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, *., - Nombre Manuela Lopez Villavicencio

- Matrícula: 92232467 I*.>

f+, - Licenciatura Biología.

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- División: Ciencias Biológicas y de la Salud

- Título del trabajo o proyecto: ‘Establecimiento de un cultivo de células en suspensión a

partir de callo de cotiledones de &m@s iuevigufd (mezquite)”.

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- Nombre dd Asesor Dr. Francisco Cruz Sosa. Profesor Titular “c“ Jefe del Área de

4- Productos Naturales.

r - LuBar de Realización: Laboratorio de Pitoquímica y Biotmologla Vegetal

c (S- 153). Departmento de Bitecnologia. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad

c iztapaiapa.

c

- Fecha de Inicio: 17 de Octubre de 1995

- Fecha de Teminaci6n~ Septiembre de 1996.

- Clave: B.026.95

- Nombre del proyecto: ‘‘Obtemión de metabolitos secundarios a partir del cultivo de

I@:

c c er c Cl tejidos vegetales”.

-Firmaaturnno. w G kb - Firma asesor.

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ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO DE ~ L U L A S EN SUSPENSI~N

A PARTIR DE UN CALLO DE COTILEDONES DE

A.osopís W g a i a (mezquite).

INTRODUCCIbN Y ANTECEDENTES

El mezquite es un planta originaria de México distribuida en las regiones

áridas y semiáridas de Norte, Centro y Sudamérica. En México es abundante en los estados

del norte y centro del país, así como en las planicies costeras, en donde se establecen en

condiciones áridas y semiáridas (Maldonado, 1990).

Hoy en día en México, esta planta que pertenece a la familia de las leguminosas, es

considerada como maleza indeseable y es combatida en algunas regiones debido a que se le

atribuye una gran agresividad y competencia con especies forrajeras. Sin embargo el

mezquite es una planta que desde la antigbedad constituyó una fuente de obtención de

divetsos productos para los pobladores de las zonas áridas de México y Norte América.

Actuaimente se sigue utilizando este recurso pero a escala reducida, con la madera pueden

fabricarse postes, durmientes, herramientas, muebles, etc. (Meyer y Feker, 1989). La

corteza de la raíz se ha utilizado en cocción para curar heridas y como vomitivo y purgante.

El jugo de las hojas es también medicinal y se utiliza en padecimientos oculares. (Anónimo,

1976).

Del tronco del mezquite se puede obtener una resina exudada con características

similares a la goma arábiga empleada para obtener mucílago y para la ñrbricación de dulces.

Sus flores son frecuentadas por una gran cantidad de abejas y avispas productoras de miel de

alta calidad, las semillas constituyen un alimento importante para la fauna local como aves y

micromamíferos. El fiuto jugó un importante papel en la alimentación de algunos pueblos

indígenas donde era utilizado para la preparación de harinas y atoles (Anónimo, 1976).

El mezquite tiene una enorme importancia en el equilibrio de los ecosistemas

desérticos de nuestro país, las raíces profundas de esta planta ayudan a la conservación de

los niveles de agua del subsuelo además de que aporta componentes nitrogenados lo que

eleva la calidad de la tierra y de los cultivos altemativos.

A pesar de la evidente importancia del mezquite, este está siendo sometido a la tala

indiscriminada de los bosques para su utilización como carbón o para uso agrícola del suelo,

por lo que es necesario desarrollar un plan de reforestación basado en los métodos

tradicionales de cultivo y en el empleo de la biotecnología para la propagación de individuos

sobreproductores de goma o de rápido crecimiento.

El término de cultivo de tejidos vegetales se refiere al cultivo in vitro de

todas las partes de la planta (células aisladas, tejidos y Órganos) bajo condiciones asépticas y

controladas. El cultivo de tejidos vegetales se utiliza a metiudo como un sistema modelo

para el estudio de aspectos fisiológicos, bioquímicos, genéticos y estrucíurales de las

plantas. Estas técnicas ofrecen también un gran potencial como vías de propagación

vegetativa de cultivos económicamente importantes (Torres, 1989).

