La migración de un fibroblasto involucra eventos que se · incremento de tensión ejercido por una...
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La migración de un fibroblasto involucra eventos que serepiten cíclicamente
ver animación: “clutch hypothesis”
1. Polimerización de actina en el lamelipodio. Arp2/3
2. Adhesión mediada por integrinas
3. Contracción mediada por miosina II
4. Desensamble de los complejos adhesivos
1-3. Protrusión del frente de avance. Nucleación
(Arp2/3, azul) y elongación de filamentos con
actina-ATP (rojo); terminación por capping
(proteínas CapZ, amarillo). La polimerización de
actina empuja la membrana (protrusión).
La protrusión del lamelipodio depende de una red dinámica de actina
4, Desensamble de la red de filamentos
detrás del frente de avance. Fragmentación
y desensamble de la actina-ADP (en blanco)
mediado por cofilina y gelsolina.
En el lamelipodio la red dendrítica de actina experimenta un “treadmilling”, con
un ensamble neto en el frente de avance y un desensamble neto por detrás.
Los monómeros de actina se adicionan entre el extremo
más y la membrana plasmática. La energía térmica hace
que los filamentos se curven dejando lugar suficiente para
la adición de una subunidad de actina. La fuerza elástica
hace que el filamento “vuelva”. La acción concertada de
muchos filamentos y su entrecruzamiento en una red
genera fuerza suficiente para empujar la membrana hacia
delante.Alberts et al MBC 4th Ed
5, 6. La unión de profilina a actina-ADP promueve
el intercambio del ADP por ATP en la actina la cual
es reutilizada en el frente de avance. desensamble
ensamble
fuerza de
empuje
La interacción entre proteínas adaptadoras de unión a actina e integrinas conecta citoesqueleto de actina con el sustrato
Alberts et al MBC 6th Ed
(B) Si no hay interacción entre filamentos de
actina y adhesiones focales el ensamblado de
actina mueve los filamentos hacia atrás (flujo
retrógrado).
(C) La interacción entre proteínas adaptadoras e
integrinas conecta el citoesqueleto de actina al
sustrato. Miosina genera fuerzas de contracción
que se transmiten al a través de las adhesiones
focales para generar tracción sobre la matriz
extracelular. La polimerización de actina mueve
el frente de avance hacia adelante
(A) Ensamblado de filamentos en el frente de
avance. Formación de adhesiones focales.
Para que las protrusiones que forma la actina en el margen de avance puedan mover la
célula hacia adelante se requiere de la interacción firme entre la red dendrítica de actina y
las adhesiones focales que conectan la célula al sustrato
Las fibras de estrés se anclan a
las integrinas de las adhesiones
focales mediante proteínas
adaptadoras como vinculina,
talina y paxilina.
Fascículos contráctiles de microfilamentos o fibras de estrés le permiten a la célula traccionar sobre el substrato
La miosina asociada a las fibras
de estrés les permite ejercer
fuerzas de tracción sobre las
adhesiones focales
actina
integrinas
a-actinina
fibra de estrés
vinculina
talina
Ad
he
sió
nfo
ca
l
fibras de estrés. Microscopía de
fluorescencia
focos de adhesión (flechas).
Microscopía de reflexión
focos de adhesión (verde) y fibras
de estrés (rojo). Microscopía de
fluorescencia
TalinVinculin α-actinin Paxilin
Integrin αV Actin
La microscopía de super resolución permite estudiar la arquitectura de lasadhesiones focales
Las integrinas están separadas de actina por un core de proteínas organizadas en estratos: (i)
señalización a través de integrinas, (ii) transducción de fuerzas, (iii) regulatorio de actina.
En la tecnica de iPALM (interferometric photoactivated
localization microscopy), la localización de sondas
fotoactivables brinda resolución a nanoescala en 3D
Kanchanawong, Nature 2010
El anclaje de las fibras de estrés a las adhesiones focales es determinadopor vinculina y otras proteínas
La unión de vinculina a
PIP2 induce un cambio
conformacional que le
pemite exponer sitios de
interacción con actina y
con otras proteínas que
unen actina como talina
y a-actinina.
