informe saponinas

FACULTAD DE QUMICA E INGENIERA QUMICA

E.A.P. Qumica

Departamento de Qumica Orgnica

LABORATORIO DE PRODUCTOS NATURALES

PRACTICAS N 2

Triterpenoides y Saponinas Triterpenoidales

HORARIO: JUEVES 9:00 AM - 1:00 PM.

PROFESORA: Mg. Qca. Gloria Eva Toms Chota

ALUMNOS:

CALVO CHOCCE KAREN 08070059

LZARO HERRERA JOS ANTONIO 08070009



I. INTRODUCCIN

as saponinas (del latn: sapo = jabn) pueden ser de naturaleza esteroide o

triterpnica, por tanto de carcter poco polar. Se encuentran en plantas y se

caracterizan por sus propiedades detergentes es decir, producen abundante

espuma en medio acuoso, esta espuma se forma debido a que las saponinas disminuyen

la tensin superficial del agua, es decir, son tensioactivos naturales. En la actualidad en

muchas comunidades rurales se emplea el amole tanto para lavar ropa fina, como para

evitar que se deteriore, ya que es un detergente neutro perfectamente degradable. Las

saponinas se han usado tambin como veneno de peces, macerando en agua un poco

del rgano vegetal que lo contiene, con la ventaja de que los peces muertos por este

procedimiento no son txicos. Adems, las saponinas tienen la capacidad de aumentar

la permeabilidad de las paredes celulares y destruir los hemates por hemolisis.

As mismo, tienen un elevado peso molecular y se hidrolizan mediante cidos (como

todos los hetersidos) o, mediante enzimas, dando la aglicona y los diversos azcares y

cidos urnicos relacionados. Su aislamiento en estado puro es difcil. Se extraen con

alcoholes o soluciones hidroalcohlicas, tras una deslipidacin previa. La concentracin

de las soluciones se dificulta por la tendencia que tienen stas a formar

L



II. MARCO TERICO

Se distinguen dos clases de saponinas: triterpnoide y saponinas estereoidales. Ambos

tienen un origen biogentico comn, va cido mevalnico y unidades isoprenoides. Las

saponinas se pueden encontrar en rganos vegetales muy diversos. Los de carcter

monodesmosdico se dan con preferencia en races, cortezas y semillas, mientras que los

bidesmosdicos, ms hidrosolubles, muestran preferencia por los tejidos de asimilacin

como las hojas y ramas tiernas.

Saponinas esteroidales

Las geninas esterodicas derivan de un esqueleto hexacclico de 27 tomos de carbono,

que es el ncleo espirostano.

Algunas saponinas esteroidales son de gran inters e importancia por su relacin con

compuestos como las hormonas sexuales, cortisona, esteroides diurticos, vitamina D y

hetersidos cardacos. Por este motivo, algunos son utilizados como material de partida

para la sntesis de estos compuestos. En este sentido, destaca el uso de la diosgenina,

saponina que se obtiene, principalmente a partir de las partes subterrneas de distintas

especies de lianas herbceas tropicales del gnero Dioscorea. Para que stas posean

inters industrial, su contenido en diosgenina debe ser superior al 3%. Adems, hay

otras plantas utilizadas como fuente de diosgenina, como la alholva (Trigonella foenum-

graecum), que es bastante interesante por tener un ciclo de cultivo corto (las semillas se

obtienen en 3-5 meses). Tambin se utiliza mucho la hecogenina, que es un saponsido

muy semejante a la diosgenina. La hecogenina se obtiene de distintas especies de agaves

o sisales.

Saponinas triterpnicas

Las saponinas del grupo triterpeno se encuentran extensamente distribuidas, y

constituyen la mayora de las saponinas encontradas en la naturaleza: una gran variedad

de ellas difieren nicamente en el nmero y tipo de unidades de azcares unidas a las

sapogeninas; generalmente pertenecen al grupo de la B-amirina, otras pocas son

derivadas de la amirina, del lupeol y del grupo de triterpeno tetraciclios. Las fuentes

naturales ricas en saponinas triterpenoidales son el ginseng, la alfalfa, la avena, la quinua

y soya entre otras.



PROPIEDADES

En general, las saponinas son solubles en mezclas hidroalcohlicas e insolubles en

disolventes orgnicos de media y baja polaridad. Sin embargo, las geninas libres no son

solubles en agua y s en disolventes orgnicos apolares.

