Determinacin Indirecta de Microorganismos Viables Aerobios: Prueba de reduccin de colorantes

Determinacin Indirecta de Microorganismos Viables: Prueba de Reduccin de Colorantes10

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS IDOCENTE: ALBINO CORNEJO, GRACIELAALUMNA: ORTIZ BACA, RUBI SUGGEY

UNIVERSIDAD NACIONALPEDRO RUIZ GALLO

PRCTICA N3DETERMINACION INDIRECTA DE MICROORGANISMOS VIABLES: PRUEBA DE REDUCCION DE COLORANTES

I. INTRODUCCION

La complejidad bioqumica de la leche en su composicin y su elevada actividad de agua la convierte en una de los alimentos naturales donde proliferan fcilmente la mayor parte de los microorganismos y se podra catalogar como un medio universal de cultivo.

Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son beneficiosos por las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer para la salud del consumidor cuando es portador de microorganismos patgenos o de sus toxinas y el segundo a las caractersticas de conservacin de la misma que viene determinada por la presencia de un mayor o menor nmero de flora saproftica, est en elevadas concentraciones puede producir defectos y disminucin de las propiedades nutritivas y organolpticas del producto.

El desarrollo de mtodos rpidos y/o automatizados en el diagnstico de la calidad higinico sanitaria de la leche y sus productos constituye en los ltimos aos una necesidad enfocada en lo fundamental en la obtencin de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas de las fases de la cadena productiva antes de que el producto sea liberado en el mercado.

Estos mtodos rpidos de diagnstico bacteriolgico en leche se han clasificado atendiendo a diferentes puntos de vista, no obstante, en lo fundamental han tomado como base los aspectos siguientes: Rapidez con que se obtienen las respuestas, la actividad metablica de los microorganismos, posibilidades de automatizacin y principios de medicin en que se basan las lecturas. Teniendo en cuenta la diversidad de estas clasificaciones y para una mayor inclusin de mtodos rpidos empleados en el diagnstico microbiolgico de la leche, estn agrupados en tres grupos: mtodos directos, indirectos y en mtodos para diagnstico de microorganismos especficos. El mtodo usado en esta prctica es un mtodo indirecto, el mtodo de reduccin de colorantes (Reductasa), usando azul de metileno.

Mtodo de reduccin de colorante Azul de metileno: mide en in intervalo de tiempo requerido, la decoloracin de la mezcla colorante-alimento (leche) de un color caracterstico azul, hasta incoloro (blanco en caso de la leche). Se tiene en cuenta el factor tiempo y la temperatura de incubacin.

El principio de la prueba de reduccin con azul de metileno se basa en que el potencial de xido reduccin (Eh) de la leche fresca aireada es de +0.35 a +0.40 voltios, el cual se debe principalmente al contenido de O2 disuelto en el producto. Si por cualquier causa ese O2 es separado, el Eh disminuye. Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y consumen el O2. Si el nmero de microorganismos es muy elevado, el consumo de O2 ser mayor y por consiguiente el Eh caer rpidamente; si por el contrario, el nmero de microorganismos es pequeo, el Eh disminuir lentamente.El principio anterior encuentra aplicacin en la determinacin de la calidad sanitaria de la leche, utilizando como indicador de xido-reduccin al azul de metileno, este se presenta de color azul en su forma oxidada y es incoloro en su forma reducida. En solucin acuosa de pH 7,0 su oxidacin es completa a Eh +0.075 voltios y su reduccin es completa a Eh -0.015 voltios.

En la leche, por existir un pH menor de 7 (6.5 6.7), la reduccin completa del azul de metileno ocurre a un Eh ms positivo, habindose demostrado que esto tiene lugar a u Eh entre 0.075 a +0.225. El tiempo en horas que tarda en pasar el azul de metileno de su forma oxidada (azul) a la reducida (incolora) bajo condiciones controladas es proporcional a la calidad sanitaria de la leche y aunque no es posible establecer con exactitud el nmero de microorganismos, es factible clasificar el producto dentro de ciertos grados aceptables o inaceptables.