Zam
ir & G
eig
er, J
CS
2001
Durante la migración, la fuerza dependiente de Miosina II contribuye a la translocación del núcleo en la dirección de avance
La miosina se asocia a los
filamentos de actina en la
región de la lamela más
cercana al núcleo.
miosinanúcleo
adhesiones
F-actina
miosina II
miosina II
La actividad contráctil de miosina II y F-actina se traduce en fuerzas de tracción sobre el substrato
contracción mediada
por miosina II
La fuerzas de tracción sobre el sustrato pueden visualizarse sembrando las células sobre un
substrato deformable. Durante la migración de la célula hacia adelante, las fuerzas contráctiles
que se ejercen en el frente y en la parte trasera de la célula provocan que la membrana se
arrugue. La inhibición de la miosina elimina las fuerzas de tracción.
contracción inhibida
La migración celular es el resultado del
balance entre la fuerza mecánica que
genera el citoesqueleto y la resistencia que
oponen las adhesiones focales.
A través de las actividades de protrusión y retracción las célulassensan la rigidez del substrato y adaptan la respuesta migratoria
Lo et al. Biophys J. 2000
redireccionamiento de la migración en respuesta al
incremento de tensión ejercido por una micropipeta.
Note la formación de una nueva lamela orientada
hacia la región tensionada por la micropipeta.
micro
pipeta
tensión
redireccionamiento de la migración en respuesta a la
tensión del substrato. En este experimento una célula
sembrada en el borde un substrato que exhibe un
gradiente de rigidez es filmada a distintos tiempos.
lamela
lamela
La migración direccionada de las células hacia regiones mas rígidas del substrato se denomina durotaxis
Note que la célula produce una lamela (flecha) y migra hacia la
región mas rígida (stiff) del substrato.
En este experimento las células estan adheridas a un
substrato deformable (poliacrilamida).
Experimentos con trampas láser revelan un flujo retrógado delcitoesqueleto de actina en la lamela y lamelipodio
Choquet et al, Cell 1997
Con la ayuda de una trampa láser puede posicionarse una microesfera cubierta con fibronectina sobre
el borde de la lamela (a). Después de apagar la trampa láser se puede medir la velocidad y trayectoria de la
microesfera determinando su posición en función del tiempo (gráfico en b).
microesfera
microesfera
actina
integrinas
a
video disponible MBC
a b
El flujo retrógrado de actina es determinado por la fuerza de empuje causada por la
polimerización de actina y por la tracción generada por miosina. El movimiento retrógrado de
la microesfera hacia el centro de la célula requiere del anclaje de las integrinas a los filamentos
de actina.
miosina
force
actina vinculina actina vinculina
Las GTPasas rho, rac y cdc42 controlan la actividad de variasproteínas reguladoras de la organización tridimensional de la actina
rho activo P-miosina formación de fibras de estrés
rac activo PIP2 formación de lamelipodio cdc42 activo formación de filopodios
células quiescentes
Fibroblastos quiescentes microinyectados con mutantes de GTPasas constitutivamente activas. Se muestra el
citoesqueleto de actina y los focos de adhesión (vinculina). La microinyección de rho activo induce la formación
de fibras de estrés; Rac induce la formación de un lamelipodio; Cdc42 induce la formación de filopodios
lamelipodio
La actividad de rho, rac y Cdc42 es reguladapor señales extracelulares
La señalización de diversos receptores de superficie convergen en la activación de rho, rac y Cdc42
La transducción de señales a través de rho, rac y cdc42 resulta en la activación temprana de la
polimerización de actina en el margen de avance y la formación tardía de focos de adhesión
ácido lisofosfátídico (LPA) >
mitógeno, activador de rho
Rac-GTP promueve la extensión de la lamela de avance
a través de la activación de los complejos Arp2/3.