Su principal propiedad fsica es que en solucin acuosa son agentes tensioactivos, es

decir, son capaces de formar espuma (poder afrgeno) y formar emulsiones. Son difciles

de cristalizar.

En contacto con la sangre son hemolticos, ya que interaccionan con el colesterol de la

membrana de los eritrocitos. El poder hemoltico es caracterstico de las saponinas

triterpnicas, pero es variable segn los sustituyentes de la estructura. As, las saponinas

monodesmosdicos son hemolticos mientras que los bidesmosdicos no lo son. Debido a

su poder hemoltico resultan muy txicos si se administran por va intravenosa, ya que

de esta manera contactan directamente con la sangre, mientras que por va oral su

toxicidad es muy baja.

La mayora de las saponinas son ictiotxicos, es decir, son txicos para animales de

sangre fra, sobre todo para los peces.

Acciones farmacolgicas

Desde el punto de vista farmacolgico, las drogas con saponinas pueden tener diferentes

acciones, las cuales se deben, sobre todo, a las saponinas triterpnicas. Sin embargo, hay

que tener en cuenta que, por va oral y en dosis altas, las saponinas irritan la mucosa

bucofarngea y digestiva, causando dolor abdominal, vmitos y diarrea.

A continuacin, comentaremos las acciones farmacolgicas ms destacables de las drogas

con saponinas.

Accin expectorante

Es una de las acciones ms clsicas de las drogas con saponinas, la cual deriva de la

estimulacin de la secrecin traqueobronquial por un reflejo autonmico con origen en

la mucosa gstrica.

Efecto diurtico

Las saponinas tienen la capacidad de aumentar la circulacin sangunea a nivel renal, con

lo que la filtracin glomerular se ve aumentada y, por tanto, se da un efecto diurtico.

Efecto antiedematoso y antiinflamatorio

Algunas saponinas presentan este efecto (p. ej., la escina del castao de Indias, sobre

todo en cuanto a la insuficiencia venosa en las extremidades inferiores).



Accin adaptgena

Algunas saponinas pueden tener un efecto estimulante, tonificante y antiestrs.

Efecto molusquicida

Muchas saponinas resultan txicas para los moluscos, motivo por el cual en los pases

tropicales se recurre a ellos como molusquicidas, ya que con ello se rompe la cadena de

transmisin de las esquistosomiasis. nicamente son molusquicidas las saponinas

monodesmosdicas, pero por hidrlisis las bidesmosdicas se pueden convertir en

monodesmosdicas.

Algunos beneficios ms de la saponina:

Puede descomponer la grasa, acelerar la absorcin de nutrientes y digestin

Efectos Antioxidantes

Efectos anticancergenos

Ayuda en funcin erctil.

Revitaliza la actividad enzimtica en las clulas apoyando el metabolismo.

Incrementa la energa, revigoriza, ayuda a recuperacin de fatiga.

Ayuda en casos de letargo y falta de apetito.

Mejora la protena de sntesis del suero.

Estimula la actividad enzimtica involucrada en el proceso de reparacin y

construccin de hueso, e incrementa la deposicin de calcio por las clulas de la

mdula sea.

Mejora la flexibilidad de forma significativa y baja la presin arterial.

Ayuda en casos de depresin al incrementar los niveles de ciertos

neurotransmisores como serotonina, dopamina y noradrenalina.



III. DETALLES EXPERIMENTALES

Se realizaron diferentes pruebas a las siguientes muestras:

Avena

Quinua

Soya

Paico

Ginseng

Maca

Prueba de la espuma

Reactivo de salkowski: H2SO4 + anhidrido acetico

Variante A de reaccin salkowski: cloroformo + anhidrido actico +

H2SO4

Variante B de reaccin salkowski : cloroformo + H2SO4

Reactivo Liebermann-Buchard: HOAc + AC2O/ H2SO4(50:1)

H2SO4

HCl

AVENA QUINUA SOYA PAICO GINSENG

G

MACA



IV. RESULTADOS

Prueba de la espuma

Reactivo de salkowsk

AVENA

QUINUA

SOYA

PAICO

GINSENG

G

MACA


G

MACA



Variante A de reaccin salkowski

Variante B de reaccin salkowski

AVENA

QUINUA

SOYA

PAICO

GINSENG

G MACA


G

MACA



Reactivo Liebermann-Buchard:

