias.Las concentraciones elevadas de colesterol LDL se asocian con un riesgoprogresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias.Las concentraciones séricas de colesterol disminuyen (hipocolesterolemia) en:desnutrición, esteatorrea idiopática, hepatitis, hipertiroidismo, infecciones agudas,anemia, cáncer, malabsorción y anorexia nerviosa.El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un únicoensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.Para las pruebas de perfil lipídico el paciente debe estar en ayuno total excepto agua,durante un lapso de 12 a 24 horas antes de la prueba. No debe haber realizado ejerciciovigoroso y bajo la dieta corriente el día anterior de la prueba.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO (COLESTEROL OXIDASA/PEROXIDASA)Tanto el colesterol libre como el esterificado presentes en la muestra originan, según lasreacciones acopladas descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantificapor espectrofotometría.


23/36

23

COMPOSICIÓN A. Reactivo. Pipes 35 mmol/L, colato sódico 0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterolesterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL,aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0.S. Patrón de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L). Patrón primario acuoso.

MUESTRASSuero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar.El colesterol en suero o plasma es estable 7 días a 2 - 8º C. Pueden utilizarse comoanticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.

PROCEDIMIENTO1. Colocar a temperatura ambiente el reactivo.2. Pipetear en tubos de ensayo:

3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25º C) odurante 5 minutos a 37º C.4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El colores estable durante al menos 2 horas.

CÁLCULOS

La concentración de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmulageneral:

CUESTIONARIO1.- ¿Qué es el colesterol y cuáles son sus funciones?2.- ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación de colesterol?

3.- ¿A qué se refiere cuando se habla del colesterol bueno y el colesterol malo? Explica.4.- ¿Por que es recomendable consumir mejor grasas de origen vegetal a la animal?Explica:5.- ¿Qué es la arteriosclerosis? ¿Quién tiene riesgos de padecerla? Por qué?6.- ¿Qué otros estudios deben realizarse además del colesterol para determinar el riesgode enfermedades cerebro-vasculares y cómo calculamos el índice aterogénico?


24/36

24

PRACTICA N° 8

ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVO

Comprueba la acción de los factores que regulan la actividad enzimática Demuestra como la actividad enzimática puede ser expresada.FUNDAMENTO

Las Enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químico-biológicasacelerando la velocidad de dichas reacciones hasta su punto de equilibrio.

Los substratos son las moléculas sobre las que actúan las enzimas.

En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa lareacción, aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los

correspondientes substratos en tanto permanece fija la concentración de la enzima .La Actividad Enzimática se puede expresar como:

a.- La DESAPARICION del SUBSTRATO.

b.- La APARICION del PRODUCTO

c.- Por la MODIFICACION de COFACTORES

Factores que Modifican la Actividad Enzimática

Son diversos:

1.- pH del medio

2.- Temperatura

3.- Concentración de Enzima

4.- Concentración de Substrato

5.- Acción de Inhibidores y Activadores

E + S E + P

Donde: C C´

E = Enzima

S = Substrato


25/36

25

10.3 Materiales y equipos

Para nuestros experimentos estudiaremos el efecto de la PEPSINA sobre la ALBUMINA.

La PEPSINA es una enzima que hidroliza cadenas grandes de proteínas convirtiéndolasen cadenas pequeñas.

La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrará por desaparición del substrato, o sea la

disminución de la turbidez de una solución de Albúmina de huevo sobre la cual actuará laenzima. La turbidez se leerá en el ESPECTROFOTOMETRO.

Procedimiento

Experiencia Nº1 EFECTO DEL PH

Principios Teóricos.- Si actúa una enzima sobre un

substrato en cantidades equimoleculares (iguales)

variando el pH del medio de reacción, se observará

que existe una región o punto de actividad óptima,

correspondiendo al pH, al cual se denomina pH

OPTIMO, que varía con la pureza de la enzima, el

tipo de sustancia sobre el cual actúa, las sales del

medio, etc. Ello debido a la interacción E –S (Enzima

–Substrato) que se realiza, en gran parte, a través de

los grupos ionizados existentes en sus moléculas. La

concentración de iones (H+) u Oxhidrilos (OH-)

presentes en el medio, alteran los grupos ionizados

e impiden la asociación de las moléculas.

