UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA

TEMA:

ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y QUÍMICO COMPARATIVO DE LAS

SEMILLAS DE MIMUSOPS sp EN DOS ESTADOS DE MADURACIÓN.

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO

PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

AUTORES:

Dario Rafael Panchana Tigrero

Anmar Madelein Velásquez Chalco

TUTOR:

QF. KATHERINE ELIZABETH BUSTAMANTE PESANTES. MSc

GUAYAQUIL-ECUADOR

2018

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, queremos agradecer a Dios, por permitirnos llegar a este

momento especial de nuestras vidas, sus fortalezas y bendiciones son uno de

los cimientos fundamentales de este trabajo. También infinitas gracias a nuestros

padres y familias, por todo el apoyo incondicional a lo largo de estos años de

estudio, sus palabras de aliento, sus cariños en la cercanía y a la distancia, sus

increíbles consejos que hacen posible lo imposible y nos dan ese empuje para

llegar a nuestras metas.

Agradecer sin duda a nuestros grandes compañeros, amigos y ahora colegas,

personas que empezaron como extraños y en la actualidad nada sería lo mismo

sin ellos, mil gracias.

A nuestra tutora Q.F. Katherine Bustamante, con mención especial para la Dra.

Migdalia Miranda, profesionales en su labor, compartiendo sus conocimientos,

creciendo junto a nosotros en la realización de esta investigación; sus

enseñanzas, esfuerzos y dedicación complementan de manera idónea lo que es

para nosotros un logro a nivel profesional y personal.

I

DEDICATORIA

Este trabajo va dedicado con mucho afecto y cariño para nuestros padres,

personas que, en su humildad y gran corazón, formaron con amor, cansancio,

dedicación y esmero a los profesionales que somos hoy en día, esto no sería

posible sin ellos.

Dedicamos también este logro a la Dra. Migdalia Miranda, por prestar su tiempo

y esfuerzo en la culminación de esta tesis, que a pesar de que tuvo muchos

altibajos durante la experimentación, siempre supo cómo resolverlos y sacar

adelante la investigación junto a nosotros mientras aprendíamos de nuestros

errores.

II

RESUMEN

Originalmente de Asia, el género Misumops ha sido empleado de forma

tradicional a través de los años. Diferentes especies introducidas a América

demostraron poseer agentes químicos de interés, siendo la variante en estudio

denominada como Mimusops sp, según la clasificación genética y taxonómica.

Mediante el trabajo de investigación se sometió a las semillas en los estados de

maduración verde y madura, a un estudio farmacognóstico y químico. Se informa

de las diferencias entre sus dimensiones, también se reporta sobre algunas

propiedades fisicoquímicas las cuales entran dentro del rango de la farmacopea

para drogas vegetales, la presencia de compuestos grasos, triterpenos-

esteroides, azúcares reductores, taninos y saponinas como sus compuestos más

destacados. Las diferencias más relevantes se encuentran en el extracto

alcohólico, donde las estructuras encontradas no presentan coincidencia entre

semillas verdes y maduras, no pudiéndose elucidar los esqueletos de saponinas.

Palabras claves: Agentes químicos, semillas, Mimusops, saponósidos

triterpénicos, parámetros, screening, fitoquímica

III

ABSTRACT

Originally from Asia, the Misumops genre has been used traditionally

over the years. Different species introduced to America showed that they are

chemical agents of interest, being the variant in the study as Misumops sp,

according to the genetic and taxonomic classification. Through the research work,

a pharmacognostic and chemical study was submitted to the seeds in the stages

of green and mature maturation. It is reported the differences between its

dimensions, it is also reported on some physicochemical properties, which fall

within the range of the pharmacopoeia for plant drugs, the presence of fatty

compounds, triterpenes-steroids, reducing sugars, tannins and saponins as their

compounds more featured. The most relevant differences are found in the

alcoholic extract, where the found structures do not coincide between green and

mature seeds, and the skeletons of saponins can not be elucidated.

Keywords: Chemical agents, seeds, Mimusops, triterpene saponosides,

parameters, screening, phytochemistry

IV

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1

CAPÍTULO I: PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN ..................................................... 3

I.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................... 3

I.2 PROBLEMA ......................................................................................................... 3

I.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA ...................................................................... 4

I.4 OBJETIVOS GENERALES ................................................................................... 5

I.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 5

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO ................................................................................. 6

II.1 ANTECEDENTES ............................................................................................... 6

II.2 BASES TEÓRICAS Y CIENTÍFICAS ................................................................. 11

II.2.1 Saponinas. Generalidades .......................................................................... 11

II.2.2 Características químicas ............................................................................. 12

II.2.3 Saponinas triterpénicas: Principales núcleos estructurales, Métodos de

extracción y caracterización. Reacciones de identificación y biosíntesis .............. 15

II.2.3. Saponinas esteroidales: Principales núcleos estructurales, Métodos de

extracción y caracterización. Reacciones de identificación .................................. 18

II.2.4. Extracción y purificación de las saponinas esteroidales ............................. 19

II.3 GLOSARIO DE TÉRMINOS .............................................................................. 22

CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS................................................................ 24

Ill.1 Método de la investigación ................................................................................ 24

Ill.1.1 Variables .................................................................................................... 24

llI.1.2 Criterios de inclusión y exclusión ................................................................ 24

llI.1.3 Operacionalización de las variables ............................................................ 24

llI.2 Recolección ...................................................................................................... 25

llI.3 Secado ............................................................................................................. 25

llI.4 Evaluación macro morfológica .......................................................................... 26

llI.5 Propiedades físicoquímicas: Humedad, cenizas totales, cenizas insolubles en

HCl, Sustancias solubles. ........................................................................................ 26

llI.5.1 Humedad residual ...................................................................................... 26

llI.5.2 Cenizas totales ........................................................................................... 27

llI.5.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico ...................................................... 27

V

llI.5.4 Sustancias solubles .................................................................................... 28

llI.6 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico ...................................................... 29

llI.7 Macerado y concentrado de la muestra vegetal ................................................ 30

III.8 Determinación de Rendimiento Porcentual ....................................................... 31

III.9 Reacción de silanización .................................................................................. 32

III.10 Análisis de los extractos por el sistema acoplado CG-EM .............................. 32

CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................ 33

lV.1 Evaluación macro morfológica .......................................................................... 33

lV.2 Parámetros físicoquímicos: .............................................................................. 35

IV.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico ........................ 37

IV.4 Extracción y análisis de los extractos alcohólicos de las semillas ..................... 40

IV.4.1 Extracción .................................................................................................. 40

IV.2 Análisis de los extractos alcohólicos ............................................................. 41

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................... 48

V.1 CONCLUSIONES ............................................................................................. 48

V.2 RECOMENDACIONES ..................................................................................... 49

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 50

VI

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Operacionalización de las variables ................................................... 24

Tabla II. Cálculos estadísticos del largo y ancho de las semillas ..................... 34

Tabla III. Parámetros físicoquímicos de las semillas de Mimusops sp ............. 35

Tabla IV. Tamizaje fitoquímico de las semillas de Mimusops sp ...................... 37

Tabla V. Rendimiento porcentual de compuestos solubles en etanol de las

semillas de Mimusops sp ................................................................................. 40

Tabla VI. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas de

los frutos verdes de Mimusops sp .................................................................... 43

Tabla VII. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas de

los frutos maduros de Mimusops sp ................................................................. 45

VII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Saponinas encontradas en tres especies de Mimusops .................. 10

Figura 2: Estructura química de las saponinas ............................................... 12

