Revista Mexicana de Fitopatología

ISSN: 0185-3309

mrlegarreta@prodigy.net.mx

Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C.

México

González-Rodríguez, Miguel Ángel; Silva-Rojas, Hilda Victoria; Mascorro-Gallardo, José Oscar

Ensayo in vitro del Péptido Antimicrobiano Melitina Contra Diferentes Bacterias Fitopatógenas

Revista Mexicana de Fitopatología, vol. 23, núm. 2, julio - diciembre, 2005, pp. 176-182

Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C.

Texcoco, México

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Ensayo In vitro del Péptido Antimicrobiano Melitina ContraDiferentes Bacterias Fitopatógenas

Miguel Ángel González-Rodríguez, Universidad Autónoma Chapingo (UACH),Departamento de Parasitología Agrícola, km 38.5 Carr. México-Texcoco, Chapingo, Edo.de México CP 56230; Hilda Victoria Silva-Rojas, Colegio de Postgraduados, CampusMontecillo, Programa de Semillas, km 36.5 Carr. México-Texcoco, Montecillo, Edo. deMéxico CP 56230; y José Oscar Mascorro-Gallardo, UACH, Departamento de Fitotecniay Programa de Investigación en Biotecnología Agrícola (PIBA). Correspondencia:joscar@correo.chapingo.mx

González-Rodríguez, M.A., Silva-Rojas, H.V. y Mascorro-Gallardo, J.O. 2005. Ensayo in vitro del péptidoantimicrobiano melitina contra diferentes bacteriasfitopatógenas. Revista Mexicana de Fitopatología 23:176-182.Resumen. El incremento de la resistencia de bacterias yhongos patógenos de plantas a los antibióticos y fungicidas,ha estimulado la necesidad de desarrollar compuestos connuevos sitios de acción. Recientemente, se ha encontrado unagran gama de péptidos antimicrobianos con un amplioespectro de actividad y con un nuevo modo de acción, queprometen ser una alternativa a los problemas de inducciónde resistencia y contaminación que originan los plaguicidasconvencionales. Con la finalidad de conocer el potencial,ventajas y limitaciones de estas moléculas, se eligió comomodelo al péptido melitina de 26 aminoácidos principalcomponente del veneno de la abeja (Apis mellifera), paraprobar mediante bioensayos de inhibición, sus propiedadesantimicrobianas contra 39 aislamientos correspondientes asiete géneros y 12 especies distintas de bacteriasfitopatógenas. La melitina mostró efecto inhibitorio de 100%de crecimiento contra todas las cepas probadas, en un rangode concentración que varió de 6.5-65.0 µM, excepto con laespecie de Dickeya chrysanthemi que mostró moderadaresistencia a la máxima dosis probada. Cepas de una mismasubespecie o patovar exhibieron respuesta distinta,demostrando que el grado de sensibilidad a la melitina es uncarácter que despliega amplia variación intra-específica.

Palabras clave adicionales: Antibióticos, biotecnología,catiónico, identificación.

Abstract. The increasing resistance of plant-pathogenicbacteria and fungi to antibiotics and conventional pesticides,has encouraged to make efforts to develop new compoundswith novel targets of action. Recently, a wide range ofantimicrobial peptides have emerged, which exhibit broad-

spectrum activity with novel mechanisms of action that couldbe a new alternative to the problems of induced resistanceand contamination caused by the use of conventionalpesticides. In order to explore the potential, advantages andlimitations of these molecules, we chose to work with thepeptide melittin which has 26 aminoacids and is the maincomponent of honey bee (Apis mellifera) venom, to test bygrowth-inhibition assays its antibacterial properties against39 strains that belong to seven genera and 12 different speciesof plant pathogenic bacteria. Melittin showed 100% growthinhibition against all bacterial isolates, in a concentrationrange from 6.5 to 65 µM, with the exception of Dickeyachrysanthemi which showed a moderate resistance to themaximum rate tested. Strains from the same subspecie orpathovar showed different response, demonstrating that thedegree of sensibility to melittin is a character that displays abroad intra specific variation.