Procedimiento Experimental:

Preparar 6 tubos de acuerdo al esquema siguiente:

Tubos 17x150mm Pipeta 1mL Indicador de pH 1-14 Solución salina Fisiológica

Potenciómetro Pipeta 5mL Estandar de pH 4 Albúmina de huevo en SSF

Baño maría Pipeta 10mL Estandar de pH 7 Pepsina en SSF

Hielo Bagueta Estandar de pH 10 Agua destiladaBeacker 500mL Gradillas Portacubetas NaCO3 10%

Espectrofotómetro HCl 1N

Efectos del pH sobre la Actividad Enzimática.

A E pH óptimo

c n 1

t z

i i

v m

i á

d t

a i

d c


26/36

26

Incubar por 5 min los 6 tubos en Baño maría a 37ºC.

Añadir 3 mL de la pepsina pre-incubada (tubo 6), a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5, y mezclar bien.

Volver a incubar los tubos 1 al 5 por 5 min en baño maría a 37ºC.

Leer la absorbancia de los tubos del 1-5 al espectrofotómetro a una longitud de onda de440nm, usando un blanco de agua destilada.

La lectura debe realizarse tan pronto sale de la incubación, de no ser así, mantener lostubos en agua helada hasta el momento de la lectura.

CALCULOS: Para obtener la actividad enzimática se debe restar la mayor absorbanciaobtenida menos la absorbancia de cada tubo. Graficar los resultados, en un papelmilimetrado, colocando el pH en las abcisas y la actividad enzimática en las ordenadas.

RESULTADOS: Encontrar el pH óptimo de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA

Experiencia Nº2 EFECTO DE LA TEMPERATURA

Principios Teóricos.- La temperatura acelera la

Velocidad de las reacciones al aumentar las colisiones

efectivas entre los elementos reaccionantes.

En una reacción enzimática también deben colisionar

E-S (Enzima-Sustrato) para que la reacción progrese,

Por tanto, las reacciones enzimáticas serán más rápidas a

mayores temperaturas, sin embargo y dada la

naturaleza proteica de las enzimas, la temperatura no

puede aumentarse indefinidamente, pues comenzarán a

romperse los puentes de hidrógeno, alterándose las

estructuras secundarias, situación que se conoce como

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6

H2O dest. (mL) --- 1,5 2 1,5 --- ---

HCl 1N (mL) 2,0 0,5 --- --- ---

Na2CO3 10%(mL) --- --- --- 0,5 2,0 ---

Albúmina (mL) 5 5 5 5 5 ---

Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 20

pH del tubo 1.0 2 6.0 10 11.0 ---

Efectos de la Temperatura sobre la Actividad

Enzimática.

A E Temperatura óptima

c n 1

t z

i i

v m

i á

d t

a i


27/36

27

DESNATURALIZACION (Ver esquema).

Procedimiento Experimental:

1º Preparar dos series de 5 tubos cada una, de acuerdo al esquema siguiente:

Incubar por 5 min a 37°C en baño maría

Agregar 2 mL de la pepsina pre incubada (Tubo 5) a cada uno de los tubos del 1 al 4 einmediatamente incubar por 5min según el esquema siguiente:

Al finalizar el tiempo, colocar inmediatamente los tubos en agua helada para detener lareacción, hasta el momento de su lectura.

Leer al espectrofotómetro los tubos 1-4 y el control, usando un blanco con aguadestilada.

CALCULOS: La actividad enzimática se encontrará restando la lectura de cada tubo

(1-4) de la lectura del tubo CONTROL (SIN INCUBAR). Graficar los resultados en un

papel milimetrado, colocando la temperatura en las abscisas y la actividad enzimática enlas ordenadas.

RESULTADOS: Encontrar la T° óptima de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA

Reactivo / Tubo N°CONTROL

1 2 3 4 5

H2O dest. (mL) 3,0 3,5 3,5 3,5 3,5 ---

HCl 1N (mL) --- 0,5 0,5 0,5 0,5 ---

Albúmina (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 ---

Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 11

Tubo 1 2 3 4

Temperatura °C 0 (hielo) 25(Ambiente) 37 100(ebullición)


28/36

28

Cuestionario

1.- Explique el mecanismo de acción de la las enzimas

2.- Con los datos de la práctica elabore las gráficas de pH vs Actividad y T° vs Actividad, yexplique en función a la bibliografía recomendada.