La extensión de la lamela de avance (protrusión) requierede la activación de la GTPasa rac
dirección del movimiento
(del Pozo, Kiosses, Schwartz)
(-) nivel de activación (+)
localización de rac activo mediante FRET
integrinas
factores
de crecimiento
↑Rac ↑Scare/WAVE ↑Arp2/3 ↑polimerización de actina
lamela de avance
interaction = FRETno interaction = no FRET
Rac-GDP
Rac-GTP
efector
efector
Pak LIMK cofilina
Bershadsky et al Curr. Biol., 1996
Rho se activa cuando se depolimerizan los microtúbulos, como consecuenciase forman fibras de estrés y adhesiones focales
microtúbulos
vinculina
F-actina
control + nocodazol
↑Rho
nocodazol
↑Rho K
↑miosina II
Fibras de estrés
actividad contráctil
ensamble de
adhesiones focales
Mecanismos de regulación de la actividad de la miosina II
Integrinas Rho Rho kinasa MLC-Pi + actina contractilidad
MLC fosfatasa
En células musculares esqueléticas la actividad de la miosina II (MLC) es regulada por fosforilación mediada
por MLCK. MLCK es activada por calcio y calmodulina. En células musculares lisas y no musculares, ej.
fibroblastos, la activación de MLC depende de la Rho kinasa.
Rho
kinase
Rho
kinase
VIDEO 11
La quimiotaxis es la migración celular dirigida por el gradiente de unagente químico que difunde
La unión del quimioatractante a su receptor resulta en la activación de Rac en el frente de la célula y de
Rho en la cola, manteniendo la polaridad funcional de la célula migratoria con la formación de una
protrusión en el margen de avance y contracción en la cola.
N-formil péptido
extensión de un
nuevo lamelipodio
polarización del citoesqueleto
miosina II
migración
Arp2/3
La polaridad de las células migratorias involucra la actividadcoordinada de las GTPasas rho, rac y Cdc42
Ridley et al, Science 2003
Protrusión y formación de adhesiones. Señales
extracelulares activan a la GTPasa Rac. Rac activa
a las proteínas WASP/Scar y éstas a los complejos
Arp2/3. Los complejos Arp2/3 activos se asocian a
filamentos pre-existentes y nuclean actina. Este
proceso da lugar a nuevos filamentos de actina
(ramas).
Arp2/3
WAVE/WASP
Rac/Cdc42
Rho
Myosin II
Retracción de la parte posterior.
Señales que regulan la actividad de Rho,
miosina II, niveles de Ca2+ y el transporte
de componentes sobre microtúbulos.
Los MTs contribuyen a polarizar las células durante la migración
Señales extracelulares que estimulan receptores de membrana inducen la polarización de la célula
reorientando el centro organizador de microtúbulos (MTOC) hacia el margen de avance o ¨leading edge¨(a). Los extremos (+) de los microtúbulos dinámicos, que alternan entre estados de crecimiento y
acortamiento, son capturados y estabilizados en el citoesqueleto cortical de la membrana de avance.
Material necesario para el avance de las células, y moléculas recicladas, emplean los microtúbulos para su
transporte.
Watanabe 2005 TRENDS Cell Biol
La presencia de MTs en proximidad de la membrana puede ser visualizadapor microscopía de campo evanescente o TIRFM
En TIRFM la luz de un láser es proyectada en
forma oblicua sobre el cubreobjeto, con un
ángulo de incidencia mayor a un valor crítico
(qc), lo cual permite reflejar la totalidad de la
luz en la interfase del vidrio (álto índice de
refracción) y la célula (bajo índice de
refracción), generar un campo de excitación
evanescente que decae exponencialmente
con la distancia de la interfaz (~ 100-200 nm)
y excitar las moléculas fluorescentes.