Additional keywords: Antibiotics, biotechnology, cationic,identification.

En la agricultura moderna el empleo de agroquímicos comofungicidas, antibióticos e insecticidas ha traído problemasde contaminación, intoxicación y efectos crónicos indeseablesen humanos. La tendencia de los microorganismos a cambiary evadir la resistencia a los diversos tipos de antibióticos yplaguicidas, hace necesario el desarrollo de otro tipo deestrategias más duraderas y con menores costos ambientalesy para la salud. Se han identificado cierto tipo de péptidosantimicrobianos en organismos tanto del reino animal comovegetal, que han mostrado ser altamente efectivos contrabacterias, hongos y algunos virus. Desde el reporte inicialdel péptido antimicrobiano cecropina en 1981, aislado delinvertebrado Hyalophora cecropia L., han ocurrido avancesespectaculares en este campo. En la actualidad, se conocenmás de 500 de estas proteínas obtenidas de diversos gruposde organismos eucariotes (Steiner et al., 1981; Zasloff, 2002).

(Recibido: Septiembre 7, 2005 Aceptado: Octubre 17, 2005)

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Algunos de estos péptidos han mostrado ser útiles paraconferir resistencia a plantas transgénicas contra patógenosimportantes, como es el caso del péptido MSI-99 derivadode la magainina, que pudo inhibir el crecimiento del hongoMycosphaerella musicola Leach en plátano (Musa spp.) y elde Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, Alternariaalternata (Fr.) Keissler y Botrytis cinerea Pers.:Fr., en tabaco(Nicotiana tabacum L.) (Chakrabarti et al., 2003), o el péptidoMsrA1, derivado del péptido melitina-cecropina, que dióresistencia en papa (Solanum tuberosum L.) contra los hongosPhytophthora cactorum (Lebert et Cohn) Schröter yFusarium solani (Martius) Saccardo y la bacteria Erwiniacarotovora (Jones) Bergey (Osusky et al., 2000), esta últimareclasificada como Pectobacterium carotovorum (Jones)Waldee (Gardan et al., 2003). En otro caso, mediante unanovedosa estrategia de biocontrol, se pudo modificar aSaccharomyces cerevisiae Gasp. (levadura del pan) parasecretar un péptido derivado de la cecropina; la levaduraasperjada sobre frutos de tomate (Lycopersicon esculentumMill.), ayudó al control de la antracnosis causada porColletotrichum coccodes (Wallr.) Hughes (Jones y Prusky,2002). Los péptidos antimicrobianos endógenos de plantas yanimales son típicamente catiónicos constituidos por 12-45aminoácidos (aa) con una estructura de á-hélice anfipática,es decir, con un lado hidrofóbico y otro hidrofílico, con cargapositiva y peso molecular de 2-5 kDa. Estos péptidos, sedividen en cuatro grupos: los lineales de estructura helicoidalsin cisteínas; lineales sin cisteína con una alta proporción deprolina y arginina; y otros dos grupos, con uno o dos enlacesdisulfuro (Oren y Shai, 1998; Torres-Larios et al., 2000). Lamelitina es el principal componente en el veneno de abejaAphis melifera L., se compone de 26 aa en su parte activa yes del tipo á-hélice. También se caracteriza por poseer unaalta actividad hemolítica en mamíferos. Se ha utilizado juntocon la cecropina y la magainina, como un modelo paraestudiar las propiedades, modo de acción y bioquímica deeste tipo de proteínas, así como para diseñar otros péptidoscon mayor especificidad o efectividad, sin actividadhemolítica (Osusky et al., 2000). Estos péptidos han tenidoun papel importante en la inmunidad innata de insectos ymamíferos. A pesar de haber aparecido temprano durante laevolución de los eucariotes, su efectividad no se ha vistomermada, contradiciendo la creencia generalizada que lasbacterias y hongos pueden desarrollar resistencia contracualquier substancia concebible (Zasloff, 2002). Suefectividad y selectividad se basa en las diferencias en eldiseño de las membranas de microorganismos procariotes yeucariotes superiores. Mientras que la membrana de lasbacterias poseen una capa exterior de la bicapa poblada delípidos con cabezas de fosfolípidos de carga negativa, lamisma capa exterior de la membrana de plantas y animalesse compone de lípidos sin carga; la mayoría de lípidos concarga negativa se encuentran en este caso ubicados en la capainterior. Adicionalmente, el colesterol encontrado eneucariotes contribuye a estabilizar las membranas y a reducir