3.- A que llamamos especificidad por el sustrato?

4.- Uso del dosaje de enzimas para el diagnóstico clínico, de ejemplos


29/36

29

PRÁCTICA N° 9

DETERMINACIÓN DE UREA

OBJETIVO

el alumno tendrá la capacidad para cuantificar urea en muestras biológicas humanascomo la orina o la sangre.

INTRODUCIÓN

Cuando los aminoácidos de la dieta exceden los requerimientos para la síntesis proteicay otra vía anabólicas, el exceso es catabolizado para producir ATP o es convertido asubstratos para la síntesis de ácidos grasos.

Es importante tomar encuentra que sólo los esqueletos de carbono de los aminoácidos yno los grupos amino pueden ser usados en el proceso antes mencionado.

La eliminación del nitrógeno de los aminoácidos es una parte importante en elcatabolismo de los aminoácidos, es tóxico para el cerebro en forma de amonio, por lo queel organismo humano lo debe de eliminar en forma de urea, compuesto no tóxico solubleen agua cuya única función en el metabolismo es la excreción de nitrógeno.

La urea puede determinarse en el hombre en muestras como: la sangre o la orina, pordiferentes métodos los más usados son los métodos enzimáticos.

MATERIAL Y REACTIVOS

1. Suspensión de ureasa.-Ureasa 3.5 Ku/L.2. Solución patrón de urea.-Urea 40 mg/dL=6.66mmol/l3. Reactivo de fenol.- 150 mmol/L nitroprusiato de sodio 0.47mmol/ L4. Solución de hipoclorito.- hipoclorito de sodio 13mmol/L; NaOH 130mmol/L.5. Tubos de ensayo6. Espectrofotómetro7. Suero humano fresco (PROBLEMA)

TÉCNICA

Prepare la siguiente serie de tubos:

REACTIVO TUBOPROBLEMA PATRÓN BLANCO

UREASA (mL) 0.2 0.2 0.2UREA (mL) 0.0 0.02 0.0PROBLEMA (mL) 0.02 0.0 0.0

Mezclar y dejar en reposo por 30 min. a temperatura ambienteFENOL (mL) 5.0 5.0 5.0HIPOCLORITO DE SODIO(mL)

5.0 5.0 5.0

Mezclar y dejar reposar por 30 min. a temperatura ambienteMedir en el espectrofotómetro a 620 nm


30/36

30

DETRMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN

C = D.O. X 6.66/D.O P.

C = concentración en mmol/L

D.O.= Densidad óptica del problemaD.O.P.= Densidad óptica del patrón

CUESTIONARIO


31/36

31

PRACTICA N° 10

DETERMINACION DE ACIDO URICO

OBJETIVOS

Determinar la concentración de ácido úrico en suero Relacionar la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico

FUNDAMENTO

Los nucleótidos de una célula se estan renovando continuamente. Los nucleotidos sedegradan por hidrólisis a nucleósidos, por medio de las

nucleotidasas. Las nucleósidos fosforilasas catalizan la ruptura fosforolítica de losnucleósidos para originar bases libres y ribosa -1-fosfato. Esta base libre proviene de

una base nitrogenada de tipo purínica A pH fisiológico, el ácido úrico pierde un protón dando lugar a urato. En los sereshumanos, el urato es el producto final de la degradación de las purinas y se excreta enla orina. Niveles elevados de urato en el suero provocan la gota, una enfermedad en laque las sales de urato forman cristales que deterioran las articulaciones y los riñones.En algunos casos se utiliza el alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa para tratar lagota.

También existen otros desórdenes que transcurren acompañados de hiperuricemia,tales como leucemia, policitemia, mieloma múltiple, intoxicación plúmbica, incluyendoalteraciones medicamentosas en los tratamientos con citostáticos o con tiazidas.Mientras que otros medicamentos (drogas uricosúricas tales como salicilatos y lafenilbutazona) aumentan la excreción del ácido úrico, disminuyendo los niveles séricosdel mismo

Materiales y equipos

Micropipeta 10 a 200 ul Tips amarillo

Pipetas 5 mL Suero

Gradilla Estándar de ácido urico 10 mL x grupo

Tubos 3 x mesa Rvo Enzimático de acido úrico 10 mL xgrupo

Espectrofotométro Baño María


32/36

32

Fundamento del método

El ácido úrico es oxidado por la enzima específica uricasa, generándose alantoína yH2O2, el cual en una reacción mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac.3dimetiaminobenzoico y 4 – AAP produciéndose un compuesto coloreado con un máximode absorción a 555 nm., en cantidad proporcional a la cantidad de ácido úrico presente enla muestra.

