Juan Gil Hernández2º LACCABiotecnología

Práctica nº1: Determinación de proteínas por el método Kjeldahl

1) Objetivos: determinar cuantitativamente la cantidad de proteínas en una muestra.

2) Fundamento teórico general:

El método de Kjeldahl en química analítica es un método para la determinación cuantitativa de nitrógeno en sustancias químicas convertido cerca Johan Kjeldahl.

El método consiste en el calentar de una sustancia con ácido sulfúrico cuál descompone el nitrógeno orgánico presente sulfato del amonio. En este paso sulfato del potasio se agrega para aumentar punto que hierve del medio (a partir °C el 337 a 373). Descomposición química de la muestra es completo cuando el medio ha llegado a ser claro y descolorido (inicialmente mismo obscuridad).

La solución entonces está destilado con hidróxido del sodio (agregado en cantidades pequeñas) a que convierte la sal del amonio amoníaco. La cantidad de presente del amoníaco (por lo tanto la cantidad del nitrógeno presente en la muestra) se determina cerca titulación trasera. El final del condensador se sumerge en una solución del ácido bórico. El amoníaco reacciona con el ácido y el resto del ácido entonces se titula con a carbonato de sodio solución con a naranja metílica indicador del pH.

Proteína + H2TAN4 → CO2 + (NH4)2TAN4 + TAN2

(NH4)2TAN4 + Na del → 2NaOH2TAN4 + NH4OH2NH4OH + H2TAN4 → (NH4)2TAN4 + 2H2O

Hoy en día, el método de Kjeldahl se automatiza y hace uso en gran parte específico catalizadores (óxido del mercurio o sulfato de cobre) para acelerar la descomposición.

Usos

La universalidad, la precisión y la reproductibilidad del método de Kjeldahl le han hecho el método internacional-reconocido para estimar el contenido proteínico en alimentos y es el método estándar contra el cual se juzgan el resto de los métodos. , Sin embargo, no da una medida del contenido proteínico verdadero, como él mide el nitrógeno sin proteínas además del nitrógeno en proteínas. También, diversos factores de la corrección son necesarios para que diversas proteínas expliquen diversas secuencias del aminoácido. Las desventajas adicionales, tales como la necesidad de utilizar el ácido sulfúrico concentrado en la temperatura alta y el tiempo de prueba relativamente largo (una hora o más), comparan desfavorable con Método de Dumas para medir el contenido proteínico crudo.

Definición de carne:

Según el Código Alimentario Español (CAE), se denomina carne a “las partes blandas comestibles del ganado bovino, ovino, porcino y aves”.

Características de las principales carnes:

Las carnes aportan entre un 16-22% proteínas de alto valor biológico, es decir, contienen todos los aminoácidos esenciales.

Son una buena fuente de vitaminas, principalmente del grupo B (en especial B12).

Excepto las vísceras, son pobres en vitamina A, C, ácido fólico e hidratos de carbono.

Son ricas en hierro del tipo hemo, que presenta mejor absorción que el hierro no hemo presente en alimentos de origen vegetal.

Aportan minerales, zinc, potasio, fósforo y, en menor medida, calcio y magnesio.

El contenido de grasa y colesterol depende del tipo de especie, la pieza, así como la edad y la alimentación del animal.

Tabla de composición:

Composición por 100 g de algunas carnes

   P  G Kcal   Col  AGS

 Ternera  19 11 181 70 3,4

 Cerdo  16 25 290 72  11,5 

 Pollo deshuesado  20,5 4,3  121   87  1,4

 Cordero  17  19  248  78  9,4

 Conejo  22  8  162  65  2,6

 Hígado de ternera  19 3,8  140 300 1,2

Kcal: kilocalorías; P: proteínas (%); G: grasas; Col: colesterol; AGS: ácidos grasos saturados.

3) Fundamento teórico aplicado:

En esta práctica trataremos de calcular el tanto por ciento de proteínas presentes en una muestra de salchichas. Para realizar este análisis, valoraremos el amoniaco presente después de someter a una digestión por medio de ácido sulfúrico a la muestra.