En la periferia celular los extremos (+) de los microtúbulos contactan y regulan a los focos de adhesión a la matriz extracelular
Secuencia que muestra el contacto de un
microtúbulo (en rojo) con un foco de
adhesión (en verde)
Fibroblastos transfectados con una proteína que se localiza en focos
de adhesión fusionada a GFP (verde). Las células transfectadas
fueron microinyectadas con tubulina conjugada a rodamina (en rojo)
y examinadas por microscopía de campo evanescente.
Krylyshkina et al JCB 2003
contactos repetidos de MTs
con focos de adhesión
Proteínas fluorescentes que se unen al extremo (+) de los microtúbulos también permiten visualizar los contactos con los focos de adhesión
CLIP170 es una proteína que solo se
asocia al extremo (+) de microtúbulos
con cap de tubulina-GTP (en estado de
crecimiento).
Krylyshkina et al JCB2003
Se muestra una célula co-transfectada
con zyxina-DsRed (para marcar focos
de adhesión) y GFP-CLIP170. Las
flechas señalan los extremos (+) de 3
extremos de MTs (verde) que se
elongan en dirección de focos de
adhesión (rojo). (A) Imágenes
confocales y (B) TIRFM. La
polimerización de microtúbulos se
dirige hacia el campo evanescente
donde +TIPs se anclan en un filamento
de actina. La depolimerización se
asocia con la pérdida de +TIPs y
resulta en el desprendimiento del
microtúbulo del filamento de actina y
del sustrato.
El contacto de microtúbulos con focos de adhesión provoca su desensamble
Ezratty 2005 Nat Cell Biol
En una célula migratoria se forman pequeños
complejos focales en el márgen de avance
(Front) independiente de microtúbulos. A medida
que estos crecen y la célula avanza, el contacto
de los microtúbulos cerca de la región perinuclear
y en la región posterior de la célula modula la
actividad de Rho provocando el desensamble de
adhesiones focales. El desensamble de los focos
de adhesión y la contracción mediada por actina y
miosina permiten que la célula avance.
Secuencia que muestra la desaparición de un foco de adhesión marcado con GFP-b1-integrina (rojo)
después de ser contactado por MTs (en verde).
Small 2002 Nat Rev Mol Cell Biol
Migración colectiva
1) las células permanecen conectadas físicamente y funcionalmente de manera que la
unión célula-célula se conserva durante el movimiento
2) la polaridad multicelular y la organización “supracelular” del citoesqueleto de actina
generan fuerzas de tracción y protrusión para la migración y mantienen las uniones
célula-célula
3) el grupo de células en movimiento modifica el tejido a lo largo del camino de migración
- formación de tejidos y órganos durante el desarrollo de organismos
multicelulares
- cierre de heridas, renovación de tejidos y angiogénesis en adultos
- propagación de tumores
angiogénesis invasión
Friedl, 2009 Nature Reviews
migración de células individuales
polarización de células líderes
A pesar de experimentar una
reorientación de la polaridad baso-apical
epitelial hacia una polarización en el
frente de avance, las células líderes
retienen características epiteliales y
permanecen unidas a las células vecinas.
Las líderes presentan estructuras
protusivas dinámicas: filopodios y ruffles.
En un grupo cohesivo de células que
migran, las líderes sensan señales del
ambiente e interaccionan con la matriz
extracelular en el frente y la parte
posterior está comprometida en la
formación de uniones intercelulares. Las
uniones adherentes restringen la
localización de adhesiones focales al
frente de la célula a través de la inhibición
de su formación.
Polarización e células líderes
Mayor, 2016 Nature Reviewes
En las células líderes hay una regulación positiva de Rac1 e integrinas
La distribución de la forma activa de Rac puede investigarse usando como
sonda PAK-PBD-GFP. La sonda se localiza en el frente de avance de las células
líderes de células MDBK que migran colectivamente. Además las células líderes
muestran una señal de Rac más polarizada que las células que las siguen. La
integrina ß1 se localiza en los lamelipodios de las células líderes.