Acido Úrico uricasa Alantoína + H2O2

H2O2 + DMAB + 4- AAP POD H2O + Complejo coloreado

9.11 Procedimiento

BLANCO STANDARD MUESTRA

Muestra (ml) --- --- 0, 025

Standard (ml) --- 0, 025 ---

Reactivo (ml) 1,00 1, 00 1, 00

Mezclar e incubar 10 minutos a 37º C, o 20 minutos a temperaturaambiente (20 a 25ºC).

Leer a una longitud de onda óptima 555 nm.

Llevar a cero con agua destilada el espectrofotómetro

Anote la absorbancia de la muestra:…………….

La fórmula matemática a usar es el factor de calibración

FACTOR = 10 mg/mL

Absorbancia Estándar

ACIDO ÚRICO (mg/dL.) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO


33/36

33

VALORES DE REFERENCIA:

En Suero: Hombres.................. 3, 4 a 7, 0 mg/dl.

Mujeres...................... 2, 4 a 5, 7 mg/dl.

Cuestionario

1.- ¿Cuáles son los otros factores de riesgo de padecer enfermedades cardiacas yvasculares, Además del exceso de colesterol?

2.- ¿Qué tipos de colesterol hay, haga un breve resumen de cada uno?

3.- ¿Cómo afecta a los niños el colesterol, y cuál es el nivel de colesterol recomendableen la infancia?


34/36

34

PRÀCTICA Nº 11

DETERMINACIÓN DE UNA PRUEBA DE EMBARAZO EN ORINA

OBJETIVOEl alumno realiza la detección de la hormona gonadotropina coriónica como unmecanismo para determinar el estado de embarazo, comprueba experimentalmente através una muestra de orina de la paciente que se sospecha que está embarazada yvalora la importancia de estas pruebas en el diagnóstico del embarazo.

FUNDAMENTO Los años de función reproductiva de la mujer se caracterizan por cambios rítmicos en lastazas de secreción de las Hormonas Femeninas y cambios correspondientes en losórganos sexuales. Las funciones sexuales y reproductivas en la mujer pueden dividirse endos fases principales; primera: la Preparación del Cuerpo para la Concepción y laSegunda: el Periodo de Gestación o Embarazo.La gonadotropina coriónica humana (hCG) es una hormona glicoproteica que se produceen condiciones normales en la placenta y aparece en el plasma y en la orina durante elembarazo. La hCG, junto a la hormona folículo estimulante (FSH), la hormona luteinizante(LH) y la hormona estimulante del tiroides (TSH), está constituida por una cadena alfa,estructuralmente similar entre ellas, y una cadena beta específica que determina suactividad biológica.2 Esta hormona estimula la producción de hormonas esteroides por elcuerpo lúteo, lo que propicia el ambiente uterino adecuado para el desarrollo del embrión.El principal uso de la determinación de la hCG es el diagnóstico precoz del embarazo; sinembargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas urogenitales,embarazos ectópicos y ováricos.Una función principal de la Gonadotropina Coriónica Humana (GCH) es administrar losfactores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas paramantener en óptimas condiciones el endometrio y la 69 cavidad uterina, lo que en casocontrario de no haber concepción o cantidad insuficiente de esta hormona se perdería enforma de líquido menstrual.La detección precoz del embarazo por las pruebas bioquímicas se fundamenta en ladeterminación de la gonadotropina coriónica humana (HCG) en suero o en orina.Una vez producida la fecundación y la implantación del blastocisto en la deciduaendometrial, las células trofoblásticas empiezan a sintetizar HCG.2 Las cifras de HCG seincrementan rápidamente en las primeras semanas del embarazo y a los 35 días deamenorrea alcanzan cifras de 1800 UI/L.La HCG está compuesta de 2 subunidades alfa y beta, diferentes entre sí; mientras lasubunidad alfa es compartida por las restantes glicoproteínas hipofisarias, la subunidadbeta le confiere sus características biológicas e inmunológicas distintivas.2La combinación del empleo de los anticuerpos monoclonales contra la subunidad beta dela HCG (beta HCG) y los inmunoensayos enzimáticos, ha posibilitado el auge de métodossemicuantitativos y cualitativos rápidos, sensibles y específicos con valores desensibilidad de 50 UI/L que pueden ejecutarse en las propias consultas médicas y dondeel resultado se ofrece en menos de una hora.