4) Lista de material:

-Material de disoluciones

-Montaje Kjeldahl

-Destilador Kjeldahl automático

5) Reactivos:

-Ac. Bórico 4%

-HCl 0,1M

-Ácido sulfúrico

-Etanol 96%

-Azul de metileno

-Indicador mixto

-Catalizador Kjeldahl

-NaOH 40%

6) Muestra:

Salchicha campofrío

Caducidad: 30-1-2011

Lote:Lt0312

Composición por 100g:

Energía 1028Kj

Proteinas 11gH. de carbono

de los cuales azúcares10g1g

Grasasde las cuales saturadas

18g6g

Fibra 0gSodio 0.8g

7) Procedimiento:

Pesar de 2 a 3 gramos de muestra y llevarlo a un matraz Kjeldahl e introducir plato

poroso, 15 g de sulfato potásico, 0,5g de sulfato de cobre y una punta de espátula de

selenio metal. Agregar 25 ml de ácido sulfúrico concentrado y calentar.

Se calienta suavemente al principio y cuando decolore aumentar la calefacción. Cuando

el líquido esté transparente color azul verdoso aumentar la calefacción 1h 30min. Dejar

enfriar y añadir 100ml de agua.

Poner el montaje o poner el tubo de digestión en el destilador automático poner en un

erlenmeyer 25ml de ácido bórico y destilar. La disolución se lleva a un matraz de

500ml.

Valorar la disolución con HCl 0,1N y para los cálculos aplicar esta fórmula.

f: N del HCl

Vm HCl: es el volumen medio gastado de HCl

m Muestra: masa muestra

Fd: factor de dilución

8) Datos experimentales:

Muestra 1:

Enrasamos a un matraz de 250ml la muestra

Valoración con HCl:

Ensayo V muestra (ml) V HCl (ml)

1 50 7.00

2 50 6.90

3 50 6.95

4 50 6.95

Vm 6.95

Muestra 2:

Enrasamos a un matraz de 500ml la muestra

Valoración con HCl:

Ensayo V muestra (ml) V HCl (ml)

1 50 6.45

2 50 6.55

3 50 6.50

4 50 6.55

5 50 6.50

Vm 6.51

9) Resultados:

Muestra 1:

Muestra 2:

10) Observaciones:

El segundo resultado ha salido mal, da 3 veces la concentración que debería. Este fallo

creemos que ha viene dado por el HCl que no estaba bien valorado.

El HCl a mi juicio era de dudosa concentración, pues se nos presento como 0,1N sin

ningún decimal más, a parte el HCl estaba hecho a paritr de una disolución que llevaba

hecha mucho tiempo entre otras cosas.

En cambio el primer ensayo nos salió muy bien, lo que es raro dado que el HCl era el

mismo, asi que es muy posible que se volatilizase el HCl o que alguien echase más

disolvente en el mismo. A todos los grupos les ha pasado lo mismo.

Bueno, de todas formas aunque este no es el caso, creo que el mejor método es el

antiguo. El método antiguo no tiene escapes ni filtraciones, que es lo contrario que pasa

con el método nuevo, que se filtra por todo los lados. Las filtraciones fueron el motivo

por el que el grupo de Riccardo tuvo que repetir el ensayo.

11) Bibliografía:

-www.worldlingo.com/ma/.../es/Kjeldahl_method

Práctica nº2: Extracción del ADN

1) Objetivo: observar la estructura fibrilar macroscópica del ADN

2) Fundamento teórico general:

El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN (y también DNA,

del inglés deoxyribonucleic acid), es un tipo de ácido nucleico, una macromolécula que

forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo

y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es

responsable de su transmisión hereditaria.

Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un

polinucleótido. Un polímero es un compuesto formado por muchas unidades simples

conectadas entre sí, como si fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada

vagón es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez, está formado por un azúcar (la

desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina→A, timina→T,

citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato que actúa como enganche de cada vagón

con el siguiente. Lo que distingue a un vagón (nucleótido) de otro es, entonces, la base

nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la secuencia

de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el

ordenamiento de los cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica

la información genética: por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser

ATGCTAGATCGC... En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble

cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por unas

conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

Para que la información que contiene el ADN pueda ser utilizada por la maquinaria

celular, debe copiarse en primer lugar en unos trenes de nucleótidos, más cortos y con

unas unidades diferentes, llamados ARN. Las moléculas de ARN se copian exactamente

del ADN mediante un proceso denominado transcripción. Una vez procesadas en el

núcleo celular, las moléculas de ARN pueden salir al citoplasma para su utilización

posterior. La información contenida en el ARN se interpreta usando el código genético,

que especifica la secuencia de los aminoácidos de las proteínas, según una

correspondencia de un triplete de nucleótidos (codón) para cada aminoácido. Esto es, la

información genética (esencialmente: qué proteínas se van a producir en cada momento

del ciclo de vida de una célula) se halla codificada en las secuencias de nucleótidos del