Estas técnicas, como puede verse, otorgan diversas ventajas de las cuales destacan en

primer t M n o , el gran número de plántuias que pueden ser obtenidas a partir de un solo

explante, además de que a partir de esta técnica pueden ser obtenidas plantas con un

incremento en su productividad o bien resistentes a enfermedades, plagas, herbicidas y en

general a diferentes condiciones de estds medioambiental. La micropropagación permite

también el trabajo con una especie durante todo el año e independientemente de las

condiciones medioambientales, si se cuenta con un número adecuado de plantas madre

(Evans y Flick, 1981) (Gautheret, 1985) (Robert y Loyola, 1985) (Ocho% 1985).

El éxito en los cultivos vegetales está determinado por la composición química de los

medios de cultivo utilizados, estos pueden estar constituidos por los siguientes

componentes:

- Sales inorgánicas (macro y micronutrientes)

- Vitaminas

- Reguladores del crecimiento vegetal

- Aminoácidos

- Carbohidratos

- ABua

- Agentes solidificantes

- Suplementos no definidos

(López, 1985)

Los cultivos vegetales pueden, a su vez, subdividirse en términos más específicos

para diferenciarlos:

* Cultivo de la planta: Se refiere a el cultivo de gemiinados o de plantas mayores

* Cultivo de embriones: Es el cultivo de embriones maduros o inmaduros aislados

* Cultivo de órganos: Cultivo de órganos de la planta de form aislada

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* Cultivo de callo: Cultivos de tejidos obtenidos por explantes de Órpanos

* Cultivo en suspensión y de células: Se refiere al cultivo de algunas células aisladas o

pequeñas agrupaciones celulares en un medio líquido

* Cultivo de protoplastos

* Cultivo de células haploides: Aquí entran células maduras o inmaduras como los granos de

polen.

(Torres, 1989)

El número de etapas en las que puede dividirse en general la micropropagación son

las siguientes:

- Fase O: Selección de la planta madre

- Fase 1: Establecimiento del cultivo aséptico

- Fase 2: Multiplicación de brotes

- Fase 3: Enrakuniento (in vitro, zn vivo)

- Fase 4: Transferencia a suelo y aclimatación (invernadero o vivero)

(Debergh y Maene, 1981)

Estas son las fases que idealmente debería presentar un trabajo de micropropagación,

sin embargo cada una de estas etapas presenta diversos problemas tales como la

contaminación, oxidación vitrüicación entre otros, que l i t a n su aplicación a escala

comercial, de manera que para solucionarse deben de buscarse formas de trabajo que

aborden los mismos de forma integral.

JUSTIFICACI~N:

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El empleo de diferentes técnicas de cultivo de tejidos vegetales para la propagación

masiva de diferentes especies con interés comercial, biotecnológico y ecológico, toma cada

día más fuerza debido a las ventajas que ofrecen estas metodologías con respecto a las

convencionales. Algunas de las razones que nos llevan a querer implementar estas técnicas

en un árbol como Z? Wgata son las siguientes:

a) Todas las partes constituyentes de los árboles de mequite (madera, flores, semillas,

raíces, etc.) tienen un uso generalizado, esto io convierte en un recurso natural muy

importante (medicinal, combustible, artesanal, alimenticio, etc.).

b) De los árboles de mezquite se obtiene una resina o exudado muy semejante a la goma

arábiga, de ahí que sea factible su utilización en la industna alimentaria como un sustituto de

menor costo.

c) El mequite juega también, un importante papel ecológico en los desiertos mexicanos; sus

raíces profundas contribuyen en la conservación del suelo y del agua, además que por ser

una leguminosa contribuye a nitrogenar el suelo. El cultivo de tejidos vegetales podría

considerarse como una alternativa de reforestación que contrarrestre la tala indiSCnminada

de este recurso.

d) El cultivo de tejidos vegetales hace posible disponer de sistemas experimentales

reproducibles y cuantiíidles, io que simplifica la experimentación en todas las áreas de la

fisiología vegetal.