Figura 3: Sintesis del 2,3-oxidoescualeno. Esquema de síntesis del precursor

de las agliconas triterpenicas y esteroidales, el 2,3-oxidoescualeno, IPP:

isopentanil pirofosfato, DMPP: dimetilalil pirofosfato, GPP: geranil pirofosfato,

FPP: farnesil pirofosfato ................................................................................... 15

Figura 4: Estructura química de los 3 grupos de saponinas triterpénicas. ...... 16

Figura 5: Núcleos esteroidales con actividad farmacológica .......................... 19

Figura 6: Esquema de extracción del material vegetal para el tamizaje

fitoquímico ........................................................................................................ 29

Figura 7: Ensayos a realizar en cada extracto................................................ 30

Figura 8: Estudio macro morfológico de semillas y endospermo: A) semilla

madura con cascara; B) endospermo semilla madura; C) semilla verde con

cascara; D) endospermo de semilla verde ....................................................... 33

Figura 9: Cromatogramas gaseosos analíticos de los extractos alcohólicos de

las semillas de Mimusops sp en dos estados de maduración .......................... 42

Figura 10: Algunas estructuras identificadas en el extracto alcohólico de las

semillas de los frutos verdes ............................................................................ 44


semillas de los frutos maduros ......................................................................... 47

VIII

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1: Extracción, secado y pesado de la muestra ..................................... 59

Anexo 2: Preparación de extractos para tamizaje Fitoquímico ........................ 60

Anexo 3: Resultados varios en el screening fitoquímico .................................. 61

Anexo 4: Pruebas Físico Químicas ................................................................. 62

Anexo 5: Reporte de plagio de URKUND ........................................................ 63

IX

1

INTRODUCCIÓN

El reino vegetal ha dotado a la humanidad de innumerables beneficios

gracias a las designadas “plantas medicinales”, las cuales poseen propiedades

farmacológicas procedentes de sus constituyentes divididos en dos grandes

grupos, metabolitos primarios y secundarios, estos últimos realizan varias

actividades biológicas, como antioxidantes, anti-inflamatoria, anticancerígena,

antitumoral, antidiabética y muchas más. En conjunto, las plantas sintetizan una

gran variedad de metabolitos secundarios, ya sea como parte del crecimiento y

desarrollo normal de sí misma, o en respuesta al ataque de patógenos o al

estrés. (Vélez-Terranova, 2014; Haralampidis y col., 2002; Singh y col., 2017)

Las saponinas son un grupo importante de metabolitos secundarios de las

plantas y se encuentran diseminadas por todo el reino vegetal. El nombre de

saponina se deriva de “sapo”, la palabra latina para jabón, ya que estas

moléculas tienen propiedades surfactantes y dan espumas estables como jabón

en solución acuosa. (Haralampidis y col., 2002)

Casos como asma, catarros, bronquitis, exceso de mucosidad densa,

enfisema pulmonar, entre otros, pueden ser tratadas mediante saponinas, las

cuales ejercen su acción irritativa a nivel de las mucosas gástricas, lo que permite

un aumento en la secreción de todas las glándulas, que a su vez, favorece a los

bronquios y por consiguiente lleva al tratamiento de las anomalías antes

mencionadas. (López, 2001)

2

Se resaltan además sus efectos diuréticos, estudios demuestran que

plantas con saponinas suelen ser utilizadas con frecuencia para depuraciones

sanguíneas, dolencias reumáticas e impurezas cutáneas, estimulando la

producción de orina y en resultado, la eliminación de material tóxico de manera

más fácil. (López, 2001)

Estos metabolitos secundarios intervienen también en la resorción de

otros principios activos de origen vegetal, siendo un factor decisivo en plantas

medicinales, ya que pueden esperarse grandes resultados a partir de pequeñas

cantidades de las mismas. Estudios señalan que la familia Sapotaceae posee

esta clase de compuestos, recientemente encontrados en el género Manilkara y

el género Mimusops. (Valdés y col, 2015)

3

CAPÍTULO I: PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN

I.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El área científica – investigativa ha logrado un gran desarrollo a partir de

los estudios farmacognósticos, donde se han diferenciado y clasificados

diferentes especies vegetales con componentes químicos de importantes

actividades farmacológicas.

El Ecuador es un país con una gran cantidad de recursos naturales debido

a su gran biodiversidad. De igual forma, muchos pobladores dependen de las

plantas medicinales como único recurso para tratar sus enfermedades. Sin

embargo, los estudios sobre la flora medicinal del Ecuador que sustenten su uso

tradicional son escasos, así como los estudios de separación y caracterización

de sus metabolitos secundarios.

Este trabajo pretende abordar el estudio de los componentes saponósidos

de clase triterpénica en Mimusops sp. que crece en el Ecuador.

Por ello se plantea el siguiente problema de investigación:

I.2 PROBLEMA

¿Presentarán las semillas de la especie Mimusops sp. en sus diferentes

estados de maduración compuestos saponósidos triterpénicos?

4

I.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA

Los compuestos saponósidos son un grupo de metabolitos importantes

en el reino vegetal que tiene un origen biosintético común: vía ácido mevalónico

y unidades isoprenoides. Su principal propiedad física es que en solución acuosa

son agentes tensioactivos, es decir, son capaces de formar espuma (poder

afrógeno), formar emulsiones y son difíciles de cristalizar.

Dentro de su distribución taxonómica, investigaciones resaltan que la

mayor parte de estos compuestos son de tipo “triterpénico”, derivado de una

unión de seis unidades de isopreno, capaz de ejercer diferentes beneficios para

los mamíferos, entre ellos citamos: su acción expectorante, antitusiva,

antiinflamatoria, antiulcerosa y antiespasmódica.

Además, gracias a su marcado poder como tensoactivo, las saponinas

triterpénicas son ampliamente usadas en la industria cosmética, haciéndolos una

pieza clave de la industrialización en la actualidad.

El género Mimusops ha sido investigado desde hace algunos años,

encontrándose cierta evidencia de que en sus frutos y semillas se concentran un

importante número de estos compuestos saponósidos, más específicamente

triterpenos.

De ello radica el interés científico de este trabajo, el cual consiste en

demostrar la presencia de estos importantes compuestos, poder identificarlos y

5

conocer si su presencia y concentración depende o no del estado de

maduración en que se encuentren las semillas de esta especie.

I.4 OBJETIVOS GENERALES

Realizar el estudio Farmacognóstico y Químico de la semilla de

Mimusops sp., en dos estados de maduración.

I.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

Evaluar los parámetros físicos-químicos de las semillas de Mimusops

sp. en dos estados de maduración.

Realizar el tamizaje fitoquímico comparativo de la semilla de Mimusops

sp. en dos estados de maduración.

Identificar las fracciones alcohólicas de las semillas estudiadas.

6

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO

II.1 ANTECEDENTES:

Las especies pertenecientes al género Mimusops se distribuyen

ampliamente en India y se informa que se utilizan en la medicina tradicional. En

un esfuerzo por comprender las diversas actividades biológicas que muestran

estas plantas, se iniciaron varias investigaciones fitoquímicas, que condujeron

principalmente al aislamiento de las saponinas triterpenoides. (Eskander y col.

2006)

Mimusops laurifolia (Forssk.) Friis, también conocido como Binectaria

laurifolia Forssk. y M. schimperi A. Rich. (Friis, 1981), es una de estas especies,

cultivada en Egipto, Uganda y Sudán. Es un árbol de hoja perenne, con

pequeños frutos que contienen de una a tres semillas duras y brillantes, y que

se utilizó durante mucho tiempo en el antiguo Egipto, ya que las semillas y

ramitas frondosas, utilizadas como ramos de flores para el funeral, se

encontraron en las tumbas faraónicas. (Ohara y col., 2001)

Más recientemente, esta planta recuperó popularidad ya que el extracto

fue patentado para efectos de acondicionamiento y humectación de la piel, como

parte de los preparados utilizados en cosméticos, formulaciones de baño y

detergentes (Ohara y col., 2001).