ADN y debe traducirse para poder funcionar. Tal traducción se realiza usando el código

genético a modo de diccionario. El diccionario "secuencia de nucleótido-secuencia de

aminoácidos" permite el ensamblado de largas cadenas de aminoácidos (las proteínas)

en el citoplasma de la célula. Por ejemplo, en el caso de la secuencia de ADN indicada

antes (ATGCTAGATCGC...), la ARN polimerasa utilizaría como molde la cadena

complementaria de dicha secuencia de ADN (que sería TAC-GAT-CTA-GCG-...) para

transcribir una molécula de ARNm que se leería AUG-CUA-GAU-CGC-... ; el ARNm

resultante, utilizando el código genético, se traduciría como la secuencia de

aminoácidos metionina-leucina-ácido aspártico-arginina-...

Las secuencias de ADN que constituyen la unidad fundamental, física y funcional de la

herencia se denominan genes. Cada gen contiene una parte que se transcribe a ARN y

otra que se encarga de definir cuándo y dónde deben expresarse. La información

contenida en los genes (genética) se emplea para generar ARN y proteínas, que son los

componentes básicos de las células, los "ladrillos" que se utilizan para la construcción

de los orgánulos u organelos celulares, entre otras funciones.

Dentro de las células, el ADN está organizado en estructuras llamadas cromosomas que,

durante el ciclo celular, se duplican antes de que la célula se divida. Los organismos

eucariotas (por ejemplo, animales, plantas, y hongos) almacenan la mayor parte de su

ADN dentro del núcleo celular y una mínima parte en elementos celulares llamados

mitocondrias, y en los plastos y los centros organizadores de microtúbulos o centríolos,

en caso de tenerlos; los organismos procariotas (bacterias y arqueas) lo almacenan en el

citoplasma de la célula, y, por último, los virus ADN lo hacen en el interior de la

cápsida de naturaleza proteica. Existen multitud de proteínas, como por ejemplo las

histonas y los factores de transcripción, que se unen al ADN dotándolo de una

estructura tridimensional determinada y regulando su expresión. Los factores de

transcripción reconocen secuencias reguladoras del ADN y especifican la pauta de

transcripción de los genes. El material genético completo de una dotación cromosómica

se denomina genoma y, con pequeñas variaciones, es característico de cada especie.

3) Fundamento teórico aplicado:

Vamos a tratar de ver el ADN de forma macroscópica, para ello cogeremos hígado y

destruiremos sus células de todas las maneras posibles ya sea por métodos físicos o

químicos.

Una vez ya estén todos los pasos hechos trataremos de precipitar el ADN con etanol frío

y observaremos los resultados.

4) Lista de material:

-Material habitual de laboratorio

-Mortero

5) lista de reactivos:

-Agua

-Etanol frío

-NaCl 10%

-Detergente líquido

-Arena

-Tela

-Higado

6) Procedimiento:

Triturar el hígado en el mortero añadiendo arena. Al triturado se le añaden 10ml de agua

y se remueve hasta conseguir una papilla. Filtrar sobre tela un par de veces, medir el

volumen total y añadir una cantidad igual de NaCl 10%.

Añadir unas gotas de lavavajillas y una vez hecho todo añadir 5 ml de etanol frío poco a

poco dejándolo resbalar por las paredes lentamente.

7) Resultados y observaciones:

Obtuvimos un buen resultado ya que nos precipitó bastante ADN, pero al intentar

enrollarlo en la varilla de vidrio no pudimos. Al no poder enrollarlo en la varilla de

vidrio traté de hacerlo con una bastoncillo, dado que la madera al ser más porosa lo

retendría mejor y asi fue.

Se podía observar perfectamente la estructura fibrilar del ADN a la vez que su

fragilidad, tenías que enrollarlo muy despacio porque si no se rompía.

Esta práctica me parece ideal para hacerlo en casa ya sea por los reactivos necesarios o

por lo fácil que es. Cuando se la hice a mi primo pequeño le encantó y la única

diferencia es que yo la hice en vaso de tubo en vez de en probeta.

