Luna Suarez Silvia
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EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE AMARANTO EN DIVERSAS CEPAS DE E. COLI Silvia Luna Suárez*, Claudia Castro Martínez, Fernando López Valdez. CIBA-IPN Tlaxcala, Tel. 01555-7296300 ext 87814, E mail:: silvials [email protected] om.mx. Palabras clave: Proteínas recombinantes, amaranto, expresión de proteínas, E coli. Introducción El amaranto es una importante fuente de proteínas con alta calidad nutricional y recientemente ha sido demostrado que presenta algunas propiedades nutracéuticas. Se ha aislado e identificado una proteína del amaranto, la amarantina, que es la proteína de reserva mayoritaria del amaranto y además presenta un buen balance de aminoácidos, por lo que ha servido como modelo de estudio de diversos trabajos. Esta proteína tiene dos subunidades, la ácida (32-34 kb) y la básica (22-24 kb), unidas por un enlace disulfuro. El objetivo de este trabajo fue expresar proteínas recombinantes derivadas de la amarantina en diferentes cepas de Escherichia coli y evaluar las diferentes condiciones de expresión de dichas proteínas. Metodología. Se utilizó el vector de expresión pET 32 b (+) conteniendo el cDNA que codifica para tres proteínas: (1) subunidad ácida de la amarantina (SAA), (2) subunidad ácida con un epítope de seis histidina (SAA-H6) y (3) subunidad ácida con el péptido de propiedades antihipertensivas VY insertado en la parte interna de la proteína (SAA-i). Se usaron cinco cepas de expresión de E. coli DE3 (Origami, Rosetta, BL21, C43, C41) Con los vectores se transformaron cada una de las cepas mencionadas de por medio de choque térmico. Se sembraron en medio líquido LB y terrific con los respectivos antibióticos, se probaron diferentes concentraciones de inductor (IPTG) durante varios tiempos de inducción y se analizaron las proteínas utilizando SDS-PAGE y Western-blot. Resultados y discusión. En el cuadro 1 se presentan los resultados obtenidos del rendimiento de cada una de las proteínas en cada cepa de E coli probada. Los resultados obtenidos mostraron que Rosetta (DE3) presenta el mejor nivel de expresión de las tres proteínas evaluadas con respecto a todas las otras cepas. Se observó que en Rosetta (DE3) se produce 3.1 veces mas proteína recombinante que en Origami (DE3), mientras que 2.5 veces mas que BL21(DE3) y produce aproximadamente cuatro veces mas que las cepas C41(DE3) y C43(DE3). Cuadro 1. Rendimiento de las proteínas recombinantes en medio de cultivo terrific. . Proteína Origami BL21 C41 C43 Rosetta mg / L SAA 56.7 72.6 43.7 39.8 175.2 SAA -6H 55.1 73.5 39.6 32.3 173.9 SAA -i 23.1 38.7 16.3 12.2 81.3 En lo que se refiere a las condiciones de expresión observamos que el mejor tiempo de expresión fue a las 3 h de inducción (tiempos evaluados: 0, 3, 6, 9 y 20 horas de inducción) en la cepa Rosseta (DE3) y en las diferentes proteínas evaluadas. Para las otras cepas el mejor tiempo de expresión fue a las 6 horas de inducción. El efecto de la concentración de agente inductor fue realizado para la cepa Origami (DE3) y se obtuvo que a una concentración de 0.1 mM fue la mejor expresión para la proteína SAA y la SAA-i, mientras para la proteína SAA-H6 fue de 0.3 mM. El medio de cultivo tiene gran influencia en la expresión de las proteínas, se observó que en el medio terrific se expresaron aproximadamente cuatro veces mejor todas las proteínas, en el Cuadro 2 se muestran los resultados obtenidos con la cepa Origami (DE3). Cuadro 2 Comparación del rendimiento de las proteínas en dos medios de cultivo Proteína LB (mg/L) Terrific (mg/L) (SAA) 14.6ª 56.7 b SAA -6H 13.5ª 55.0 b SAA -i 6.2ª 23.1 b Los resultados anteriores nos indican que para obtener una mejor expresión de estas proteínas es necesario