histomorfometria
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MÉTODOS MICROSCÓPICOS PARA LA ESTIMACIÓN DE EDAD A LA MUERTE:
ANÁLISIS HISTOMORFOMÉTRICO
Desántolo, B.; García Mancuso, R.; Plischuk, M.; Salceda, S.; Inda, A.
I TALLER NACIONAL DE BIOARQUEOLOGÍA Y PALEOPATOLOGÍA
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La histomorfometría o histología cuantitativa
(Robling y Stout, 2000) es la cuantificación de la microestructura del tejido óseo. A través del recuento y medición de las características histomorfológicas se puede obtener información acerca del recambio óseo (remodelación), de la microarquitectura y de la actividad celular dinámica y estática (Crowder y Stout, 2012).
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La estimación histológica de la edad se basa en el grado de remodelación ósea…
Unidad Estructural Básica (BSU)u osteona
Fuchs et al. 2012
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Dado que la remodelación es un proceso que
transcurre durante toda la vida, desde el nacimiento
hasta la muerte, permite observar la asociación entre
el número de osteonas y la edad cronológica
constituyendo la base primaria de los métodos
histológicos de estimación de edad (Stout 1989,
Robling y Stout 2008).
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Robling y Stout, 2008Robling y Stout, 2008
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Robling y Stout, 2008
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Robling y Stout, 2008
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MATERIAL y MÉTODOS La muestra analizada pertenece a la “Colección
Lambre” FCM- UNLP (Salceda et al. 2009 RAAB 11 (1): 133; Salceda et al., 2012 HOMO 63 (4).
Está integrada por 71 fémures de individuos adultos con datos fehacientes de edad y sexo.
Las piezas que presentaron algún signo de patología fueron excluidas.
Sexo N = 71 Rango Media
Femenino 21 26 - 88 59.68
Masculino 50 22 - 91 58.67
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ANÁLISIS HISTOMORFOMÉTRICO
I. Extracción II. Preparación de la muestra III. Observación y cuantificación de variables
histomorfométricas.
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I. EXTRACCIÓN
Las muestras se obtuvieron a partir de la remoción de tejido cortical de la mitad anterior de la diáfisis femoral, tal y como sugieren estudios previos analizados (Thompson 1979; Ericksen 1991, Maat et al. 2001, 2006; Keough 2007).
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II. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Fueron procesadas por técnica de desgaste modificada en adecuación a los estudios histomorfométricos (Vasallo y Restelli, 2000) y siguiendo las recomendaciones de Maat y col. (2001).
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TÉCNICA DE DESGASTE MANUAL (Maat y col. 2001)
La misma consiste en la reducción del espesor del tejido duro (hueso) a fin de poder observarlo microscópicamente:
Corte de lámina con sierra manualLavado Pulido (piedra de afilar y lija al agua n° 220)Control periódico al microscopio Espesor óptimo Montaje Secado (48 hs a 37° C aprox.)
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III.EVALUACIÓN HISTOMORFOMÉTRICA
Para la observación microscópica se empleó microscopio de campo claro Iroscope (Mod. BW 3T) y los preparados se examinaron con objetivo 10X y ocular 10X provisto de una grilla de 10 mm de lado y acondicionada con una escala micrométrica (Zeiss). Para el análisis y cuantificación de las variables se seleccionaron cuatro campos microscópicos subperiostiales.
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VARIABLES MICROESTRUCTURALES
nº total de osteonas fragmentarias ost_frag
nº promedio de lamelas por osteona lam_ost
promedio del diámetro del canal de Havers (µm) hav_can
espacios de resorción res_spac
porcentaje de osteonas fragmentarias % ost_frag
porcentaje del área osteonal % ost_bone
porcentaje de hueso fragmentado % frag_bone
nº total de osteonas tot_ost_meaKerley y Ubelaker 1978; Singh y Gunberg 1970; Ericksen 1991, Vasallo et al. 2000
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DIFICULTADES
T. DESGASTE MANUAL
• Deterioro del material.• Pérdida de información. • Sesgo en la observación
y cuantificación. • Microfracturas y
microgrietas. • Restos con buen estado
de conservación.
OBSERVACIÓN Y CUANTIFICACIÓN
• Poco precisa• Cambios en los oculares• Movimientos de la
platina • Limitada en cuanto a la
cuantificación de ciertas variables.
• Imposibilidad de medir el mismo campo.
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SEGUNDA ETAPA Debido a las dificultades especificadas
testeamos otra técnica de preparación para hueso calcificado: la inclusión en medios plásticos duros (resina epoxi)
Entrenamiento en el uso de programas informáticos para el procesamiento de imágenes y cuantificación de variables histomorfométricas.
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TÉCNICA INCLUSIÓN EN RESINA Procesamiento de las muestras• Infiltración: la muestra se sumerge en un molde con
resina epoxi (Dicast LY 554 con endurecedor HY 554) 24 a 36 hs.
• Pulido con abrasivos en polvo (carburo de silicio, corindón, alúmina) de diferentes granulometrías.
• Secado: Horno a 35° C, 3 horas. Obtención de las secciones• Se realiza mediante sistemas de corte (disco
diamantado), desbastado y pulido (1 mm). • Montaje: la lámina se cubre con resina epoxi o un
adhesivo plástico fotosensible para evitar la formación de burbujas. Laboratorio Geológico del Lic. Ricardo Ponti
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EVALUACIÓN HISTOMORFOMÉTRICA
Fotomicroscopio Trinocular Nikon (Mod. Eclipse E200) equipado con una cámara digital Nikon (Mod. Coolpix S10).
Se seleccionaron y fotografiaron cuatro campos microscópicos por sección.
Las microfotografías se procesaron y analizaron con un analizador de Imágenes, Software Image Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics).
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T. Inclusión en resina
• Mantiene la integridad de la muestra, por lo tanto no se producen grietas ni hay perdida de información.
• Estabilidad de los preparados durante períodos largos de almacenamiento.
Microfotografías
• Documento verificable• permanente• libre de cambios de los
oculares y de movimientos de la sección delgada, que hacen confundir el campo visual original.
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DISCUSIÓN Los métodos microscópicos requieren más
tiempo, equipamiento y mayor conocimiento específico de técnicas histológicas; además, implican destrucción parcial del material.
A diferencia de los métodos macroscópicos, los microscópicos son de gran utilidad aun cuando los restos se encuentren fragmentados o incompletos (Bednarek, 2008; Franklin, 2010).
Diferenciación interespecífica entre hueso humano-no humano.
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En contextos arqueológicos…
Limitaciones en cuanto al área de muestreo: Desgaste superficial por agentes tafonómicos.
Alternativa: Análisis de la región endostial (Hauser et al.
1980, Pfeiffer et al. 1995).
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CONSIDERACIONES FINALES Describir detalladamente la muestra de referencia (edad, sexo,
n, composición étnica).
Identificar precisamente el hueso analizado y el área seccionada.
Considerar las tasas diferenciales de remodelación para cada pieza ósea analizada.
Indagar sobre los factores que afectan la remodelación, y consecuentemente las estimaciones: sexo, actividad física, variación poblacional y condiciones patológicas.
Considerar a la histomorfometría como un método complementario auxiliar de los análisis macroscópicos.
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CONSIDERACIONES FINALES
Validar los métodos de estimación de edad en muestras independientes y de edad conocida a fin de determinar su exactitud y precisión.
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