H2SO4 y HCl


G

MACA

AVENA

QUINUA

SOYA

PAICO

GINSENG

G

MACA

AVENA

QUINUA

SOYA

PAICO

GINSENG

G

MACA

H2SO4 HCl



TABLA DE RESULTADOS

Muestra

Prueba de

La

espuma

Reactivo

de

salkowski

Variante

A de

reaccin

salkowski

Variante B

de

reaccin

salkowski

Reactivo

Liebermann-

Buchard

H2SO4 HCl

Avena --- + (rojo) +(rojo) +(rojo) +(verde) +(rojo) -

Quinua +++ + (rojo) +(rojo) +(rojo) +(verde) +(rojo) -

Soya ++ + (rojo) +(rojo) +(rojo) +(verde) +(rojo) -

Paico +++ - - - - - -

Ginseng ++++ - - - - - -

Maca +++ + (rojo) +(rojo) +(rojo) - +(rojo) -



V. DISCUSION DE RESULTADOS

La prueba de la espuma se realiz con el fin de determinar si haba o no

presencia de saponinas aprovechando la propiedad de detergencia. Al agregar

agua, las saponinas disminuyen la tensin superficial de sta, aumentando la

capacidad de penetracin del agua lo cual facilita la formacin de pequeas

gotas, es por eso que al momento de sacudir o agitar la solucin, se forma una

espuma abundante y relativamente estable formando un sistema coloidal. En la

experiencia se observ que solo en una muestra (avena) no se form espuma

debido a que la avena da resultado positivo con agua caliente.

La prueba con el reactivo de Salkowski se realiz con la finalidad de indicar la

presencia de saponinas triterpenoidales o esteroidales dando como resultado

coloracin rojo sangre la cual se observ en todas las muestras excepto en el

paico y en el ginseng esto debido a que tal coloracin fue apantallada por la

clorofila dando como resultado una coloracin marrn. As mismo en la prueba

con las variantes A y B de la reaccin de Salkowski se comprob que en las

muestras existan saponinas triterpenicas lo cual fue evidenciado por la

coloracin rojiza que presentaron, en la prueba de Liebermann- Burchard los

resultados fueron positivos en las muestras de avena quinua y soya debido a la

formacin de un color verde claro evidenciando una la presencia de saponinas

esteroidales lo cual resulta contradictorio con las pruebas con el reactivo de

Salkowski.



VI. CONCLUSIONES

Ya que las saponinas tienen propiedades detergentes, comprobamos su presencia

al generar espuma por agitacin en diferentes tipos de muestras, de esta manera

pudimos observar la cantidad de saponinas en relacin a la espuma producida en

cada planta.

Comprobamos la presencia de saponinas as como el tipo de saponinas para

poder diferenciarlas:

La reaccin de Salkowski indica la presencia de saponinas que podran ser

triterpenicas o esteroidales a travs de una coloracin de amarillo a rojo

sangre; sin embargo no indica el tipo de saponina.

La variante A de Salkowski indicara el tipo de saponina: rojo grosella para

las saponinas triterpenicas y azul verdosa para las esteroidales.

La variante B permitir diferenciar si se trata de una saponina esteroidal si da

una coloracin rojo azulado hasta purpura; y si la coloracin da un rojo ser

colesterol.

Y la reaccin de Libermann Burchard

Tambin nos permiti reconocer si se trataba de una saponina triterpenica o

esteroidal a traves de la coloracin.



CUESTIONARIO

1. De todas las reacciones realizadas para comprobar saponinas, cul es a su criterio

la ms contundente para determinar la presencia de este metabolito?

La ms contundente para determinar la presencia de saponinas es con el reactivo de

Salkwoski debido que mediante ste podemos determinar la presencia de saponinas y

adems con sus variantes A y B podemos determinar si son saponinas triterpenoidales o

estereoidales de acuerdo a la coloracin que presenten las muestras al tener contacto

con este reactivo.

2. Qu propiedades fsicas las caracteriza y cules de ellas son preferidas por las

diferentes industrias.