la interacción con péptidos de carga positiva (Zasloff, 2002).El modo de acción de los péptidos catiónicos anfipáticosradica en la interacción entre éstos y los lípidos de lasmembranas blanco. El modelo de alfombra, postula que abajas concentraciones los péptidos se adsorben paralelos ala membrana y muestran tendencia a formar poros o canalestransitorios no selectivos, pero a medida que se incrementala concentración, aumenta la permeabilización de lamembrana debido a la micelización, que ocasiona la lisis ymuerte de las bacterias (Oren y Shai, 1998; Zasloff, 2002)(Fig. 1). Las bacterias exhiben un amplio rango desusceptibilidad a los péptidos antimicrobianos y las bases deestas diferencias se conocen poco, aunque podrían deberseprincipalmente a la composición de lípidos de la membrana(Andreu y Rivas, 1998). Las bacterias Gram negativas poseenuna membrana externa separada de la membrana interna poruna pared de peptidoglucanos (Trun y Trempy, 2004), adiferencia de las Gram positivas que presentan una solamembrana al igual que organismos eucariotas (Alberts et al.,1996). Otros mecanismos más específicos que podríancontribuir a la resistencia a ciertos péptidos específicos,involucran a proteasas (Andreu y Rivas, 1998). Teniendo encuenta estos antecedentes, la presente investigación, pretendecaracterizar la susceptibilidad a la melitina de una colecciónde bacterias fitopatógenas de distintas especies.

MATERIALES Y MÉTODOSSe utilizaron 39 cepas bacterianas procedentes de trescolecciones particulares, todas fitopatógenas,correspondientes a siete géneros y 12 especies diferentes.Algunas subespecies y especies como Pseudomonas syringaepv. phaseolicola (Burk.) Young, Dye y Wilkie, agente causaldel tizón común en frijol (Phaseolus vulgaris L.) oPseudomonas fluorescens Migula y Pseudomonas sp.fluorescentes aún sin identificar, causante de pudricionesblandas en tubérculos de papa (Solanum tuberosum L.), estánrepresentadas por siete y nueve aislamientos procedentes dediferentes hospedantes y áreas geográficas. Otras especiesestán representadas por un menor número de aislamientos ocepas (Cuadro 1). El péptido melitina se obtuvo de lacompañía SIGMA de México (Cat. M-7391), en presentaciónde cristales que se conservaron a -20oC. La secuencia deaminoácidos de este péptido es: Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2.Cultivos bacterianos. Para preparar el inóculo, cada una delas cepas se pusieron a crecer en 2 mL de medio LB líquido(Luria y Bertani, conteniendo 10 g·L-1 de bactotriptona, 5 g·L-

1 de extracto de levadura y 10 g·L-1 de NaCl), con agitacióncontínua a 25°C durante 24-48 h.Inhibición del crecimiento bacterial con el péptidomelitina. Los bioensayos se realizaron en placas de ELISAde 96 pozos; en cada pozo se colocaron 38 µL de medio LB,5 µL de diluyente 10X, 5 µL de péptido melitina en solución10X y 2 µL de inóculo bacteriano fresco de 24 h y diluído