7

Se aislaron nueve saponinas de las semillas de Mimusops laurifolia. Sus

estructuras se establecieron utilizando espectroscopía de RMN de una y dos

dimensiones y espectrometría de masas. Tres de ellas resultaron ser nuevas

saponinas bidesmosídicas que poseen ácido 16a-hidroxiprotobásico como

aglicona y se identifican como: 3-O-(b-D-apiofuranosil-(1→3)-b-D-

glucuronopiranosil)-28-O-(a-L-rhamnopiranosil-(1→3)-b-D-xilopiranosil-(1→4)-

a-L-rhamnopiranosil-(1→2)-a-L-arabinopiranosil)- ácido 16a-hidroxiprotobásico,

3-O-(b-D-glucopiranosil-(1→3)-b-D-glucopiranosil)-28-O-(a-L-rhamnopiranosil-

(1→3)-b-D-xilopiranosil-(1→4)-a-L-rhamnopiranosil-(1→2)-a-L-

arabinopiranosil)- ácido 16a-hidroxiprotobásico y 3-O-(b-D-glucopiranosil-

(1→6)-b-D-glucopiranosil-(1→6)- b-D-glucopiranosil)-28-O-(a-L-

rhamnopiranosil-(1→3)-b-D-xilopiranosil-(1→4)-a-L-rhamnopiranosil-(1→2)-a-L-

arabinopiranosil)- ácido 16a-hidroxiprotobásico, junto con seis saponinas

conocidas: butirosida C, arganinas A, C y D, Mi-saponina A y saponina 5 de M.

hexandra más tarde nombrada tieghemelin A, del extracto de la semilla.

(Eskander y col. 2006).

Para su extracción y aislamiento el polvo de semilla desgrasado de M.

laurifolia se extrajo con MeOH, y luego el extracto de MeOH se precipitó con

acetona. Después de la diálisis frente al agua, la mezcla de saponina en bruto

se purificó usando una combinación de columna C-18 de fase inversa y

cromatografía en columna de gel de sílice. Los pasos finales de la purificación

fueron TLC preparativa o semiprep. HPLC sobre fase inversa C-18 y proporcionó

nueve saponinas mencionadas anteriormente. (Eskander y col. 2006)

8

Otra referencia sobre este género recae en Mimusops elengi Linn.

(Familia - Sapotaceae) es un árbol de hoja perenne. Es conocido como Bakulah

en Sanskrit y Bakul en Marathi. La planta es un árbol enorme, que crece de 12 a

15 metros de altura, con corteza de color gris oscuro. Las flores fragantes

florecen de enero a marzo. Comienza a producir frutos de enero a mayo. La fruta

es una baya, amarilla, ovoide de 2.5 cm de largo. Encierra una (raramente dos)

semillas. (Gopalkrishnan y Shimpi, 2010)

La planta goza de una considerable reputación en la medicina india como

astringente, tónico y en el tratamiento de la diarrea. A largo de los años se han

realizado diferentes investigaciones y en una de ellas se informó el aislamiento

y la elucidación de la estructura de cuatro nuevas saponinas triterpenoides,

mimusopsides A y 13, mirnusopin y mimusopsin, de las semillas de la planta

(Sahu y col, 1995)

Otra fracción de saponina de esta planta condujo al aislamiento y la

elucidación estructural de una nueva saponina menor, mimusin, junto con dos

conocidos, Mi-saponina A y 16g-hidroxi Mi- saponina A de las semillas

desgrasadas de la planta. (Sahu y col. 1997)

La técnica de extracción y aislamiento de saponinas en los ensayos fue

de la siguiente manera, las semillas en polvo secadas al aire de M.elengi (2 kg)

se extrajeron sucesivamente con éter de petróleo (60-80ºC), CHCl3 y MeOH en

condiciones de reflujo. El extracto de MeOH se repartió entre n-BuOH y H2O.

9

La capa orgánica se concentró a sequedad a presión reducida para dar un

residuo (30 g) que se cromatografió sobre gel de sílice (500 g). (Sahu y col. 1997)

De los granos de semilla desgrasada de tres especies de Mimusops se

aislaron diferentes tipos de saponinas, en el extracto de M. elengi contenía los

compuestos conocidos Mi-saponina A (I), arganina C (2), butirósido C (3) y una

nueva saponina 4, de M. hexandra, las saponinas 1 y 3 se aislaron con los dos

nuevos compuestos 5 y 6 y por último el extracto de M. manilkara contenía Mi-

saponina A (I) y saponina 6. (Lavaud y col, 1996)

Las saponinas 1, 3, 4 y 5 (véase figura 1) son bisdesmosidas del ácido

protobasárico mientras que las saponinas 2 y 6 contienen ácido 16a-

hidroxiprotobasico como aglicona. Para este estudio la extracción y el

aislamiento de las saponinas se realizó de siguiente manera; las semillas se

separaron y decorticaron para obtener los granos (2 kg cada uno). El polvo de

núcleo desgrasado de cada especie se extrajo repetidamente con EtOH. El

extracto concentrado se purificó por adición de un gran exceso de Me2CO.

(Lavaud y col, 1996)

10

Figura 1: Saponinas encontradas en tres especies de Mimusops

Obtenida de (Lavaud y col, 1996)

11

Los extractos brutos se disolvieron en H2O y luego se purificaron por

diálisis frente a agua pura (20 ml por 1 g de extracto). Después de 96 horas, el

contenido del tubo se congeló y se liofilizó. Para M. elengi y M. hexandra, 4 g de

cada extracto bruto dieron 1,4 g y 1,2 g de mezcla de saponina dializada

respectivamente; para M. manilkara, 10 g de extracto se sometieron a diálisis

para dar 935 mg de saponinas. El extracto de etanol se purificó usando una

combinación de cromatografía en columna de gel de sílice, TLC preparativa o

columna C18 en fase reversa. (Lavaud y col, 1996)

II.2 BASES TEÓRICAS Y CIENTÍFICAS

II.2.1 Saponinas. Generalidades

También llamados saponósidos, son estructuras constituidas por un

esqueleto esteroidal o triterpénico, a los cuales se los denomina como “aglicona”

o “sapogenina”, reemplazados por oligosacáridos mediante uniones

glucosídicas que les otorgan una naturaleza anfipática, a los cuales le deben sus

propiedades tensoactivas y hemolíticas (Figura 2). (Heng y col.,2006)

Son heterósidos muy extendidos en el reino vegetal. Caracterizados

principalmente por una espuma persistente, resultante del contacto de estos

metabolitos con el agua y que a su vez resulta ser una propiedad muy útil que

ha sido empleada a lo largo del mundo. Pueden también aumentar la

12

permeabilidad de las paredes celulares y de destruir los hematíes por

hemólisis, capacidades que aumentan su valor farmacológico. (Lopez, 2001)

Figura 2: Estructura química de las saponinas

Obtenidas de (Flores, 2013)

Sus efectos como antiinflamatorio, anti agregante plaquetario, hipo

colesterolémico, broncolítico, lieshmanicida, anti-protozoos, anti trichomonas e

insecticida, así como su actividad citotóxica frente a varias neoplasias, son solo

otros ejemplos del amplio margen de usos para las saponinas. (Mena, 2015)

II.2.2 Características químicas

De acuerdo con su composición química, podemos clasificar a las

saponinas en dos grandes familias, las de base gonano (o tipo esteroidal) y los

derivados del escualeno (o tipo triterpenoide). Ambas al someterse a hidrolisis

13

rinden de 2 a 6 residuos de monosacáridos, y una aglicona, que es una porción

carbonada policíclica a la que se denomina genéricamente como sapogenina.