que la cepa de E. coli cuente con los codones de transferencia de eucariotas, tal es el caso de la cepa Rosetta (DE3); otro factor importante es que la cepa sea deficiente en proteasas como es el caso de la cepas BL21 (DE3). Además, la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma d e E. coli no representa gran importancia en la expresión de estas proteínas debido a que se produce en forma de monómeros (1). Los resultados obtenidos son mejores que los reportados para la proteína completa expresada en Origami (DE3 )(2), en BL21 (DE3)(3) y también que lo reportado para otras proteínas de reserva. Conclusiones y perspectivas. El factor que mas influye en la expresión de la subunidad ácida de la globulina 11S del amaranto con sus diferentes modificaciones (epítope 6-His e inserción del péptido VY) en E coli, es el contenido de codones raros en el cDNA, en menor grado, pero también de importancia es que las proteínas se degradan en el citoplasma de la bacteria y que no es necesario formar puentes disulfuro para mantener la estabilidad de las proteínas. Estos resultados son importantes ya que nos dan la base para poder producir estas proteínas que tienen potencial nutracéutico a mayor escala y hacer estudios de estabilidad y bioactividad de las proteínas. Referencias. 1 . Luna-Suárez S., Medina-Godoy S, Cruz-Hernández A, Paredes- López O. 2008. Expression and characterization of the acidic subunit from 11S Amaranth seed protein. Biotechnol. J. 3: 209- 19. 2 . Medina-Godoy S., Nielsen N.C. y Paredes-López, O. 2004. Expression and characterization of a His-tagged 11S seed globulin from Amaranthus hypochondriacus in Escherichia coli . Biotechnol Prog 20: 1749-1756. 3. Osuna-Castro J.A., Rascón-Cruz Q., Napier J., Fido R.J., Shewry P.R. y Paredes-López O. 2000. Overexpression, purification and in vitro refolding of the 11S globulin from amaranth seed in Escherichia coli . Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 5249-5255.
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EXPRESIN HETERLOGA DE PROTENAS RECOMBINANTES DE AMARANTO EN DIVERSAS CEPAS DE E. COLISilvia Luna Surez*, Claudia Castro Martnez, Fernando Lpez Valdez. CIBA-IPN Tlaxcala, Tel. 01555-7296300 ext 87814, E mail:: [email protected]. Palabras clave: Protenas recombinantes, amaranto, expresin de protenas, E coli. Introduccin El amaranto es una importante fuente de protenas con alta calidad nutricional y recientemente ha sido demostrado que presenta algunas propiedades nutracuticas. Se ha aislado e identificado una protena del amaranto, la amarantina, que es la protena de reserva mayoritaria del amaranto y adems presenta un buen balance de aminocidos, por lo que ha servido como modelo de estudio de diversos trabajos. Esta protena tiene dos subunidades, la cida (32-34 kb) y la bsica (22-24 kb), unidas por un enlace disulfuro. El objetivo de este trabajo fue expresar protenas recombinantes derivadas de la amarantina en diferentes cepas de Escherichia coli y evaluar las diferentes condiciones de expresin de dichas protenas. Metodologa. Se utiliz el vector de expresin pET 32 b (+) conteniendo el cDNA que codifica para tres protenas: (1) subunidad cida de la amarantina (SAA), (2) subunidad cida con un eptope de seis histidina (SAA-H6) y (3) subunidad cida con el pptido de propiedades antihipertensivas VY insertado en la parte interna de la protena (SAA-i). Se usaron cinco cepas de expresin de E. coli DE3 (Origami, Rosetta, BL21, C43, C41) Con los vectores se transformaron cada una de las cepas mencionadas de por medio de choque trmico. Se sembraron en medio lquido LB y terrific con los respectivos antibiticos, se probaron diferentes concentraciones de inductor (IPTG) durante varios tiempos de induccin y se analizaron las protenas utilizando