ME TO DO LOG^:

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ANA AIA (1.OmgíL) ( i.Omg/L)

BAP A1,2,3,4,5 BI .2~4 .5

(1.0 mg&)

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2,4-D AIB ( 1.OmgíL) ( 1.0 mgn)

Ci,a,3,4,5 Di,a,3,4,s

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- Etapa 1. Obtención de las semillas en el campo (San Luis Potosí) y de material colectado.

- Etapa 2. Limpieza de las semillas (extracción de la vaina, desinfección y desinfestación).

- Etapa 3. Siembra in vitro de las semillas en medio sólido (agar 8 &) sin reguladores del

crecimiento vegetal.

- Etapa 4. Inducción de callo en medio B5 suplementado con 3% de sacarosa, 1.6 g& de

giutamina, 100 mg& de ácido asdrbico. 50 m a de ácido cítrico y de acuerdo con las

siguientes combinaciones de auxinas: ácido naftalenacético (ANA), ácido indolacético

(AIA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indolbutírico (AB) y citocinina:

bencilaminopurina (BAF'), utilizando como explantes cotiledón de Prompis lueviguíu (tabla

1).

Tabla 1. Combinaciones de auxinas y BAP para la obtención de callo:

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ACTIVIDADES REALIZADAS

Se realizó todo el proceso de cultivo de tejidos a partir de cotiledones de mezquite,

lo que implicó desde la recolección de las semillas en el campo, su limpieza y desinfección

hasta la resiembra del callo producido a partir de los cotiledones. Durante la época en que

no habían semillas disponibles de esta planta, se trabajó con tres plantas altemativas: plátano,

violetas africanas y orquídeas. E n estos tres casos no fue necesario cultivar la planta a partir

de semillas ya que se tenían plántulas bien desarrolladas in vitro, de manera que sólo se

replantaron porciones de las plantas madres, para lo cual se prepararon medios diferentes de

acuerdo al tipo de cultivo del que se tratara, para las violetas añicanas y el plátano, el medio

fue muy similar al uti l ido para el cultivo de cotiledones de mezquite (medio B5, ver

metodología) aunque en este caso no se agregó giutamina ni antioxidantes (ácido ascórbico

y ácido cítrico). En el caso de las orquídeas se utilizó un medio especial para este tipo de

plantas, medio Knudson, el cual lleva además extracto seco de plátano. Las plhtulas de

plátano, una vez que hubieron alcanzado un t d o importante, transferidas a condiciones

de invernadero (suelo).

-Lugar de Realización:

Todo este proyecto se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal y

Fitoquímica (S-153). Departamento de Biotecnología UAM Iztapalapa.

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Los objetivos de este trabajo contemplaban on@nalmente sólo la utilización

de una planta, el mezquite; sin embargo y como resultado de la falta de material, se tuvo que

recurrir a otras plantas, lo que permitió conocer algunas de las diferencias en el proceso de

cultivo de tejidos vegetales, se realizaron diferentes medios de cultivo y se siguieron

diferentes procedimientos de siembra, ya que los objetivos eran diferentes; en el caso del

mezquite, se buscaba obtener callo o proliferación celular, mientras que para los tres tipos de

plantas restantes, la intención era propagarlas vegetativamente a partir de una planta madre y

llevarlas de un medio de cultivo a suelo.

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En el caso del mezquite los resultados fueron los siguientes:

- No se encontraron diferencias significativas en las combinaciones de auxinas y BAP (ver

tabla I), es decir la cantidad de callo obtenida para los 5 tipos de medio (4 combinaciones y

un testigo) fue muy similar.