- Las saponinas tienen propiedades surfactantes o detergentes, debido a que son

anfipticas, es decir tienen un componente hidroflico, que es el azcar, por medio del

cual se unir al agua y otro lipoflico, que el esteroide o el triterpeno, por medio del

cual se unir la grasa.

- Tienen accin irritante sobre las clulas a nivel del parnquima pulmonar se traduce en

accin expectorante, en las clulas renales accin diurtica y sobre los glbulos rojos

accin hemoltica, sta se produce porque las saponinas aumentan la permeabilidad de

las paredes celulares.

Estas propiedades son las ms utilizadas en la industria la primera en industria de jabones

y detergentes, y la segunda propiedad en medicina en elaboracin de drogas con

saponinas las cuales producen una accin expectorante, diurtica, depurativa, tnico-

venosa y de disminucin del colesterol

3. Nombre 5 aplicaciones industriales de importancia comercial que se le den a este

metabolito. Especifique.

Las saponinas en la industria tienen mltiples aplicaciones como se muestra a

continuacin:

Agente emulsionante de grasas y aceites

Protector de sustancias coloidales.

En cosmtica: Dentfrico, jabones, productos para la limpieza del cabello,

formulacin para tinturas y coloraciones para el pelo. Agente espumante para

bao, no txico, con efectos endermatosis y sueo profundo. Shampoo y

acondicionador.

Se agrega a las bebidas para obtener espuma y en extinguidores de incendio.

La saponina presenta algunos usos en medicina especialmente en enfermedades

respiratorias y drmicas. Por su semejanza estructural con algunos esteroides,

podra participar en la produccin de hormonas sintticas para el control de la

natalidad.

Se destaca tambin la accin hemoltica.



4. Investigue 4 pruebas diferentes que se le hacen a estos metabolitos, que no haya

realizado en la prctica.

a. Ensayo de Hemlisis

Este ensayo es ms confiable que el de la espuma. A una suspensin de glbulos rojos en

solucin salina diluida, se aade una solucin de la muestra que se presume que es o que

contiene saponinas. Si los glbulos rojos se rompen (lisan o hemolizan), se asume que la

prueba es positiva. Este ensayo puede realizarse en tubo de ensayo, en placas de Petri

con agar-sangre o en placas de Petri con gelatina-sangre. Cuando la muestra contiene

taninos, deben eliminarse antes de realizar la prueba ya que la interfieren. Esto se logra

por tratamiento repetido de la muestra con xido de magnesio, el cual forma complejos

insolubles con los taninos, por lo cual es fcil eliminarlos por filtracin.

b. Ensayos para carbohidratos

La presencia de carbohidratos ligados puede reconocerse fcilmente mediante ensayos

como el de Molisch, el de la Antrona, etc., o mediante anlisis por cromatografa en

papel, utilizando carbohidratos de referencia.

5. Investigue un mtodo cuantitativo de extraccin de saponina. Descrbalo.

Entre los diversos mtodos de extraccin de saponinas se tienen el mtodo Soxhlet y el

de extraccin asistida por ultrasonido, en ambos se utilizan solventes polares, como

alcoholes y mezclas de estos con agua, y butanol-etanol. La extraccin Soxhlet es un

mtodo cclico en el que se usa un equipo de tres piezas (baln, cmara extractora y

condensador) que se utiliza para extraer compuestos contenidos en materiales slidos. El

compuesto se diluye en el solvente por afinidad polar que hay entre ambos

producindose una solucin del compuesto en el disolvente que se ira concentrando a

medida que el ciclo se repita.

El mtodo de extraccin asistido por ultrasonido proporciona una alta eficiencia de

contacto en la muestra entre la matriz y el disolvente. Un efecto de cavitacin snica es

producido bajo la irradiacin del ultrasonido en donde microburbujas son formadas

cuando la presin negativa es suficientemente alta. Una vez creadas, estas burbujas

crecen y se comprimen cuando las presiones son negativas y positivas respectibvamente,

la constante de expansin y compresin genera el colapso de las burbujas en donde se

rompen las paredes celulares y facilitan la penetracin de solvente en estas, se aumenta

la temperatura disminuyendo la viscosidad y estos factores hacen que el fenmeno de

transferencia de masa sea mejor.



