Las partes de un microscopio Los dos sistemas de lentes de un microscopio ptico compuesto se denominan lente objetivo, la que est mas cercana al espcimen, y lente ocular, que est en la pieza del ocular del microscopio

Las partes de un microscopio Los dos sistemas de lentes de un microscopio ptico compuesto se denominan lente objetivo, la que est mas cercana al espcimen, y lente ocular, que est en la pieza del ocular del microscopio. Los microscopios modernos llevan la fuente de luz incorporada. En la Figura 3.6 se puede observar el recorrido de la luz desde la f'uente luminosa, en la base del microscopio, hasta el ojo del obsenador. La luz pasa frecuentemente a travs de un filtro azul (para eliminar Iongitudes de onda largas) y a travs de otra serie de lentes que constituven el condensador. El condensador tiene como funcin dirigir la luz sobre el espcimen, donde parte de la misma es absorbida y parte difractada. La luz transmitida entra en la lente objetivo, que forma una imagen en el tubo del microscopio. Posteriormente la lente ocular aumenta la imagen y la proyecta en la ltima lente de la serie la de nuestro propio ojo. El ojo forma una imagen en la retina y el cerebro la percibe.

Un microscopio compuesto ordinario proporciona una iluminacin de campo claro. Esto es debido a que el condensador dirige la luz a travs del espcimen, y el fondo queda iluminado de forma brillante. Los microscopios compuestos pueden ser modificados para ver un espcimen mediante (1) contraste de fases, (2) campo oscuro, (3) fluorescencia, o (4) por contraste diferencial de interferencia (Nomarsky); todos estos mtodos se describirn ms tarde.

Poder total de aumento Casi todos los microscopios compuestos poseen varias lentes objetivos, cada una con un poder de aumento diferente. Normalmente, existe una lente de bajo poder (objetivo dbil seco) que aumenta un objeto 10 veces (l0x), una de alto poder (objetivo fuerte seco), que aumenta 40 veces (40x) y el objetivo de inmersin, 100 veces (l00x). Casi todas las lentes del ocular proporcionan un aumento adicional de 10 veces (l0x). Se puede calcular el poder total de aumento de un microscopio multiplicando cl aumento que proporcionan las dos lentes, objetivo y ocular, en uso. (Vase la Tabla 3.1, en la cual se incluyen tres ejemplos.) Si se desea observar la apariencia general de un espcimen es recomendable usar un objetivo de bajo poder, porque su campo de visin es grande. El objetivo de inmersin tiene un campo de visin pequeo, pero proporciona mas detalles de la imagen (Figura 3.7).

Casi todos los microorganismos requieren, antes de ser examinados en un microscopio ptico, una preparacin especial; esto es debido a que poseen poco contraste natural. La preparacin y la tincin (tratamiento con colorantes) de un espcimen son fundamentales si se desea obtener buenas imgenes. Muchas dcadas de esfuerzos y errores han conducido a mtodos generales de preparacin que resultan idneos. A continuacin describiremos la observacin en fresco de microorganismos vivos y varios tipos de tinciones.

Tabla 3.1. Aumento Total

MicroscopioLente objetivoLente ocularAmpliacin total

Microscopios pticos

Debil seco10x x 10x = l00x

Fuerte seco40x x 10x = 400x

Aceite de inmersin100x x 10x = 1000x

Microscopios electrnicos

Transmisin (MET)~200000x

Barrido (MEB)~10000x

Figura 3.6 El camino de la luz en el microscopio compuesto. La luente de luz est en la base. El condensador enfoca el haz de luz sobre el espcimen, donde parte se absorbe, parte se refracta, y parte se transmite. La luz transmitida penetra en la lente objetivo, que aumenta la imagen. El prisma hace que la imagen se forme en el tubo del microscopio, haciendo la visin ms cmoda. La lente ocular vuelve a aumentar la imagen y la enfoca en el ojo.