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1:10 en LB, con un volumen final de 50 µL. La melitina sesolubilizó en el diluyente 1X de una solución 10X (ácidoacético 0.01% y BSA 2% en agua desionizada estéril). Lasmanipulaciones se llevaron a cabo dentro de una cámara deflujo laminar. Se evaluaron las siguientes concentraciones demelitina: 0, 6.5, 13, 19.5, 26, 32.5, 39 y 65 µM. Las placasinoculadas se colocaron dentro de una incubadora a 25°C,con agitación orbital de 100 rpm. El crecimiento bacteriano

se registró a las 16 h con un lector de ELISA LabsystemsUniskan II, con un filtro de 492 nm. Se utilizó como blancoel mismo volumen de medio LB con diluyente. Cadatratamiento se repitió dos a tres veces. Con los datos delcrecimiento con cada una de las concentraciones de melitinaevaluadas, se graficaron las curvas de inhibición delcrecimiento como porcentaje en relación al crecimiento conel testigo sin melitina. Se determinó la concentración mínima

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péptido catiónico fosfolípido

formación de canalestransitorios

formación de micelasy lisis

baja concentración

alta concentración

capa externa

capa interna

+++++

- ---

membranabicapa

péptido catiónico fosfolípido

formación de canalestransitorios

formación de micelasy lisis

baja concentración

alta concentración

capa externa

capa interna

++++++++++

- ---

membranabicapa

Fig. 1. Mecanismo de acción de los péptidos catiónicos antimicrobianos. Según el modeloalfombra, a bajas concentraciones se forman poros o canales transitorios. A medida quese incrementa la cantidad del péptido la membrana tiende a disgregarse debido a laformación de micelas que ocasionan la lisis bacteriana (adaptado de Oren y Shai, 1998;Zasloff, 2002).

de melitina para inhibir el crecimiento al 100% (I100) a las 16h de aplicado el tratamiento.Inhibición del crecimiento bacterial con el uso deantibióticos. Para comparar la actividad antimicrobiana delpéptido melitina con la de los antibióticos, se efectuó unensayo de inhibición del crecimiento de las mismas cepas enmedio LB líquido con los antibióticos tetraciclina (50 µg·mL-1) y kanamicina (100 µg·mL-1).

RESULTADOSUna de las propiedades más interesantes de los péptidoscatiónicos es su amplio rango de acción contra diferentesespecies de bacterias y hongos fitopatógenos. Las 39 cepasbacterianas probadas en este trabajo incluyeron siete génerosy 12 especies diferentes. Al analizar los distintos grados desusceptibilidad, no se encontró un patrón que permitieradiferenciar a los géneros o especies por su grado de

1 Xanthomonas axonopodis pv. translucens CIMMYT, Méx. 1996 trigo 6.52 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Puebla, Méx. 1995 frijol 13.03 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Puebla, Méx. 1995 frijol 13.04 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Puebla, Méx. 1995 frijol 19.55 Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Puebla, Méx. 1995 frijol 26.06 Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Puebla, Méx. 1995 frijol 6.57 Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Puebla, Méx. 1995 frijol 6.58 Xanthomonas campestris pv. campestris Edo. de México 1997 nabo 6.59 Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Puebla, Méx. 1995 frijol 6.510 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Edo. de México 1997 tomate 26.011 Agrobacterium tumefaciens Edo. de México 1998 durazno 6.512 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Edo. de México 1998 tomate 65.013 Agrobacterium tumefaciens Edo. de México 1995 durazno 26.014 Agrobacterium tumefaciens Edo. de México 1995 durazno 6.515 Agrobacterium tumefaciens Edo. de México 1995 durazno 6.516 Dickeya chrysanthemi Edo. de México 1997 zanahoria 65.0z