(Hernandez, 2005)

Estos metabolitos poseen una solubilidad facilitada, que se relaciona a

varias características como (Cuéllar,1983; Rodríguez, 1986):

- Residuos de monosacáridos

- Alto peso molecular

- Otros grupos polares en la sapogenina

Tanto en saponinas triterpénicas como esteroidales, el enlace glucosídico

esta dictaminado por el (-OH) en el C-3 del anillo A de la sapogenina. Las de

clase triterpénicas se encuentran primordialmente en dicotiledóneas

(sapotaceae), mientras que las de clase esteroidal en monocotiledóneas

(dioscoráceas, liliáceas y amarilidáceas). (Hernandez, 1997)

De acuerdo con el número de sustituciones, se pueden encontrar

agliconas (Kuljanabhagavad y Wink, 2009; Güçlü-Üstündağ y Mazza, 2007):

- Monoglicosiladas o monodesmosídicas

- Diglicosiladas o bidesmosídicas

- Triglicosiladas o tridesmosídicas

Si solo poseen un oligosacárido unido al C-3 serán monodesmosídicas,

14

si tienen dos cadenas de carbohidratos (uno de ellos unido por enlace éter al C-

3, y otro unido por enlace éster al C-28 si de saponinas triterpénicas se tratase)

serán bidesmosídica, y si cuentan con tres cadenas de azúcares serán

tridesmosídica (Kuljanabhagavad y Wink, 2009; Güçlü-Üstündağ y Mazza,

2007).

Principalmente se encontrarán pentosas, hexosas o ácidos urónicos como

oligosacáridos unidos a la aglicona. Una característica muy útil y empleada en

metodologías para la elucidación y cuantificación de estos compuestos, es que

no toleran alteraciones bruscas de pH, la separación de las uniones O-

glucosídicas podrían generarse a partir de cantidades muy básicas o ácidas,

separando la sapogenina del oligosacárido (Diab y col.,2012).

Al referirse a su estabilidad térmica, los compuestos saponósidos logran

resistir temperaturas superiores a 150°C e inferiores a 400°C, superado este

último, la molécula es degradada a átomos de carbono por un proceso de

carbonificación, lo que posibilita el uso de procesos de extracción

convencionales favorecidos por calor. Además, gracias a la unión estructural de

un grupo apolar (esteroide o triterpeno) y un grupo polar (azúcar), las saponinas

otorgan una elevada actividad superficial. Agentes estabilizantes,

emulsificadores en productos cosméticos e higiene, y detergentes naturales han

sido creados a partir de este atributo (Yang y col., 2010).

15

II.2.3 Saponinas triterpénicas: Principales núcleos estructurales, Métodos

de extracción y caracterización. Reacciones de identificación y biosíntesis

Las saponinas triterpénicas presentan una estructura policíclica,

normalmente tetra o pentacíclica, la biosíntesis discurre por la vía isoprenoide,

en la que tres unidades isoprenoides (moléculas de 5C) se unen cabeza-cola

(1´-5) resultando un compuesto de 15C, el farnesildifosfato (FPP). La unión de

moléculas de FPP da lugar al escualeno (compuesto lineal de 30C), catalizada

por la enzima escualenosintasa; la molécula de escualeno es oxidada para dar

el 2,3-oxidoescualeno, a partir del cual se inicia la biosíntesis de las saponinas

triterpénicas (figura 3) (Jaramillo, 2014).

Figura 3: Sintesis del 2,3-oxidoescualeno. Esquema de síntesis del precursor

de las agliconas triterpenicas y esteroidales, el 2,3-oxidoescualeno, IPP:

isopentanil pirofosfato, DMPP: dimetilalil pirofosfato, GPP: geranil pirofosfato,

FPP: farnesil pirofosfato.

Obtenido de (Mastrogiovanni, 2012)

16

Las saponinas triterpenoides se encuentran principalmente en las

dicotiledóneas. Aproximadamente 60 familias de este taxón producen este tipo

de saponina, incluyendo Apiaceae, Araliaceae, Caryophyllaceae,

Chenopodiaceae, Fabaceae, Hippocastanceae, Primulaceae, Ranunculaceae,

Sapotaceae y Theaceae. (Evans, 2009)

Las saponinas triterpenoides se pueden clasificar en tres grupos

representados por: (figura 4) (Lopez, 2001).

Figura 4: Estructura química de los 3 grupos de saponinas triterpénicas.

Obtenidas de (Evans, 2009)

Los ácidos triterpenoides relacionados se forman a partir de estos

mediante el reemplazo de un grupo metilo por un grupo carboxilo en las

posiciones 4, 17 o 20. Los materiales vegetales a menudo contienen estas

saponinas en cantidades considerables. (Valencia, 2005)

La extracción de estos compuestos a partir de diferentes materiales

biológicos ha sido evidenciada bajo múltiples procesos, pero, dado su carácter

17

polar, muchas metodologías concuerdan en que los saponósidos triterpénicos

pueden ser extraídos en condiciones de caliente o frio, usando generalmente

solventes como agua o alcoholes de bajo peso molecular (metanol, etanol o

butanol). (Hernández y col., 2005).

Pruebas cuali-cuantitativas para saponinas

El ensayo de formación de espuma, así como la técnica de hemólisis de

eritrocitos constituyen métodos sencillos y rápidos para detectar la presencia de

saponinas en un extracto (Miranda y Cuellar, 2001). La técnica de hemólisis es

además, un método espectrofotométrico convencional que permite no sólo

cuantificar las saponinas sino también determinar su actividad hemolítica.

(Cheok y col., 2014; Habicht y col., 2011)

También se puede partir de un extracto alcohólico de la muestra vegetal

para realizar la prueba de Liebermann-Burchard, la cual consiste en tomar una

porción del extracto y añadir 4 mL de anhídrido acético, 4 mL de cloroformo y

enfriar de 0-2ºC. Luego adicionar 4 gotas de ácido sulfúrico. La aparición de una

coloración azulada que pasa a anaranjado para luego volverse verde, indica que

la reacción es positiva. (Valencia y col, 2005).

18

II.2.3. Saponinas esteroidales: Principales núcleos estructurales, Métodos

de extracción y caracterización. Reacciones de identificación

Distribuidas mayormente en plantas monocotiledóneas (Liliaceae,

Agavaceae, Dioscoreaceae y Amaryllidaceae) y en menor proporción en otras

especies (Dicotiledóneas: Solanaceae y Scrofulariaceae), las saponinas

esteroidales son estructuras complejas conformadas por, una parte hidrófila las

cuales están constituidas por unidades de monosacáridos, y un núcleo esteroidal

hidrófobo. (Dueñas, 2016)

La industria de hormonas esteroidales utiliza aquellas saponinas que

tienen en su estructura a la diosgenina y la hecogenina como aglicona para su

producción, a su vez, existen otros importantes núcleos esteroidales con

actividad farmacológica (figura 5). (Luengo, 2001).

Las saponinas esteroidales son de gran importancia farmacéutica

debido a su relación con compuestos tales como las hormonas sexuales, la

cortisona, esteroides diuréticos, vitamina D y los glucósidos cardíacos. Algunos

son usados como materiales de partida para la síntesis de estos compuestos

(Luengo, 2001).