3.1.4 Preparaciones en frescoLa forma ms simple de preparar un espcimen para su examen microscpico es hacer una preparacin en fresco. Existen dos tcnicas, una preparacin en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuacin cubrirla con un cubreobjetos. Una preparacin en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubrindolo con un portaobjetos (invertido) con una excavacin central (portaobjetos excavado) (Figura 3.8). Hay que sellar la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin. La ventaja de esta ltima tcnica, es que la preparacin no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo, para la bsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa inflamacin de la vagina y la uretra. Si en la preparacin se observan clulas en forma de huso que se mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratar de T. vaginalis, pudindose efectuar el diagnstico.

Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparacin. Por tanto, su uso, con un microscopio ptico de campo claro, est bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios pticos que hemos mencionado anteriormente.

Figura 3.7 El microscopio compuesto tiene tres lentes objetivos (tres sistemas de lentes). Se muestra el mismo campo de Bacillus subtilis visto con el objetivo dbil seco (100x), fuerte seco (400x), y con el de inmersin (l000x). Los aumentos mayores revelan progresivamente ms detalle de una porcin de campo menor.

Figura 3.8 Preparacin en gota pendiente. Esta preparacin se realiza colocando una gota de la suspensin bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un crculo con vaselina o parafina (a). La vaselina acta como sellador. (b) Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavacin central que queda adherido gracias a la vaselina (c). Se invierte la preparacin y se observa colocndola en la platina del microscopio (d). Las preparaciones en gota pendiente se utilizan para observar microorganismos vivos.

3.1.5 TincionesEl microscopio de campo claro es ms til para la observacin de especmenes teidos. Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden aadirse directamente a una preparacin en fresco; por tanto, colorean clulas vivas. No obstante, la mayora de los colorantes son solamente efectivos despus de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijacin por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuacin, se pasa la preparacin de Forma rpida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas. Las protenas coaguladas unen las clulas al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijacin qumica, va que es menos lesiva que el calor. Para ello se aade una gota del fijador, por ejemplo, cido smico, formaldehdo, o glutaraldehdo, sobre la muestra lquida con los microorganismos.

La fijacin posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las clulas, lo cual dificulta la identificacin; adems, no permite la observacin del movmiento de los microorganismos. Despus de la fijacin, se aade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espcimen, para que pueda ser absorbido. A continuacin, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que tie es el ion cargado positivamente, mientras que en los cidos, el colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes ms utilizados son los de tipo bsico, va que la mayor parte de las clulas microbianas Poseen cargas dbilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se encuentran la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes cidos se unen a las partes de las clulas cargadas positivamente. Se utilizan para teir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los ms frecuentes estn la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.

TABLA 3.2 Tcnicas de tincin para bacterias

TincinUsoTcnicas

Tinciones simplesUn colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completoSe tine con un colorante bsico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tien casi todas las bacterias; la rnayora de los tejidos no se tien.

Tnciones diferenciales

Tincin de GramDos o ms colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativasSe cubre la preparacin de bacterias fijadas con cristal violeta y despus con una solucin de iodo (mordiente). Todas las clulas quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las clulas Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tie con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve ms oscuro y las Gram negativas se tien de rosa.

Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)Dos colorantes; distingue entre las micobacterias (cido-alcohol resistentes) y el resto de las bacteriasSe tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a emisin de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teidas de rojo; todas las dems se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes continan tenidas de rojo, las otras se tien de azul.

Tinciones especificas

Tincin de esporas de Wirtz-CortitlinTie selectivamente las endosporasSe cubre la preparacin con verde de malaquita y se calienta a emisin de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tie con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la clula toma el color rosa.

Tincin de flagelos de LeifsonPermite observar los flagelosA las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de cido tnico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine.

Tincin negativaRevela la presencia de cpsulasSe utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparacin en fresco del espcimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cpsula, que se observa como una regin clara alrededor de la clula.