17 Dickeya chrysanthemi Edo. de México 1997 zanahoria 65.0z

18 Pectobacterium carotovorum Edo. de México 1997 nopal 6.519 Pectobacterium atrosepticum Edo. de México 1997 papa 13.020 Pectobacterium atrosepticum Edo. de México 1997 papa 39.021 Pantoea agglomerans Edo. de México 1997 nopal 19.522 Pantoea agglomerans Edo. de México 1997 nopal 26.023 Pectobacterium cacticida Saltillo, Méx. 1997 nopal 13.024 Pseudomonas sp. 1Nt Chapingo, Méx. 1998 frijol 19.525 Pseudomonas sp. 8Fu Texcoco, Méx. 1997 frijol 19.526 Pseudomonas sp. 10v Puebla, Méx. 1997 frijol 13.027 Pseudomonas sp. 10Bw Puebla, Méx. 1997 frijol 13.028 Pseudomonas sp. 20Ax Texcoco, Méx. 1997 frijol 19.529 Pseudomonas fluorescens Edo. de México 2000 papa 39.030 Pseudomonas fluorescens Montecillo, Méx. 2000 frijol 39.031 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Montecillo, Méx. 1999 frijol 39.032 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Montecillo, Méx. 1999 frijol 39.033 Pseudomonas fluorescens Montecillo, Méx. 2000 frijol 39.034 Pseudomonas aeruginosa ATCC 25853 Maryland, USA. agua 32.535 Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Montecillo, Méx. 2000 frijol 32.536 Pseudomonas fluorescens Montecillo, Méx. 2000 frijol 19.537 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Riverside, Cal. 1993 frijol 19.538 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Riverside, Cal. 1993 frijol 6.539 Escherichia coli DH5 αy Laboratorio humanos 26.0

Cepa Nombre científico Procedencia Año de Hospedante (µM melitina) colecta I100

Cuadro 1. Relación de bacterias fitopatógenas y su suceptibilidad al péptido antimicrobiano melitina.

t,u,v,w,xIdentificadas como nuevas bacterias patógenas del frijol (Phaseolus vulgaris) (Silva-Rojas, 2000).yE. coli DH5α se utilizó como testigo de la efectividad de la melitina.zInhibición parcial (< 100%).

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Autónoma Chapingo, por facilitar parte del equipo requeridopara la realización del presente trabajo.

LITERATURA CITADAAlberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y

Watson, J.D. 1996. Biología Molecular de la Célula.Tercera Edición. Ediciones Omega, S.A. Barcelona.España. 1387 p.

Alippi, A.M., López, A.C., Rollan, M.C., Ronco, L., andAguilar, O.M. 2002. Fluorescent Pseudomonas speciescausing post-harvest decay of endives in Argentina. RevistaArgentina de Microbiología 34:193-198.

Andreu, D., and Rivas, L. 1998. Animal antimicrobialpeptides: an overview. Biopolymers (Peptide Science)47:415-433.

Chakrabarti, A., Ganapathi, T.R., Mukherjee, P.K., and Bapat,V.A. 2003. MSI-99, a magainin analogue, impartsenhanced disease resistance in transgenic tobacco andbanana. Planta 216:587-596.

Gardan, L., Gouy, C., Christen, R., and Samson, R. 2003.Elevation of three subspecies of Pectobacteriumcarotovorum to species level: Pectobacteriumatrosepticum sp. nov., Pectobacterium betavasculorum sp.nov. and Pectobacterium wasabiae sp. nov. InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology53:381-391.

Gavini, F., Mergaert, J., Beji, A., Mielcarek, C., Izard, D.,Kersters, K., and De Ley, J. 1989. Transfer of Enterobacteragglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 toPantoea gen. nov. as Pantoea agglomerans comb. nov.and description of Pantoea dispersa sp. nov. InternationalJournal of Systematic Bacteriology 39:337-345.

Hancock, R.E.W., and Lehrer, R. 1998. Cationic peptides: anew source of antibiotics. Trends in Biotechnology 16:82-88.

Jones, R.W., and Prusky, D. 2002. Expression of an antifungalpeptide in Saccharomyces: a new approach for biologicalcontrol of the postharvest disease caused byColletotrichum coccodes. Phytopathology 97:33-37.