19

Figura 5: Núcleos esteroidales con actividad farmacológica

Obtenido de (Evans, 2009)

II.2.4. Extracción y purificación de las saponinas esteroidales

En los métodos de extracción de las saponinas esteroidales, usualmente

se obtiene un extracto en polvo seco, que posteriormente es diluido en metanol,

etanol o en una solución con 50% de etanol o metanol a temperatura ambiente.

Existen técnicas convencionales de extracción como la maceración, Soxhlet,

extracción por reflujo, y técnicas no convencionales, amigables con el ambiente,

como la extracción por ultrasonido, microondas y extracción

20

acelerada de solventes (ACE). Usualmente el extracto es concentrado, y

fraccionado con acetato de etilo y n-butanol. Para su separación y purificación

se utilizan comúnmente la cromatografía en capa fina (TLC) con gel de sílice

usando como fase móvil cloroformo y metanol o cloroformo, metanol y agua.

(Meagher y col. 2001; Skhirtladze y col. 2006; Temraz y col. 2006; Theunis y col.

2007; Kim y col. 2008; Cheok y col. 2014).

Para la elucidación de la estructura de la saponina, por métodos

convencionales, se inicia con una hidrólisis ácida separando la parte glucídica

de la saponina. La estructura de los azúcares es identificada, por ejemplo, por

cromatografía de líquidos (HPLC), y la aglicona es identificada ya sea por IR o

por TLC (Oleszek y Bialy 2006).

Debido a que las saponinas esteroidales saturadas no presentan

absorción en la UV, es muy complicado la elucidación de su estructura por

métodos convencionales. Sin embargo, existen otros métodos más robustos en

donde se puede conocer de forma más puntual la estructura de la saponina como

es el caso de la resonancia magnética nuclear (RMN) o la espectrometría de

masas (MS) (Oleszek 2002).

Al utilizar la espectrometría de masas para el análisis de las saponinas,

se pueden usar diferentes fuentes de ionización suave, como lo son (Kind y

Fiehn 2010):

21

Electroespray (ESI), que es usada para moléculas

ionizables disueltas en un solvente polar volátil bombardeadas a través

de un capilar de acero mediante nitrógeno formando un aerosol de

pequeñas gotas con moléculas cargadas promovidas por un campo

eléctrico.

Bombardeo rápido de haz atómico (FAB), donde la muestra

es disuelta en una matriz líquida (por ejemplo, glicerol) no volátil que es

bombardeada por un rayo atómico de un gas inerte (Ar, Xe).

Desorción laser asistida por una matriz (MALDI), la muestra

es mezclada con una matriz de moléculas altamente ionizable (por

ejemplo, 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)). La matriz ayuda a ionizar la

muestra una vez que el haz del láser incide sobre la mezcla de matriz-

muestra, y exista a los iones por el impacto tanto de la muestra como los

de la matriz.

Una vez que la muestra es ionizada a través de ESI, FAB o MALDI, la

muestra ionizada es conducida a través de cuadrupolos o túneles de tipo de

vuelo para detectar la relación de masa carga (m/z) del compuesto, por lo que al

realizar el análisis por espectrometría de masas no solo se tiene conocimiento

sobre el peso de la molécula, sino que también da una idea de cómo están

enlazadas las moléculas de acuerdo a su ionización (Sahu y col. 2008; Zhu y col.

2010; Kang y col. 2012). Varias investigaciones en saponinas contenidas en

plantas se han identificado por HPLC-MS (Li y col. 2006).

22

Sin embargo, para su identificación molecular se requiere que sean

estructuras aisladas y que se conozca el peso esperado aproximado, así como

también se recomienda realizar otros análisis complementarios para confirmar

su estructura, como lo es el IR o RMN (Li y col. 2006).

Finalmente es importante mencionar, que los efectos de la temperatura

afectan fuertemente la extracción de las saponinas y por ende su eficiencia en

la purificación y en la caracterización debido a que las saponinas podrían ser

hidrolizadas a una polaridad más baja a temperaturas por arriba de los 60 °C.

Este cambio en la polaridad afectaría las actividades biológicas que pudieran

tener las saponinas, como por ejemplo su actividad anti-microbiana (Zhang y col.

2013).

II.3 GLOSARIO DE TÉRMINOS

Aglicona: aglucona o genina en química orgánica es el agrupamiento no

glucídico de un heterósido. Es el compuesto sin azúcares que queda tras

reemplazar por un átomo de hidrógeno el grupo glicosilo de un glucósido.

Sapogenina: Cualquier tipo de compuesto orgánico que se da en muchas

especies de plantas como derivados de los grupos esteroideos y triterpenoides

en forma de glucósidos, las saponinas.

Glucósido: Los glucósidos son moléculas compuestas por un glúcido

(generalmente monosacáridos) y un compuesto no glucídico. Los glucósidos

desempeñan numerosos papeles importantes en los organismos vivos.

23

Heterósido: Son compuestos formados por la asociación de un glúcido

y un cuerpo activo no azucarado llamado Genina o Aglucon.

24

CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS

Ill.1 Método de la investigación

El modelo empleado en el trabajo de titulación es el diseño

experimental, análisis-síntesis, y discusión de resultados

Ill.1.1 Variables

Variable independiente: Estado de madurez de los frutos

Variable dependiente: compuestos saponósidos

Variable interviniente: época del año

llI.1.2 Criterios de inclusión y exclusión

Criterio de inclusión: todos los frutos verdes y maduros

Criterio de exclusión: frutos en estado de putrefacción

llI.1.3 Operacionalización de las variables

Tabla I. Operacionalización de las variables

Variables Indicadores Tipo

Dependiente:

Compuestos

saponósidos:

esteroidales y/o

Análisis por

Cromatografía

gaseosa-

Espectometría de

Cuantitativo

25

triterpénicos masas

Independiente:

Estado de

madurez

Fruto verde y

maduro

Cualitativo

Interviniente:

Época del año

Estado fenológico Cualitativo

Elaborado por autores

llI.2 Recolección

La especie vegetal utilizada fue la semilla de Mimusops sp., para lo cual

se recolectó el fruto, en una zona de vegetación natural “Jardin Botánico” de la

Ciudad de Guayaquil, Ecuador, el 12 de Mayo del 2018. La especie vegetal se

encontraba en estado de floración-fructificación.

Los frutos recolectados fueron lavados con agua corriente y dejados en

refrigeración hasta el inicio de la experimentación. De éstos fueron extraídas las

semillas, las cuales se clasificaron en semillas de frutos verdes y maduros, según

las características de los frutos.

llI.3 Secado

Tanto las semillas del fruto verde como del fruto maduro pasaron por el

proceso de descortezación, y luego, dejadas a sequedad en estufa con una

temperatura de 50°C durante 24h.

26

llI.4 Evaluación macro morfológica

Se emplearon alrededor de 100 frutos entre verdes y maduros, de los

cuales se extrajo las semillas, clasificándolas, y anotando sus caracteres como

formas, dimensiones, entre otros.

llI.5 Propiedades físicoquímicas: Humedad, cenizas totales, cenizas

insolubles en HCl, Sustancias solubles.

Para la realización de los parámetros fisicoquímicos se siguieron los

procedimientos planteados por WHO 2011 y los ensayos se hicieron por

triplicado.

llI.5.1 Humedad residual

Se empleó el método gravimétrico, a partir de 2 g de muestra, se utilizó

una estufa a 105°C marca alemana Mettler Toledo y para pesar, se usó una

balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4

Expresión de los resultados.