Debe tenerse en cuenta que existen factores que pueden afectar el teimpo de reduccin, entre ellos el tipo de microorganismo, el nmero de leucocitos, el periodo de exposicin a la luz, la cantidad de O2 disuelto y la tendencia de la leche a elevar los microorganismos hacia la superficie a medida que se va separando la crema en el tubo de prueba. Es as como ciertos microorganismos (Lactococcus lactis) son ms activos en su capacidad reductora que otros, mientras que existen algunas especies que son muy poco activas en este sentido (Streptococcus agalactiae, Bacillus subtilis, microorganismos termodricos). Por otra parte, a medida que aumenta el nmero de leucocitos en la leche y su exposicin a la luz natural o artificial, el tiempo de reduccin tiende a reducirse, mientras que la agitacin y la tendencia de la crema a ascender (arrastrando los microorganismos) son factores que tienden a retardar el tiempo de reduccin.

II. OBJETIVOS

Determinar de manera directa el nmero de microorganismos. Determinar las clulas viables presentes en la muestra de leche a partir de la prueba de la reductasa. Determinar a calidad de la muestra de leche.

III. MATERIALES

Material biologico: Leche fresca Material no biolgico: Tubos con tapa rosca estriles (150mL x 1.5mm de dimetro) Pipetas de 1 y 10 mL. Bao Mara de preferencia con tapa (regulado 37C 0.1) Termmetro Agua destilada estril Botella de vidrio estril Gradillas Cronometro Solucin de Azul de Metileno (Prueba de Reductasa)

IV. PROCEDIMIENTO1. Preparacin de Azul de Metileno: se tena a disposicin una solucin madre saturada de azul de metileno. Se procede a diluir la solucin de la siguiente manera. Pipetear 60 mL de agua destilada estril en una botella. Agregar 3 mL de la solucin madre de azul de metileno (AM). En este procedimiento se obtiene una dilucin 1/10 del reactivo para la prueba de reductasa.

Dilucin 1/10 de AM 3ml sol. madre AM60ml de H2O destilada

Reactivo Azul de Metileno

2. Luego de preparado el reactivo, pipetear 1 mL de reactivo azul de metileno en el tubo estril tapa rosca.Luego, con una pipeta de 10 mL tomamos esa misma cantidad de muestra de leche previamente homogenizada (20 veces) y la pasamos al tubo tapa rosca que contiene el reactivo (cada muestra de leche en su propio tubo). 3. Se preparan dos tubos control de la siguiente manera:Leche hervida (10mL) ms 1mL de reactivo azul de metileno, este ser el tubo control negativo (CN).Leche cruda sin colorante, que ser el control positivo (CP).

Tubo tapa rosca control positivo (CP)Tubo tapa rosca control negativo (CN)Tubo tapa rosca con 1ml de AM ms 10 ml de muestra de leche.

4. Tapamos los tubos y homogenizamos suavemente tratando de cuidar la esterilidad del contenido. Previamente debemos tener ya al bao Mara calentado a 37C ( 0.1), verificar bien la temperatura de la mejor manera, si el bao mara incluye el termmetro lo ms recomendable es verificar con un termmetro aparte. 5. Luego, rotulamos los tubos, los ponemos en su gradilla y lo sumergimos en el bao Mara.

6. Revisar los tubos cada 30 min, observar la reaccin que se produce en las muestras y compararlas con los tubos control. 7. Si pasados los primeros 30 min y no cambia de coloracin, es decir no se vuelve blanco, sacamos e invertimos el tubo suavemente 3 veces y lo volvemos a poner en el bao Mara por otros 30 min. Este procedimiento se realiza durante 4horas en total, hasta que el contenido se vuelva blanco. Si el contenido decolora antes de las 4 horas retirar el tubo y anotar el tiempo.8. Anotar el tiempo que demore en virar de color de la muestra, segn los resultados se interpreta de la siguiente manera:

TiempoCalificacin de la muestra

> 4 horasMuy buena, clase A

Entre 3 a 4 horasBuena, clase B

> 30 min y < 3 horasAceptable

< 30 minutosInaceptable

V. RESULTADOS Resultados de la prueba de reduccin: observacin a 30 minutos, aun se muestra la coloracin azul en la muestra. Se compara con los tubos CN y CP.