SDS-PAGE y Western-blot. Resultados y discusin. En el cuadro 1 se presentan los resultados obtenidos del rendimiento de cada una de las protenas en cada cepa de E coli probada. Los resultados obtenidos mostraron que Rosetta (DE3) presenta el mejor nivel de expresin de las tres protenas evaluadas con respecto a todas las otras cepas. Se observ que en Rosetta (DE3) se produce 3.1 veces mas protena recombinante que en Origami (DE3), mientras que 2.5 veces mas que BL21(DE3) y produce aproximadamente cuatro veces mas que las cepas C41(DE3) y C43(DE3). Cuadro 1. Rendimiento de las protenas recombinantes en medio de cultivo terrific. . Protena Origami BL21 C41 C43 Rosetta mg / L SAA 56.7 72.6 43.7 39.8 175.2 SAA-6H 55.1 73.5 39.6 32.3 173.9 SAA-i 23.1 38.7 16.3 12.2 81.3 En lo que se refiere a las condiciones de expresin observamos que el mejor tiempo de expresin fue a las 3 h de induccin (tiempos evaluados: 0, 3, 6, 9 y 20 horas de induccin) en la cepa Rosseta (DE3) y en las diferentes protenas evaluadas. Para las otras cepas el mejor tiempo de expresin fue a las 6 horas de induccin. El efecto de la concentracin de agente inductor fue realizado para la cepa Origami (DE3) y se obtuvo que a una concentracin de 0.1 mM fue la mejor expresin para la protena SAA y la SAA-i, mientras para la protena SAA-H6 fue de 0.3 mM. El medio de cultivo tiene gran influencia en la expresin de las protenas, se observ que en el medio terrific se expresaron aproximadamente cuatro veces mejor todas las protenas, en el Cuadro 2 se muestran los resultados obtenidos con la cepa Origami (DE3). Cuadro 2 Comparacin del rendimiento de las protenas en dos medios de cultivo Protena LB (mg/L) Terrific (mg/L) (SAA) SAA-6H SAA-i 14.6 13.5 6.2 56.7b 55.0b 23.1b
Los resultados anteriores nos indican que para obtener una mejor expresin de estas protenas es necesario que la cepa de E. coli cuente con los codones de transferencia de eucariotas, tal es el caso de la cepa Rosetta (DE3); otro factor importante es que la cepa sea deficiente en proteasas como es el caso de la cepas BL21 (DE3). Adems, la formacin de enlaces disulfuro en el citoplasma de E. coli no representa gran importancia en la expresin de estas protenas debido a que se produce en forma de monmeros (1). Los resultados obtenidos son mejores que los reportados para la protena completa expresada en Origami (DE3 )(2), en BL21 (DE3)(3) y tambin que lo reportado para otras protenas de reserva. Conclusiones y perspectivas. El factor que mas influye en la expresin de la subunidad cida de la globulina 11S del amaranto con sus diferentes modificaciones (eptope 6-His e insercin del pptido VY) en E coli, es el contenido de codones raros en el cDNA, en menor grado, pero tambin de importancia es que las protenas se degradan en el citoplasma de la bacteria y que no es necesario formar puentes disulfuro para mantener la estabilidad de las protenas. Estos resultados son importantes ya que nos dan la base para poder producir estas protenas que tienen potencial nutracutico a mayor escala y hacer estudios de estabilidad y bioactividad de las protenas. Referencias. 1. Luna-Surez S., Medina-Godoy S, Cruz-Hernndez A, ParedesLpez O. 2008. Expression and characterization of the acidic subunit from 11S Amaranth seed protein. Biotechnol. J. 3: 20919. 2. Medina-Godoy S., Nielsen N.C. y Paredes-Lpez, O. 2004. Expression and characterization of a His-tagged 11S seed globulin from Amaranthus hypochondriacus in Escherichia coli. Biotechnol Prog 20: 1749-1756. 3. Osuna-Castro J.A., Rascn-Cruz Q., Napier J., Fido R.J., Shewry P.R. y Paredes-Lpez O. 2000. Overexpression, purification and in vitro refolding of the 11S globulin from amaranth seed in Escherichia coli. Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 5249-5255.