Dónde: Hg: Perdida en peso por desecación; M2: masa de la cápsula

con la muestra de ensayos (g); M1: masa de la cápsula con la muestra de

27

ensayo desecada (g); M: masa de la cápsula vacía; 100: factor matemático

para calculo

llI.5.2 Cenizas totales

Para el análisis se empleó una mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E

por 2 horas, las pesadas se realizaron en una balanza analítica marca Kern

Modelo: ABS-220-4. Se partió de 2 g de muestra, se utilizó ácido nítrico hasta

obtener cenizas blancas.


Dónde: C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada; M: masa del

crisol vacío (g); M1: masa de crisol con la porción de ensayo (g); M2: masa del

crisol con la ceniza (g); 100: factor matemático para cálculo

llI.5.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico

A las cenizas totales obtenidas según la técnica, se le añadieron de 2-3

mL de ácido clorhídrico al 10 %. El crisol se tapó con un vidrio reloj y se calentó

sobre un baño de agua hirviente durante diez minutos. Se lavó el vidrio reloj con

5 mL de agua caliente y se unió al contenido del crisol. La solución se filtró a

través de un papel de filtro libre de cenizas; se lavó el residuo con agua caliente

y se lo transfirió con el papel incluido al crisol. Se incineró en la mufla modelo

MLW Eliktro Modelo: 245.3E a una temperatura de 700-750º C durante

28

dos horas. Posteriormente se colocó en una desecadora, hasta que alcanzó la

temperatura ambiente para poder pesar.


Dónde: B: porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base

Hidratada; M: masa del crisol vacío (g); M1: masa de crisol con muestra vegetal

deseca (g); M2: masa del crisol con la cenizas insolubles (g); 100: factor

matemático para cálculo

llI.5.4 Sustancias solubles

Este ensayo se determinó a partir de 5 g de la droga. Los disolventes

utilizados fueron agua, alcohol al 98 % y hexano.


Dónde: Ss: sustancias solubles (%); H: humedad de la muestra (%); 500

y 100: factores matemáticos para los cálculos; R: residuo de la muestra (g); M:

masa de la muestra (g)

29

llI.6 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico

El tamizaje fitoquímico se realizó a las semillas, según procedimiento

descrito por Miranda y Cuellar (2001).

Se utilizó un sistema de extracción con disolventes de polaridad creciente,

a partir del mismo material vegetal. La droga seca se extrajo sucesivamente con

éter di etílico, etanol y agua por 48 horas para obtener los extractos etéreo,

alcohólico y acuoso, los cuales se sometieron a diferentes ensayos (figura 6)

(figura 7).

Extracción

Figura 6: Esquema de extracción del material vegetal para el tamizaje

fitoquímico.

Fuente: Autor

30

Figura 7: Ensayos a realizar en cada extracto

Fuente: Autor

llI.7 Macerado y concentrado de la muestra vegetal

Maceración

Se empleó el método de maceración por 7 días, usando como disolvente

alcohol al 98% para la extracción de los componentes de las semillas del fruto

verde y maduro. Las muestras se maceraron en recipientes cerrados y cubiertos

con papel aluminio para evitar el contacto con la luz durante el tiempo

establecido, con agitación recurrente cada día.

Concentrado

Una vez finalizado el proceso de macerado, los extractos se filtraron

empleando gasas y papel filtro para la obtención de extractos sin residuos,

31

posteriormente se concentraron en un rotaevaporador de marca alemana

Heildoph Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión reducida, 100rpm

y a temperatura de 60 °C aproximadamente, hasta eliminación casi total del

disolvente.

III.8 Determinación de Rendimiento Porcentual

Se parte del pequeño volumen recuperado del balón luego del proceso de

concentrado, el mismo será transferido a un “beaker” o vaso de precipitación

Pirex de 100mL el cual fue pesado previamente.

Luego, se pesó el vaso junto a la muestra y se anota dicho valor, a

continuación se sometió a calor en estufa a una temperatura de 50°C hasta

sequedad de la muestra.

Cuando la muestra se secó a totalidad, se retiró de la estufa y dejó enfriar

aproximadamente 5 minutos en un desecador. Concluido ese tiempo se pesó

nuevamente el vaso con la muestra seca.

La fórmula empleada para los cálculos de rendimiento porcentual fue la

siguiente:

Donde:

𝑅% = 𝑃

𝑃

𝑒

𝑒

𝑠

𝑠

𝑜

𝑜

𝑚

𝑟𝑒

𝑢

𝑠

𝑒

𝑖𝑑

𝑠𝑡

𝑢

𝑟

𝑜

𝑎 𝑥 100

Peso residuo = peso final – vaso vacío

Peso muestra = (vaso + muestra) – vaso vacío

32

III.9 Reacción de silanización

Los extractos metanólicos fueron silanizados utilizando 50 µL de BSTF

[bis (trimetylsilyl)-trifluorocetamida; Merck] durante 45 min a 110º C, antes de ser

sometido a análisis por el sistema acoplado CG-EM (Huetos, 2004).

III.10 Análisis de los extractos por el sistema acoplado CG-EM

Los extractos silanizados se analizaron mediante el uso de un

cromatógrafo de gases Agilent Technologies acoplado a un espectrómetro de

masas (sistema 7890A GC y 5975C inerte XL MSD con detector de triple eje).

Las condiciones de trabajo fueron las siguientes: Columna capilar HP-5, 5%

Phenyl Methyl Siloxan 325° C: 30 m x 320 µm x 0.25 µm. La temperatura inicial

del horno se mantuvo a 70° C durante 2,0 minutos, luego se aumentó a 300° C

a 5° C/min, donde se mantuvo por 6 minutos. Tiempo de corrida 52 min. El

espectrómetro de masas fue operado a 70eV en modo full scan desde 40-1000

μ ma. Temperatura de la fuente 230° C, temperatura del cuadrupolo 150° C.

Temperatura del inyector: 280° C, volumen de inyección 2 µL con gas portador

helio a 1 mL/min. Los compuestos se identificaron mediante la comparación de

sus espectros de masas y la referencia de masa de Wiley 9th con NIST 2011 MS

Library tomando en cuenta aquellos con un porcentaje de similitud del 95% o

superior.

33

CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN

lV.1 Evaluación macro morfológica:

Para la evaluación macro morfológica de las semillas con corteza, así

como para el endospermo de las mismas, se toma en consideración las

dimensiones de largo y ancho.

Las semillas son previamente extraídas de frutos amarillentos con

contorno redondeado definido y característico, de estos se puede extraer entre

dos a tres semillas (figura 8).

Figura 8: Estudio macro morfológico de semillas y endospermo: A) semilla

madura con cascara; B) endospermo semilla madura; C) semilla verde con

cascara; D) endospermo de semilla verde

Fuente: Autor

D C

A B

34

Se efectúa un análisis estadístico comparativo de las dimensiones

establecidas y se reportan los resultados en la tabla II.

Tabla II. Cálculos estadísticos del largo y ancho de las semillas

PARÁMETROS CÁLCULOS ESTADÍSTICOS

VALOR

MEDIO

(cm)

DESVIACIÓN

ESTANDAR

CV

SEMILLA CON

CASCARA

LARGO SV 1,65 0,140 0,054

SM 1,79 0,097 0,01

ANCHO SV 1,17 0,213 0,08

SM 1,20 0,097 0,09

ENDOSPERMO LARGO EV 1,41 0,093 0,064

EM 1,43 0,095 0,069

ANCHO EV 1,01 0,078 0,074

EM 0,93 0,091 0,073


En el estado de maduración verde se obtienen dimensiones de 1.65cm de

largo y 1.17cm de ancho para la semilla con cascara, teniendo un incremento al

madurar, dando unas dimensiones de 1.79 X 1.20cm. Se aprecia además un

color café de la cascara de la semilla verde, pasando a un café más oscuro al

madurar.