Por medio de un ejemplo explicaremos el mtodo:

EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE SAPONINAS EN EL BAGAZO DE FIQUE

PROCEDIMIENTO

Unidad de bao de ultrasonido utilizada

para la extraccin de saponinas

Equipo Soxhlet utilizado para extraccin

de saponinas



EXTRACCIN:

La extraccin se realiz por dos mtodos: el tradicional usando el equipo Sxholet

(130ml de capacidad) y la extraccin asistida por ultrasonido EAU (ELMASONIC E30H

37KHz).

Diseo experimental para las pruebas de investigacin: el tiempo de extraccin con el

equipo Sxholet se realiz por triplicado por 4-8 horas; mientras que por ultrasonido

solo fue por duplicado por 1-2 horas. La relacin solvente-bagazo fueron 7ml/14g; la

relacin de sistemas de solventes: metanol-agua 30/70 y 70/30; butanol-agua 30/70 y

50/50.

FILTRADO:

Se realiz con un equipo Buchner mediante vacio, la porcin solida fue desechado,

mientras que el filtrado paso por una etapa de evaporacin de solvente a 50C a

presin atmosfrica hasta la sequedad.

DILUCIN:

Con los extractos secos libre de solvente, la dilucin se llevo a cabo con agua destilada a

temperatura ambiente (250ml para el extracto de Sxholet y 100 ml para ultrasonido).

DESENGRACE:

Se cogi una alcuota de la solucin de extracto y se le adiciono n-hexano (proporcin

1:1) todo en una pera de decantacin; agitamos eliminamos los gases formados y

dejamos reposar por 2 horas observando la formacin de 3 fases: lipidica, n-hexano en

exeso y el extracto de saponias libre de grasa, las dos primeras fases son desechadas y el

estracto de saponinas son llevadas a hidrlisis.



HIDRLISIS:

Para la ruptura del enlace glicosidico, es decir para romper el enlace azcar y

sapogenina, lo realizamos mediante hidrlisis acida.

Esto se realiz en un baln y a reflujo con cido HCl 2.5N a temperatura de 90C

durante 4 horas, luego de esto se deja enfriar y se observaron los precipitados de color

marrn la cual da evidencia de sapogeninas producto de la hidrlisis acida del extracto

de saponina desengrasada.

SECADO:

El precipitado (sapogenina) se seca en una placa Petri en la estufa a 60C durante 24

horas, luego se llevan a un desecador.

CUANTIFICACIN:

Wsap: peso de saponina hidrolisada.

A: fraccin de alcuota tomada para el desengrase.

B: peso del bagazo utilizado.

Los resultados que se muestran en la tabla indican que el mtodo por ultrasonido tiene

mayor rendimiento, adems menor tiempo de extraccin; por lo tanto ms eficiente

(rendimiento y economa).

En la EAU la viscosidad es un factor determinante ya que influye en la velocidad de

trasferencia de masa, mientras que para cada sistema de solvente en la extraccin

Sxholet la temperatura de ebullicin de la mezcla de solventes y la capacidad calorfica

afectan cada ciclo.



6. Cmo se puede purificar las saponinas? Especifique.

Una vez obtenida la saponina cruda, se procede a su purificacin por cromatografa en

columna o liquida de alta eficiencia. En cromatografa en columna, se puede utilizar

silica gel y eluyentes con los BAW y mezclas Cloroformo-metanol-agua.

Para el anlisis cromatogrfico en capa fina para saponinas no hidrolizadas:

A partir del lavado de la quinua se obtuvo las saponinas, las cuales con el fin de

identificar que compuestos son se realiza una cromatografa, empleamos como soporte:

silica gel 60 F254 (MERCK), fase mvil: hexano /acetato de etilo (1:1), y como

revelador una solucin de vainillina en cido fosfrico al 1%, calentamos a 105C en

una estufa durante 5 minutos.

7. Indique 10 alimentos o plantas donde se encuentren saponinas y que estn

reportados en la literatura, indique sus referencias.