35/36

35

EMBARAZO El primer s igno d e embarazo es la ausencia de una m enstruación esperada . Si losciclos son regulares, el retraso de la regla durante 1 semana o más es la base depresunción de embarazo. El médico diagnosticará embarazo por medio de procedimientosexploratorios y utilizando diversos sistemas diagnósticos (doppler, test de embarazo, etc.)La hCG (Hormona del embarazo) estimula el cuerpo lúteo del ovario para mantener las

secreciones de estrógenos y progestágenos a fin de garantizar la integridad delembarazo. Como regla general, los niveles de hCG se duplican al doble cada dos o tresdías. Una mujer embarazada tendrá de 10 a 50 mUI/mL de concentración de hCG ensuero la primera semana siguiente a la concepción (al final de la tercera semana delciclo), alcanzando la máxima concentración entre el segundo y tercer mes, seguido de undescenso a partir de la 12ª semana.Métodos de determinación de la Gonadotropina Coriónica humana (hCG, -hCG,hormona del embarazo) La hCG se sintetiza en la placenta y aparece en el suero y en la orina relativamentepronto después de la concepción.La hCG es una glucoproteína compuesta por dossubunidades polipeptídicas: alfa y beta. La subunidad alfa es esencialmente idéntica a lacadena alfa de otras hormonas hipofisiarias (TSH, LH y FSH). Es la variación de las

subunidades beta donde reside la especificidad de la actividad biológica de estashormonas. Con los métodos cuantitativos de laboratorio pueden detectarse cantidades muypequeñas de ß-hCG (sensibilidad entre 0,05 y 0,1 mUI/mL). Dichos métodos son:radioinmunoanálisis (RIA), enzimoinmunoensayo (EIA, ELISA), inmunoanálisis defluorescencia (FIA). Casi todos ellos usan dos técnicas: Inhibición competitiva (RIA, FIA),y técnicas sándwich de doble anticuerpo (EIA, FIA). Todos estos ensayos cuantitativosrequieren instrumentación especial y largos tiempos de análisis (de 30 minutos a 3 horas)Tradicionalmente se han utilizado pruebas cualitativas urgentes en orina, de aglutinaciónen portaobjetos, como indicadores para visualizar una reacción positiva. Estas técnicashan caído en desuso tras la aparición de los test s rápid os en dispositivosinmunocromatográficos, proporcionando sensibilidades de 25 mUI/mL en tiempos de

ensayo por debajo de los 3 minutos.La aparición de una nueva generación de métodos inmunoabsorbentes con partículas deoro coloidal recubiertos de anticuerpos anti ß-hCG (DONNATEST Embarazo) permitemejorar la sensibilidad de detección de esta hormona en orina por debajo de 20 mUI/mLen menos de dos minutos.Estas pruebas se utilizan como método cualitativo, tanto en laboratorio, en formato de tirareactiva para suero y orina, o en formato de dispositivo como prueba rápida de uso

personal , y con la sensibilidad suficiente para detectar la hormona desde el primer día dela falta.

MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla, tubos de 13X100

Centrifuga, GasasTiras reactivas para detección de la fracción beta de la hormonaMuestra reciente de orina

PROCEDIMIENTO 1. Procedimiento opcional: recoger la orina en un vaso limpio. Sumergir la zonaabsorbente del dispositivo durante 10 segundos. Esperar que aparezca el resultado apartir de un minuto.


36/36

PIPETA, MICROPIPETAS, TUBO DE ENSAYO, GRADILLA, CENTRIFUGA,MICROSCOPIA, ESPECTROFOTOMETRO, VASO DE PRECIPITADO, MATRAZPROBETAS.

GUIA_BIOQUIMICA_2012

Documents

Transcript of GUIA_BIOQUIMICA_2012