Al contraponer las longitudes con otra especie de la misma familia como

lo es M. elengi cuyas dimensiones son de 1.5cm a 1.9cm de largo y de 1.2 a

1.4 de ancho, se denotara la diferencia para la muestra estudiada.

35

Para el endospermo de la semilla verde se obtuvieron valores de 1.41 X

1.01cm, mientras que en el endospermo proveniente de la semilla madura

disminuía ligeramente su grosor, siendo sus dimensiones 1.43 X 0.93cm.

Se observa entonces luego de la evaluación, las diferencias existentes

entre semillas verdes y maduras con respecto a los parámetros estudiados.

lV.2 Parámetros físicoquímicos:

A las semillas de la especie de estudio se le determinó los parámetros de

calidad: humedad, cenizas totales, cenizas insolubles en HCl, sustancias

solubles en agua y etanol 90%.

Los resultados de dichos parámetros se presentan en la tabla III.

Tabla III. Parámetros físicoquímicos de las semillas de Mimusops sp.

PARÁMETRO PORCENTAJE

SV SM

HUMEDAD RESIDUAL 10,39% 10,90%

CENIZAS TOTALES 3,20% 3,41%

CENIZAS INSOLUBLES EN HCl 0,90% 1,20%

SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA 54,24% 51,08%

SUSTANCIAS SOLUBLES EN ETANOL 90% 30,90% 25,23%


Debido a que el estudio está enfocado en una muestra vegetal, la

determinación de humedad residual es primordial, ya que complementa la

36

calidad del método utilizado en el secado evaluado. Las Normas y Farmacopeas

establecen, en dependencia del material vegetal, un contenido de humedad

residual entre 8 y 14 % (LouZhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y Cuellar, 2001).

El análisis arrojó un valor de 10.39% de humedad residual para las

semillas verdes, mientras que en las semillas maduras existe un incremento del

0.6%, ambas dentro del rango establecido.

La determinación de las sustancias solubles es un parámetro importante

para conocer la naturaleza de las sustancias presentes en las drogas y, para

determinar el mejor disolvente a emplear en la extracción de dichos compuestos

(Miranda y Cuellar, 2001). En la determinación de sustancias solubles los

resultados arrojaron porcentajes elevados en agua a comparación del alcohol lo

que nos sugiere la naturaleza mayormente polar de los componentes de la

muestra.

Para comprobar de manera relativa si la muestra ha sido adulterada con

material orgánico o cuerpos extraños, se realiza la determinación de cenizas

totales. Este ensayo indicativo de la calidad y pureza de la muestra trabajada

estable un contenido de máximo el 5% para cenizas totales según la

Farmacopea. (LouZhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y Cuellar, 2001).

Para semillas verdes el porcentaje de cenizas totales fue de 3.20%, en

contraste con las semillas maduras las cuales presentaron un porcentaje de

37

3.41%. Los valores encontrados cumplen con lo establecido en la norma. La

cantidad de cenizas insolubles en HCl es también un parámetro que ayuda a

evaluar la pureza de la droga. Al analizar los resultados se pudo observar que el

porcentaje de estas cenizas insolubles fue de 0.9% para semillas verdes y 1.2%

para semillas maduras, valores que se encuentran dentro del límite establecido

(alrededor del 2 % para plantas medicinales) (LouZhi-cen, 1980; WHO 1998).

IV.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico:

A los extractos obtenidos según la metodología utilizada, se les realizaron

los ensayos cualitativos correspondientes a cada extracto, los resultados se

muestran en la tabla IV.

Tabla IV. Tamizaje fitoquímico de las semillas de Mimusops sp.

EXTRACTO ETÉREO

ENSAYO METABOLITO RESULTADO

SV SM

SUDAN ACEITES Y GRASAS + +

BALJET LACTONAS Y COUMARINAS - -

LIEBERMANN-BUCHARD TRITERPENOS Y ESTEROIDES + +

DRAGENDORFF ALCALOIDES - -

EXTRACTO ALCOHÓLICO


SV SM

DRAGENDORFF ALCALOIDES - +

38

BALJET LACTONAS Y COUMARINAS - -

ESPUMA SAPONINAS + +++

FEHLING AZUCARES REDUCTORES + +

LIEBERMANN-BUCHARD TRITERPENOS Y ESTEROIDES + +

SHINODA FLAVONOIDES - -

CLORURO FERRICO TANINOS + -

NINHIDRINA AMINOACIDOS +++ ++++

ANTOCIANIDINA ANTOCIANIDINA + -

BORNTRAGER QUINONAS - -

RESINAS RESINAS - -

CATEQUINAS CATEQUINAS - -

EXTRACTO ACUOSO


SV SM

DRAGENDORFF ALCALOIDES - +

ESPUMA SAPONINAS +++ ++

CLORURO FERRICO TANINOS + -

FEHLING AZUCARES REDUCTORES + +

SHINODA FLAVONOIDES - -

MUCILLAGOS MUCILAGOS - -


Los metabolitos hallados en el análisis fueron representados con “-” al ser

negativos y con “+” al ser positivos, incrementando o disminuyendo las cruces

en dependencia de la intensidad del color o la cantidad de precipitado presente.

Observando los análisis correspondientes al extracto etéreo,

evidenciamos la presencia de aceites y grasas, lactonas y coumarinas, así

39

como núcleos triterpenico y esteroidales definidos por el color rojo y verde en el

ensayo de Lieberman tanto en semillas verdes como maduras. No existen

alcaloides en ninguna de las semillas.

Pasando al extracto alcohólico nos encontramos con varias diferencias

entre las semillas verdes y maduras, es el caso de los alcaloides, donde la

fracción madura dio positivo para Dragendorff, caso contrario de las semillas

verdes que mantienen el negativo como ocurrió en el extracto etéreo. El ensayo

de saponinas también dejo huella de la diferencia entre estados de maduración,

esta vez ambas semillas reflejan positivo para espumas, pero las semillas verdes

en menor proporción en contraste con las maduras. Sigue esta secuencia de

alter ego los ensayos de taninos y antocianidinas, en ambos casos, el resultado

es negativo para las semillas verdes, y positivo para semillas maduras.

Se denota la ausencia de flavonoides, resinas, quinonas y catequinas en

la muestra vegetal.

En el extracto acuoso, el ensayo de espumas para saponinas mostró

mayor intensidad en las semillas verdes que en su contraparte maduras, en

cambio, las semillas maduras mantienen la presencia de un ligero porcentaje de

alcaloides que no poseen las verdes. Positivo en ambos casos para taninos y

sustancias reductoras.

Aunque la especie estudiada carece de reportes acerca de su

composición química, para otras especies del género se han informado

40

diferentes compuestos. Los resultados obtenidos para los compuestos grasos

concuerdan con lo informado por Sathish y col., 2015 y Chivandi y col., 2016; los

triterpenos y esteroides han sido informados por Misra y col., 1974. Para la

especie también han sido informados diferentes taninos y compuestos fenólicos

por Chanda y Nagi, 2010; Fayek y col. 2012 y Baky y col , 2016.

IV.4 Extracción y análisis de los extractos alcohólicos de las semillas

IV.4.1 Extracción

A partir de los endospermos de las semillas, se obtuvo un concentrado en

bruto de las saponinas mediante el método de maceración por 7 días en etanol.

Los rendimientos de los mismos están expuestos en la tabla V.