- En la última repetición realizada que consistia en 10 frascos para cada combinación y para

e1 testigo (50 frascos totales), el porcentaje de contaminación fue muy bajo, sin embargo no

fue posible obtener callo de ninguno de los frascos ya que en todos se presentó una

oxidación del tejido.

- E1 porcentaje de germinación aumentó considerablemente en las Últimas etapa, pasó de un

50% aprox. a casi un W?, esto como resultado de hacer pequeños cortes sobre la cubierta

de la s e d a para facilitar la entrada de agua a la misma.

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- El grado de contaminación fue mucho mayor cuando la siembra se realizó en fiasco, a

diferencia de la siembra en tubo de ensayo

- La cantidad de callo producida resultó considerablemente mayor cuando la siembra de

cotiledones se daba en tubo en lugar de en frasco.

Los resultados del trabajo de las tres plantas restantes fueron los siguientes:

- El porcentaje de contaminación fue mínimo, aproximadamente un loo/o, el cual en la

mayoría de los casos se registró como una contaminación aislada que no interfería con el

crecimiento normai de la planta.

- El 100?/0 de las plantas creció de manera normal, formó raíces y no presentó problemas de

oxidación.

- En el caso concreto de la planta de plátano que se replantó directamente en suelo, en un

principio creció con fuerza y sanamente, sin embargo después de aproximadamente un mes

en estas condiciones sufnó una plaga que destruyó al 90% de las plhtuias.

Las conclusiones de este trabajo nos muestran que aunque aparentemente no existe

diferencia en ninguno de los reguladores del crecimiento vegetal en relación con el

favorecimiento de la formación de callo, no podemos decir que esto sea absoluto. Las

concentraciones utilizadas fueron m y bajas (1.0 mg/L), y aunque las células vegetales

responden a concentraciones de órdenes muy pequeños, probablemente para encontrar

resultados que sean signiíicativos deban utilizase concentraciones mayores. El crecimiento

de las células, aunque también obedece en gran medida de la presencia de reguladores, no

depende exclusivamente de esto, muchos otros factores como son la humedad, luz o

temperatura inciden sobre la división celular, por lo que estos factores deben estar muy bien

controlados para que los resultados sean válidos. Aunque las cantidades de antioxidantes

que se agregaron ai medio de cultivo estuvieron de acuerdo a lo dictado por la literatura, es

evidente que hay contradicciones, ese fue uno de los mayores problemas de los cultivos de

mezquite, un buen número de muestras se oxidaban, por lo que si a esto se le suma la

contaminación natural que existe cuando se trabaja en este campo, quedan muy pocas

muestras en buen estado para hacer comparaciones; tanto la contaminación como la

oxidación deben de reducirse a i máximo, como la contaminación muchas veces está fuera de

nuestras manos, es imprescindible que se reconsideren nuevamente las cantidades, tipo y uso

de los antioxidantes.

En el caso concreto de las plántulas de plátano, todo el desarrollo que precedió a la

siembra en suelo fue rápido y n o d , el problema se tuvo cuando se hizo el transplante a

tierra (aunque también en un principio esto no presentó problemas), en este cam,

probablemente las plántulas aunque ya estaban bastante crecidas, no se encontraban lo

suficientemente fuertes como para desarrollarse correctamente en condiciones ambientales,

por lo que fueron poco capaces de defenderse ante agentes daiünos.

RECOMENDACIONES:

- Como ya se dijo, resulta mejor la siembra en tubo de ensayo que en frasco, no solo porque

la contaminación es menor y el desarrollo de callo más evidente, si no porque además las

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cantidades de material utilizadas para los tubos son mucho menores en comparación a los

fiascos, además de que el manejo de los mismos resulta mas fácil.

- Las semillas germinaron mucho mejor cuando se realizó un pequeño corte que tan sólo

levante la testa y permita la entrada de agua y la hidratación; este corte debe hacerse en el

extremo opuesto a la región donde se encuentra el embrión para evitar &arlo.