Yamaguchi, 2014 SciRep
La interacción de moléculas de superficie en los sitios de contacto célula-célula resultan en la
activación de RhoA y la inhibición de Rac en los sitios de contacto. Esto se traduce en la
catástrofe de microtúbulos, el desensamblado de focos de adhesión (círculos blancos) y la
contracción de actomiosina en los sitios de contacto. En el frente de la célula líder, hay
activación de Rac y polimerización de microtúbulos y filamentos de actina, y estabilización de
adhesiones focales (círculos rojos).
Proteínas de superficie involucradas en los contactos célula-célula regulan la actividad de GTPasas
Mayor, 2016 Nature Reviewes
Interacción de patógenos
intracelulares con microtúbulos
y microfilamentos
El transporte de virus como influenza, herpes y vaccinia hacia la periferia celular durante la salida depende de microtúbulos
Partículas que exceden los 20 nm requieren del movimiento dependiente de energía para viajar a
través del citosol. Algunos virus interaccionan con motores moleculares (ej. kinesinas) para mover la
progenie que se ensambla en el citosol hacia la membrana plasmática y propagar la infección.
El virus vaccinia contiene un motivo de secuencia conservado quemedia la interacción con la cadena liviana de kinesina1
El transporte del virus hacia la periferia de
la célula requiere de un motivo de unión a
kinesina-1 en una de las proteínas de
membrana del virus. Las imágenes de
inmunofluorescencia en (A) muestran que
los virus (azul) asociados a microtúbulos
(verde) reclutan kinesina-1 (rojo). El
movimiento del virus sobre microtúbulos
puede seguirse usando video microscopía
(B). El movimiento del virus puede
inhibirse reversiblemente usando
nocodazol para depolimerizar los
microtúbulos.
Lodish MBC2004
Motilidad dependiente de la polimerización de actinade patógenos intracelulares
La bacteria intracelular Listeria
monocytogenes utiliza la
maquinaria celular de
polimerización de actina para
impulsar su movimiento
intracelular y propagar de una
célula infectada a las células
vecinas.
Visualización del movimiento de L.
monocytogenes dentro de la célula
empleando microscopía de fluorescencia.
La bacteria se visualiza en rojo, y la
actina polimerizada en el polo caudal se
visualiza como una cometa en verde
VIDEO 12
La proteína ActA localizada en el polo caudal de la bacteria Listeria monocytogenes
se une y activa proteínas del huesped, como Arp2/3, VASP y profilina, induciendo la
nucleación y polimerización de actina. La rápida polimerización de actina en el polo
caudal de la bacteria le permite moverse en el citosol de la célula huesped.
La proteína ActA de Listeria se une y activa el complejo ARP2/3
Cameron et al, Nature RMCB 2001
VIDEO 13
ActA es un homólogo de las proteínas eucariotas de la familia WASP/WAVE
Las proteínas de la familia WASP son las
principales reguladoras del complejo
Arp2/3 en la célula eucariota. WASP se
une simultáneamente a un monómero de
actina y al complejo ARP2/3 activándolo
para la nucleación de filamentos de
actina.
Goley 2006 Nat Rev Mol Cell Biol
Patógenos intracelulares activan el complejo Arp2/3para adquirir motilidad dependiente de la polimerizaciónde actinaLa proteína ActA en la superficie de Listeria une y activa el complejo Arp2/3 en la célula
huésped. La proteína IcsA de Shigella une N-WASP para activar el complejo Arp2/3. La
forma extracelular de vaccinia dispara una cascada de señalización que culmina con el
reclutamiento de N-WASP y la activación del complejo Arp2/3.
Lis
teria
Shig
ella
vaccin
ia
F- actina
Sca2 en la superficie de Rickettsia imita la actividad de las forminas para elongar filamentos de actina
Haglund & Welch (2011) JCB
Gouin , Welch & Cossart (2005) Curr Opin Microbiol
Microscopía electrónica de las colas de actinade patógenos intracelulares
Las colas de actina de Rickettsia están formadas por filamentos largos no ramificados.
En el caso de Listeria, Shigella y vaccinia las colas de actina muestran filamentos cortos
ramificados en Y.