Tabla V. Rendimiento porcentual de compuestos solubles en etanol de las

semillas de Mimusops sp.

RENDIMIENTO (%)

FRUTOS VERDES 5.22

FRUTOS MADUROS 32.90


Se aprecia de esta manera que las semillas del fruto maduro tienen una

supremacía considerable en el rendimiento porcentual de saponinas en

contraste con las semillas verdes.

41

IV.2 Análisis de los extractos alcohólicos

Los extractos alcohólicos de las semillas fueron primeramente silanizados

para ser analizados por el sistema acoplado CG-EM.

El cromatograma gaseoso analítico de los extractos alcohólicos de las

semillas de los frutos verdes y maduros, se exponen en la figura 9.

Ambos cromatogramas resultan complejos, pero se observan diferencias

marcadas entre ellos. Para el extracto de las semillas de los frutos verdes, el

equipo registró un total de 228 compuestos, mientras que para las semillas

maduras, el total de compuestos registrados fue de 195.

42

Figura 9: Cromatogramas gaseosos analíticos de los extractos alcohólicos de

las semillas de Mimusops sp en dos estados de maduración

Para el extracto alcohólico de las semillas verdes, se lograron identificar

un total de 13 componentes de los cuales el ácido octanodioico fue el mayoritario

(17,16 %); con similar abundancia se encontró la oleoamida (amida del ácido

oleico), con un 17,02 %. Otros compuestos con abundancia relativa superior al

10 % fueron: Ácido trans-9-Octadecenoico (16,16 %); Ácido docosanoico (12,58

%) y el Ácido-9,12-Octadecadienoico (11,73 %) (tabla VI).

43

Tabla VI. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas de

los frutos verdes de Mimusops sp.

SEMILLA FRUTO VERDE

Pic

o

Tr

min

Compuesto % Abundancia

1 15.64 Àcido pentanodioico 0,42

2 17.16 Isoeugenol 2,14

3 19.47 Ácido benzoico 0,28

4 20.45 Valenceno 9,58

5 22.58 Ácido octanodioico 17,16

6 22.83 γ-cadineno 6,15

7 26.68 Ácido sebácico 5,29

8 31.97 2-etil-hexano-1,2-diol 0,71

9 32.81 Ácido trans-9-Octadecenoico 16,16

10 34.19 Ácido-9,12-Octadecadienoico 11,73

11 34.79 Ácido nonadecanoico 0,71

12 35.21 Oleamida 17,02

13 39.48 Ácido docosanoico 12,58


Se destaca por tanto un predominio de compuestos de naturaleza ácida

en el extracto. Se debe señalar también la presencia de sesquiterpenoides y de

un compuesto fenólico como componentes del extracto. Algunos de los

compuestos identificados para el extracto se presentan en la figura 10.

44

Valenceno γ-cadineno

Oleamida Isoeugenol


semillas de los frutos verdes

45

Para el extracto alcohólico de las semillas de los frutos maduros se

lograron identificar un total de 19 compuestos ninguno de ellos coincidente con

los encontrados en las semillas de los frutos verdes, por lo que puede inferirse

que durante la maduración ocurren transformaciones químicas que pudieron

haber influido en estos resultados (tabla VII).

Tabla VII. Compuestos identificados en el extracto alcohólico de las semillas

de los frutos maduros de Mimusops sp.

SEMILLA FRUTO MADURO

Pico Tr

min

Compuesto % Abundancia.

1 14.22 Muruleno-B 0,11

2 14.82 2(3H)-Furanona, dihidro-3,4-bis 0,11

3 18.00 L-Treitol 1,33

4 18.17 meso-Eritiritol 3,67

5 18.99 Nootkatona 2,66

6 26.23 7.α.-(1,2-epoxi-1-metiletil)-2α.-hydroxy-4a.β.-

metil- 2,3,4,4a,5,6 Inositol

8,34

7 27.40 Cariofileno 14,57

8 31.72 9cis-11.trans-octadecadienoato de etilo 7,11

9 32.15 Palmitamida 8,0

10 32.35 Ácido esteárico, etil éster 9,34

11 35.31 Oleoamida 23,47

12 40.22 3-.α.-Mannobiosa 3,67

13 43.26 D-(+)-Galactopiranosa 6,45

14 45.31 4-O-β-Galactopiranosil-D-mannopiranosa 4,22

15 46.10 (+)-α-Tocoferol 5,11

16 47.88 rafinosa 1,77


46

El componente mayoritario para este extracto fue la oleoamida con un

23,47 % de abundancia y con porcentajes superiores al 10% se encontró al

cariofileno con 14,57 % . Se debe destacar en este extracto la ausencia de

ácidos carboxílicos, aunque se encontraron algunos derivados como amidas y

ésteres. Característica de este extracto resultó también la presencia de algunos

azúcares, que no estuvieron presentes en los extractos de las semillas de los

frutos verdes.

A pesar de que para las semillas de los frutos se ha reportado la presencia

de saponinas, en este trabajo, no pudieron ser identificadas, lo cual puede

atribuirse al disolvente empleado o al método de extracción utilizado.

Algunas de las estructuras identificadas en este extracto se grafican en la

figura 11.

47

Treitol Eritiritol

α-muuruleno Criofileno

Notkatona α-tocoferol


semillas de los frutos maduros

48

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

V.1 CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos permitieron arribar a las siguientes

conclusiones:

Se evaluaron los parámetros fisicoquímicos de las semillas de los frutos

verdes y maduros y los resultados se encuentran dentro de los rangos

establecidos en la farmacopea para drogas vegetales. No se encontraron

diferencias marcadas entre las semillas de los frutos verdes y maduros.

Como componentes mayoritarios en el análisis cualitativo de las semillas de

los frutos verdes y maduros se encontraron: compuestos grasos, triterpenos-

esteroides, azúcares reductores, taninos y saponinas, los cuales se

encuentran informados para el género.

Por el método de extracción, el disolvente utilizado y el método de detección

empleado, no se pudieron identificar las saponinas en los extractos obtenidos.

Se encontraron diferencias entre los extractos de las semillas de los frutos

verdes y maduros, no existiendo coincidencia en los componentes

identificados para cada uno de ellos.

49

V.2 RECOMENDACIONES

Evaluar otros disolventes, método de extracción y de identificación para

estudiar los extractos de las semillas de los frutos de Mimusops sp

50

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59

ANEXOS

Anexo 1: Extracción, secado y pesado de la muestra

Frutos verdes y maduros luego de su recolección en el jardín botánico.

Extracción de las semillas de Mimusops sp, y posterior la obtención del

endospermo

Secado de la muestra en estufa, toma de peso para sus posteriores análisis.

60

Anexo 2: Preparación de extractos para tamizaje Fitoquímico

Peso aproximado de 23g de ambas semillas para realizar los extractos etéreos,

alcohólicos y acuosos

Trasvasado del peso correspondiente a los envases ámbar para su extracción

en el solvente de turno

Obtención de los extractos etéreos, alcohólicos y acuosos para las pruebas de

tamizaje fitoquímico.

61

Anexo 3: Resultados varios en el screening fitoquímico

Ensayo de Lieberman – Buchard Ensayo de Fehling

Ensayo de Cloruro Férrico Ensayo de Espuma

SV

S

M

62

Anexo 4: Pruebas Físico Químicas

Se pesó un aproximado de 2g para ensayo de cenizas

Muestra llevada a mufla por un tiempo de 2 horas

Obtención de las cenizas de las semillas de Mimusops sp.

63

Anexo 5: Reporte de plagio de URKUND

Certificado de URKUND con un porcentaje de plagio del 2%

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