- La germinación puede hacerse en medio de cultivo, sin embargo se vieron mejores

resultados si este proceso se llevaba a cabo directamente en agua o sobre algún sustrato

húmedo como algodh o gasa, lo además reduce los costos del proceso.

- Otro de los grandes problemas que se tuvieron, fue el referente a las semillas. Como estas

no están disponibles durante todo el año, era preciso recolectar grandes cantidades y

almacenarlas para ir tomando las necesarias, sin embargo durante el tiempo en que el

material se encontraba almacenado, sufría la mayor infestación por insectos que se

reproducían rápidamente y acabando en poco tiempo con la mayor parte del material, para

evitar esto es necesario que una vez que se han recolectado las semillas y antes de que se

almacenen sean tratadas con productos insecticidas para eliminar tanto a los insectos

existentes como a las larvas y huevos de los mismos.

- En cuanto a los tratamientos resulta mucho mejor hacedos por partes, es decir se deben

preparar como mucho dos tipos de medios con diferentes reguladores, el tratar de hacer

pocas cantidades de los 5 tipos de tratamientos (A, B, C, D y testigo) (ver tabla 1), complica

enormemente las cosas porque se trabaja con mucho material diferente, lo que puede llevar a

grandes coniüsiones. El único problema en trabajar cada medio por separado es el referente

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a la edad de los cotiledones, ya que esto debe ser considerado y en cada uno de los

tratamientos sembrar cotiledones de la misma edad para no obtener resultados erróneos.

BLBLIWRAFÍA:

Anónimo, 1976. El mezquite, iMREB. Comunicado No. 6 sobre recusas Bióticos

Potenciales del País. Instituto de Investigaciones sobre Recursos Bióticos A. C., Xalapa,

Veracruz, México.

Debergh C. P. & Maene, L. J. 1981. A scheme of comercialpropagafion of ornamental

plants by tissue culture. Scientia Holticuhurae. 14:335-341.

Evans, D.A. & Flick, C.E. 1981, Growth and behavior of cell cultures: emblyogenesis and

organogenesis. In: Plant Tissue culture. Methods and Applicatios in Agriculture. Edited

by Thorpe, A. T. Academic Press, USA, pp: 45-1 13.

Gautheret, R. J. 1985. Histoly of plant tissue and cell culture: A personal account. In Cell

culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 2. Cell Growth, Nutrition,

Cytodflerenciation & Cryopreservation. Academic Press. USA, pp: 1-59.

López, P. C. 1985. Medios de culfivo. En: Fundamentos teórico-prácticos del cultivo de

tejidos vegetales. Editores: Cadmo y Villaiobos, FAO, México, pp:15-18.

Maldonado, L. J. 1990. Prosopis en México. In the current state of knowledge on h q i s

jrtl#hu. INZFAP. Dicarpo. 12:17.

Meyer J.M & Felker, P. 1986. Pruning mesquite (Prosopis grandulosa Vm. grandulosa)

suplings for lumber productions and ornamental use. Fore Ecology and Manegmcnt. 36.

301-306.

T. .J

r

m I

Moya, E.G. 1992, Establecimiento de callos y células en suspensión de Trigonella foenum-

graecum evaluando la producción de trigonelina y sapogeninas . Tesis de Licenciatura en

Biología. UNAM. Iztacala, México.

Ochoa, A. N. 1985. Establecimientos de cultivos in vitro. En: Fundamentos teórica

prácticos del cultivo de tejidos vegetak. Editores: Cadmo y Villalobos, FAO, México,

pp: 65-71.

Robert, M. L. y Loyola, V. M. 1985. El cultivo de tejidos vegetales en México. CICY- CONACYT, México.

Torres, K. C. 1989. Tissue Culture Techniques for Hortieuliurd Crops. AVI Books, N Y .

usq pp: 3-5.

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