Alimento Fuente

Qunoa

http://www.botanical-online.com/quinoa_propiedades.htm

Ginseng

https://www.fgxpress.org/content/FGXpress/WhatIsSaponinSP.pdf

Esprragos

http://www.ficarra.com.ar/yuca.html

Albahaca

http://www.rdnattural.es/plantas-y-nutrientes-para-el-

organismo/plantas/albahaca/



Garbanzos

http://www.fen.org.es/mercadoFen/pdfs/garbanzos.pdf

Soja

http://www.casapia.com/Pagine sylos/Lasojaenpolvo.htm

Cola de

caballo

http://www.plantasparacurar.com/composicion-de-la-cola-de-caballo/

Murdago

http://www.hierbamedicinal.es/beneficios-del-muerdago

Hiedra

http://www.rdnattural.es/plantas-y-nutrientes-para-el-

organismo/plantas/hiedra/

Maca

http://www.lineaysalud.com/medicina-alternativa/239-la-maca-andina-o-

maca-del-peru.html



8. En relacin a las saponinas esteroidales , indique que parecido tiene con la

cortisona? Qu son corticoides? Cul es la utilidad en el ser humano?

Las saponinas estereoidales son precusores de las cortisonas las cuales tambin son

hormonas esteroidales.

Los corticoides son un tipo de hormona producida por las glndulas suprarrenales, las

cuales se sitan en la parte superior de cada rin. Estas hormonas cumplen un papel

fundamental en la regulacin de distintas funciones del organismo, especialmente en el

metabolismo de carbohidratos, las protenas y los lpidos, sobre el equilibrio de

electrolitos y agua y sobre algunas funciones del aparato cardiovascular, rin, msculo

esqueltico y sistema nervioso, entre otros. La ciencia, basndose en las propiedades de

estos corticoides presentes en nuestro organismo, ha desarrollado una serie de

medicamentos que, utilizados bajo la supervisin del mdico, constituyen una excelente

herramienta teraputica en el tratamiento de enfermedades de diversa ndole. Entre los

corticides ms conocidos estn, la Hidrocortisona, Betametasona, Prednisona,

Beclometasona, Fluticasona, etc.

En general, se distinguen diferentes afecciones en las cuales la terapia con corticoides es

una alternativa importante, especialmente en el tratamiento de las enfermedades no

endocrinas como:

Desrdenes reumticos y enfermedades del colgeno (Artritis reumatoidea,

Lupus eritematoso, etc.)

Enfermedades Respiratorias (Asma, Bronquitis obstructiva, etc.)

Enfermedades Dermatolgicas (Alergias, Dermatitis, etc.)

Enfermedades Oftalmolgicas (Alergias estacionales)

Enfermedades Renales (Sndrome Nefrtico)

9. Fundamente el mecanismo de accin de una saponina? Es diferente entre una

saponina tritrpenica que una esteroidal?

El mecanismo de accin de las saponinas consiste en su poder anti - ATPasa don al cual

modifica este sistema en la membrana, perturbando el transporte de sodio a travs de

ella (descompensacin inica); el estmulo nervioso queda paralizado manifestndose

una par lisis de las clulas musculares quedando la musculatura respiratoria paralizada

causando la muerte del animal por asfixia. Las saponinas irritan el tracto gastrointestinal,

incrementando la permeabilidad de las clulas del epitelio permitiendo su entrada en el

torrente circulatorio y su accin hemoltica. Reducen la absorcin del colesterol (al

interaccionar con los cidos biliares), disminuyen la funcionalidad intestinal e influyen en

la digestin y absorcin de distintos componentes de la dieta. Es por lo que a las aves de

granja se les incluye colesterol en la dieta para que forme complejos insolubles con las

saponinas e inactiven su accin txica que inhibira se crecimiento y la produccin de

huevos.



10. Investigue en los ltimos cinco aos que trabajos de saponinas se han realizado

en la UNMSM?( Referencia : Facultad de Farmacia, Qumica, Biologicas)

En la Facultad de Farmacia y Bioqumica de UNMSM se realiz una investigacin sobre

la extraccin de saponinas de la quinua y su aplicacin en la cosmtica concluyendo que

las saponinas se encuentran en mayor abundancia en la cascarilla de la quinua, as

mismo la extraccin se hizo con el mtodo Soxhlet.



VII. BIBLIOGRAFIA

http://www.dfarmacia.com/farma/ctl_servlet?_f=37&id=13015492

http://www.bvsde.paho.org/texcom/manualesMEC/fitoterapia/cap4.pdf

http://bibliotecavirtual.dgb.umich.mx:8083/jspui/bitstream/123456789/4881/1/EXTR

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http://www.redalyc.org/pdf/730/73000311.pdf

http://farmacia.udea.edu.co/~ff/saponinas2001.pdf

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