8) Bibliografía:

http://www.biopsicologia.net/fichas/page_483.html

Práctica nº3: Cromatografía en capa fina

1) Objetivo: separar mezclas de amino ácidos por una cromatografía en capa fina

2) Fundamento teórico general:

La cromatografia es una técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias

puras de mezclas complejas. Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva

(no confundir con absorción). La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de

origen italiano, Mikhail Tswett en 1906, pero su uso no se generalizó hasta la década de

1930. Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas

verdes en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el

interior de una probeta. A medida que la solución va filtrándose por la columna, cada

componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada

por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada banda

corresponde a un pigmento diferente.

La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es

aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. De hecho las técnicas de separación

suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatográficas y no cromatográficas. La

elección de una técnica cromatográfica concreta dependerá de la naturaleza y cantidad

de la muestra, del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y equipo

asequible.

Podemos distinguir 3 tipos de cromatografía dependiendo si la fase estacionaria/fase

móvil es sólido/líquido, líquido/líquido o líquido/gas:

Si es sólido/líquido, cabe distinguir entre:

Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba

en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals).

Cromatografia de cambio iónico: el sólido es un cambiador de iones (fuerzas

electrostáticas).

Cromatografia de exclusión (o de geles): el sólido es un gel formado por polímeros no

iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.

Cromatografia de afinidad: es un tipo especial de cromatografia de adsorción, utilizada

especialmente en bioquímica, en la que un sólido tiene enlazado un llamado ligando de

afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador enzimático o un anticuerpo.

Si es líquido/líquido, cabe distinguir:

Cromatografía de partición: el soluto se reparte entra la fase móvil (liquido o gas) y la

fase estacionaria.

Si es líquido/gas, cabe distinguir entre:

Cromatografía gas-liquido (CGL), que es una cromatografía de partición.

Cromatografía gas-sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.

Si es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la

temperatura critica, pero simultáneamente comprimido a una presión mayor que su

presión critica), se trata de la cromatografía de fluidos supercríticos (CFS), que puede

ser de partición o de adsorción.

Las técnicas cromatográficas, según el dispositivo utilizado para conseguir la separación

entre la fase móvil y la estacionaria, pueden ser: en columna y plana.

Cromatografía en columna: Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la

fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil

(liquido o gas) a través de la estacionaria se consigue: 1)por presión, 2)por capilaridad,

3) por gravedad.

Cromatografia plana: La fase estacionaria está colocada en una superficie plana que en

realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que

puede considerarse bidimensional. Se divide en dos tipos generales:

3) Fundamento teórico aplicado:

Haremos diferentes soluciones de amino ácidos, luego colocaremos en la capa fina las

disoluciones de aminoácidos y la muestra problema que será zumo de naranja y tinta de

boli en otra.

4) Lista de material:

-Material de disoluciones

-Placa de silica gel

5) Lista de reactivos:

-Glicina

-Lisina

-A. Aspártico

-A. glutámico

-Revelador (200mg Nihidrina/100ml etanol)

-Eluyente (n-butanol; acetona; HAc; Agua 35.35:10:20)

-Zumo de naranja

6) Procedimiento:

Prepararemos las disoluciones de amina ácidos, todas ellas van en proporción de

1.6mg/ml y prepararemos el revelador y el eluyente

Ahora en la placa de silica gel trazaremos una línea recta más menos a 1cm del final,

sobre esa línea pondremos los aminoácidos y la muestra.

Una vez puesto todo en la placa pondremos la palca en una cubeta cromatográfica,

añadiremos eluyente y taparemos para que esté aislado. Hay que andar con cuidado de

que el eluyente no se salga, cuando esté cerca sacaremos la placa.

Se seca la placa al aire y se tiñe por inmersión en el revelador durante 1 minuto, y se

seca a 120º durante 5minutos.

7) Resultados y observaciones:

Al sacar la palca después del revelado y del secado obtuvimos una mancha difuminada

de la muestra y de los diferentes aminoácidos.

Este resultado fue debido a que a la hora de añadir los aminoácidos las gotas que

añadimos fueron muy grandes y se juntaron.

No pudimos obtener ningún resultado claro, pero viendo los resultados de los

compañeros podemos deducir que la naranja contenía todos los tipos de aminoácidos

que pusimos en la capa fina.

8) Bibliografía:

-http://www.unedcervera.com/c3900038/quimica_ingenieria/cromatografia.html