Liao, C.H. 1991. Cloning of pectate lyase gene pel fromPseudomonas fluorescens and detection of sequenceshomologous to pel in Pseudomonas viridiflava andPseudomonas putida. Journal of Bacteriology 173:4386-4393.

López-García, B., Pérez-Payá, E., and Marcos, J.F. 2002.Identification of novel hexapeptides bioactive againstphytopathogenic fungi through screening of a syntheticpeptide combinatorial library. Applied and EnvironmentalMicrobiology 68:2453-2460.

Matsuzaki, K. 1999. Why and how are peptide-lipidinteractions utilized for self-defense?. Magainins andtachyplesins as archetypes. Biochemical et Biophysics Acta1462:1-10.

Oren, Z., and Shai, Y. 1998. Mode of action of linearamphipathic α-helical antimicrobial peptides. Biopolymers(Peptide Science) 47:451-463.

Osusky, M., Guoqing, Z., Osuska, L., Hancock, R.E., Kay,W.W., and Misra, S. 2000. Transgenic plants expressingcationic peptide chimeras exhibit broad-spectrumresistance to phytopathogens. Nature Biotechnology18:1162-1166.

Rojas, A.M., García-de los Rios, J.E., Fischer-Le Saux, M.,Jiménez, P., Reche, P., Bonneau, S., Sutra, L., Mathieu-Daude, F., and McClelland, M. 2004. Erwinia toletanasp. nov., associated with Pseudomonas savastanoi-inducedtree knots. International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 54:2217-2222.

Samson, R., Legendre, J.B., Christen, R., Fischer-LeSaux,M., Achouak, W., and Gardan, L. 2005. Transfer ofPectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al., 1953)Brenner et al. (1973) and Brenneria paradisiaca to thegenus Dickeya gen. nov. as Dickeya chrysanthemi comb.nov. and Dickeya paradisiaca comb. nov. and delineationof four novel species: Dickeya dadantii sp. nov., Dickeyadianthicola sp. nov., Dickeya dieffenbachiae sp. nov. andDickeya zeae sp. nov. International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology 55:1415-1427.

Sasser, M. 1990. Identification of bacteria through fatty acidanalysis. pp. 199-204. In: Z. Klement, K. Rudolph, andD.C. Sands (eds.). Methods in Phytobacteriology.Akademiai Kiado. Budapest, Hungary. 565 p.

Silva-Rojas, H.V. 2000. Caracterización de BacteriasFitopatógenas Causantes de Manchas Foliares en el Cultivode Frijol (Phaseolus vulgaris L.) en México. Tesis deDoctorado en Ciencias. Colegio de Postgraduados.Montecillo, Edo. de México. 116 p.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant-pathogenic and someother Pseudomonas spp. by using cellular fatty acidprofiles. International Journal Systematic of Bacteriology42:281-295.

Steiner, H., Hultmark, D., Engstrom, B.H., and Boman, H.G.1981. Sequence and specificity of two antibacterialproteins involved in insect immunity. Nature 292:246-248.

Thurlow, L.R., and Gillock, E.T. 2005. Characterization oftwo environmental bacterial isolates by 16S rRNAsequence analysis, fatty acid methyl ester analysis, andscanning electron microscopy. Transactions of the KansasAcademy of Science 108:22-31.

Torres-Larios, A., Gurrola, G., Zamudio, F., and Possani, L.2000. Hadrurin, a new antimicrobial peptide from thevenom of the scorpion Hadrurus aztecus. EuropeanJournal of Biochemistry 267:5023-5031.

Trun, N., and Trempy, J. 2004. Fundamental BacterialGenetics. Blackwell Science Ltd. Oxford, UK. 287 p.

Zasloff, M. 2002. Antimicrobial peptides of multicellularorganisms. Nature 415:389-395.

182 / Volumen 23, Número 2, 2005