CP

CN

Resultados de la prueba de reduccin: observacin a 1 hora, aun se muestra la coloracin azul en la muestra.

Resultados de la prueba de reduccin: observacin a 1:30 hora, empieza a decolorarse en la superficie del tubo.

Resultados de la prueba de reduccin: observacin a 2 horas, se muestra una coloracin ms clara que el control negativo.

CN

Resultados de la prueba de reduccin: observacin a 2:30 horas, al comparar la muestra con los tubos control, se va decolorando ms y se asemeja al tubo CP.

Resultados de la prueba de reduccin: observacin a 3 horas.

CN

Resultados de la prueba de reduccin: observacin a 3:30 horas, la muestra se decoloro completamente. Se muestra blanca al igual que el CP.

CN

VI. CONCLUSIONESDe la prueba de reduccin del azul de metileno, se puede concluir que la muestra analizada califica como una leche Buena, lo que nos indica que haba suficiente cantidad de O2 en la muestra para que se realice una oxido reduccin completa a las 3 horas y media desde el inicio de la Prueba.

VII. CUESTIONARIO

1. Describir la frmula de azul de metileno en estado oxidadoEl azul de metileno (C16H18ClN3S .3H2O), es un colorante que tiene un PM = 373, 9. Viene en cristales o polvo cristalino de color verde oscuro, con brillo bronceado. Es inodoro o prcticamente inodoro. Es estable al aire. Sus soluciones en agua o en alcohol, son de color azul profundo. Soluble en agua y en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol. Para su preparacin (100 mL) primero pesamos 0.31g de azul de metileno (como es slido se tritura en un matraz), luego agregamos 30 mL de alcohol etlico, mezclamos y agregamos los 100 mL de agua destilada (para evitar precipitados lo pasamos por papel filtro). El azul de metileno de Loeffler tiene en vez de agua destilada una solucin de KOH al 0.01%.

2. Para qu otros alimentos se utiliza el mtodo de reduccin del azul de metileno?Adems del uso de este mtodo para productos lcteos (lquidos), tambin puede ser usado para otros alimentos como por ejemplo jugos de frutas y variedades, en los que se encuentran los jugos de soya, pia y otros, sobre todo alimentos lquidos en los que tambin se podra observar el viraje de color del azul de metileno u otro colorante a usar.

3. Qu otros mtodos indirectos existen para hacer un diagnstico microbiolgico indirecto en leche? Entre los distintos mtodos de diagnstico microbiolgico indirecto en leche que existen tenemos: por su actividad metablica tenemos al mtodo de tensin de oxgeno, el de la catalasa, citocromo E oxidasa, microcalorimetra, flujo citomtrico, el mtodo de la Impedancia y el de turbidimetra adems del mtodo de la reductasa que pertenece a este grupo. Hay pruebas indirectas relacionadas con las mediciones de las concentraciones de constituyentes especficos de las clulas, entre ellas tenemos el mtodo de Bioluminiscencia y el Limulus TEST. Por ltimo, hay pruebas indirectas que se fundamentan en la determinacin de compuestos metablicos que aparecen en la muestra como consecuencia de la transformacin de los componentes del sustrato; entre ellos tenemos la prueba del Piruvato. Adems del azul de metileno se puede utilizar la Resazurina (que cambia de azul apizarrado a rosa o blanco), este indicador fue introducido en Alemania (1929) como un sustituto del azul de metileno, desde entonces esta prueba se ha venido utilizando cada vez ms por requerir menos tiempo y al ser ms electropositiva es ms sensible que el azul de metileno para detectar ligeros cambios en el potencial de xido-reduccin que permite obtener resultados en 1 o 3 horas; y la Trifenilfetrazolium.

I. BIBLIOGRAFIA

Gua prctica: Introduccin al control de calidad de la leche cruda. 2003. Universidad de Zulia. Facultad de Ciencias Veterinarias. Ctedra de ciencia y tecnologa de la leche. Maracaibo. Disponible en: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/materialdeapoyoparapruebasdeplataforma_1693.pdfMICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS I