Metalotioneínas (Mts)

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METALOTIONEÍNAS (MTs) Valentina Granados Gonzalez. Cód: 25531204 Sandra Catalina Sarmiento. Cód: 25561228

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METALOTIONEÍNAS (MTs)Valentina Granados Gonzalez. Cód: 25531204

Sandra Catalina Sarmiento. Cód: 25561228

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Descubrimiento y primeros estudios 1

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◉ En 1957, Vallee y Margoshe las aislaron de la corteza renal de los equinos y se identificaron como proteínas capaces de unir cadmio (Cd).

◉ En un principio, se consideró que la presencia de estas proteínas estaba relacionada con un mecanismo de detoxificación del Cd acumulado en el tejido renal de estos animales.

◉ Se avanzó en su descubrimiento en la década de 1990, gracias a la cristalografía de rayos X y espectroscopia por resonancia magnética nuclear .

Metallothionein Structure. http://lynes.uconn.edu/, 21-11-2015,

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Definición y localización 2

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“Proteínas de bajo peso molecular (4–8 kDa), generadas transcripcionalmente y con capacidad de ligar iones metálicos (por su alto contenido en residuos de cisteína, 30% del total de la proteína) para evitar así una intoxicación por metales.

Yeast Metallothionein Bound to Silver.2014.igem.org, 21-11-2015,

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Se han identificado en el reino animal, así como en las plantas superiores, microorganismos eucariotas y algunos procariotas.

● En los mamíferos se encuentran presentes en todos los tejidos, con mayor concentración en hígado, riñón, páncreas e intestino.

● A nivel celular se sitúan en el citoplasma (en la membrana del aparato de Golgi), sin embargo estudios han mostrado su presencia en el interior de las lisozimas y en el núcleo celular.

¿DÓNDE SE ENCUENTRAN LAS MT’s?

journal.frontiersin.org, Metallothionein in specific tissues. 21-11-2015,

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ESTRUCTURA

La estructura primaria ha sido la base de su clasificación. Ésta la determina los parámetros taxonómicos y los patrones de distribución de los residuos de Cisteína a lo largo de la secuencia de aà.

Polypeptides having the functional characteristics of metallothioneins as described above may be used in accordance with the invention. http://www.google.com.na/patents/EP0557042B1?cl=en, 21-11-15,

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ESTRUCTURA

La estructura secundaria ha sido observada en varias especies pero se posee poca información sobre su relevancia funcional.

Partial 3D model for rhMT structure obtained by clustering the 5,000 generated models. This structure represents the lowest free-energy state obtained in the sampled conformational space.http://2012.igem.org/wiki/images/3/37/UANLDCRhMT11.png

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La estructura terciaria es heterogénea y depende la especie y de la afinidad con el metal.

◉ Un dominio; levaduras y procariotas.

◉ Dos dominios; vertebrados y crustáceos.

◉ Dos dominios correlacionados; plantas.

ESTRUCTURA

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Clasificación estructural(Fowler et, al. 1987) 3

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CLASE I (61 a 64 aá, 20 Cys)

CARACTERÍSTICAS Las clases I y II se caracterizan por ser proteínas de cadena sencilla.

Aisladas de los mamíferos, sus polipéptidos se caracterizan por:

◉ Alto contenido de metales pesados (4-12 átomos/mol) unidos a las proteínas especialmente por enlaces ‘’tiol’’ y formando dos agrupamientos o dominios metálicos.

◉ Alto contenido de Cisteínas (del 23 al 33%)◉ Baja masa molecular, menor a 10000 Daltons.◉ Homología estructural o funcional relacionada con las MT aisladas de los

mamíferos.

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CARACTERÍSTICAS Las clases I y II se caracterizan por ser proteínas de cadena sencilla.

◉ Su secuencia y la distribución de aminoácidos es diferente a las metalotioneínas aisladas de mamíferos.

◉ Su longitud es variable.◉ Estas metalotioneínas han sido encontradas en eucariotas como las levaduras

y ciertos procariotas como las cianobacterias.◉ En las plantas se agrupan en cuatro tipos (Mt1, Mt2, Mt3, Mt4) de acuerdo con

el ordenamiento de los residuos de cisteína en la proteína, y fueron identificadas por primera vez en embriones maduros de trigo como una proteína 'quelatante' del zn (Cobbett y Goldsbrough, 2002).

CLASE II (Rep 2 a 11 unds de glutamil - cisteinil)

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Funciones 4

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Metallothioneins have four main functions in aquatic vertebrate. http://www.frontiersin.org/files/Articles/98870/fmars-01-00034-r2/image_m/fmars-01-00034-g001.jpg.

◉ Enlace de metales por medio de mecanismo secuencial y no cooperativo.

◉ Captación, transporte y regulación del Zinc en los sistemas biológicos. Ayuda a la señalización celular.

◉ En MT’s bacterianas los resto de His forman enlaces con el Zinc.

◉ Reguladora de proteína supresora de tumores.

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◉ Capturan radicales oxidantes como superóxido e hidroxilo / Mecanismo de control de estrés oxidativo.

◉ Biomarcadores para investigaciones.

◉ Relacionadas con anticuerpos.

Metallothionein scavenging of reactive oxygen species. http://www.mdpi.com/1422-0067/14/3/6044/htm.

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GRUPO MT OBJETO DE ESTUDIO APORTE AUTOR

MT 4 Semillas de maíz Mecanismo para proporcionar micronutrientes requeridos para la germinación White y Rivin, 1995.

MT 1Brassica júncea y Vicia faba (expuestas

a Cu y Zn)La expresión del gen en el tallo de estas plantas fue inhibida con el tratamiento de Cu

Foley et al., 1997; Schafer et al., 1997

MT2 Arabidopsis tha–liana Mayor inducción del ARNm en el tallo y en las hojas que en raíces Guo et al., 2003

MT1 Arabidopsis tha–liana Mayor inducción del ARN mensajero (ARNm) en raíces Zhou y Goldsbrough, 1995

MT3 Arabidopsis thaliana, guineo (plátano, banano), el kiwi y la manzana Sobreexpresión en las hojas de las plantas Edger y Gardner, 1994; Guo

et al., 2003

MT2 Arroz y ArabidopsisLos niveles de ARNm se incrementan en las hojas senescentes (protección de las células contra el estrés oxidativo)

Hsieh et al., 1995; García–Hernández et al., 1998

INVESTIGACIONES SOBRE FUNCIONALIDAD EN PLANTAS

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Regulación génicaPolimorfismo 5

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● Las MT humanas presentan el polimorfismo más complejo; se ha descrito la existencia de al menos 12 genes que dan origen a diferentes isoformas, algunas de ellas características de algún tejido en particular.

● La MTIII se localiza específicamente en cerebro, contiene 68 aminoácidos, 38 de los cuales son idénticos a los encontrados en las isoformas convencionales aisladas de otros tejidos.

● Se ha descrito que la MTIII posee una afinidad inhibitoria para el crecimiento celular en cerebro y debido a que su síntesis disminuye en pacientes con enfermedad de Alzheimer se ha implicado en la etiología de este desorden neurológico.

En los seres vivos la concentración de las MT varía ampliamente, lo que depende de la influencia de varios factores como el tipo de organismo, el tejido, la edad, el estado de desarrollo, el régimen dietético, la historia de exposición a metales y seguramente la presencia de otros factores aun por identificar.

Las MT aisladas del hígado humano contienen en su molécula casi exclusivamente Zn, mientras que las MT aisladas del Riñón Contiene Cd y Cu. Probablemente las diferencias de los metales que contienen reflejan la expresión diferencial de algunas formas moleculares o iso metalotioneínas.

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Unión de metales por las metalotioneínas 6

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Las MT son capaces de ligar metales esenciales (Zn y Cu), como no esenciales (Hg, Au, Pb, Cd, etc.). Cuando se saturan con sales de Zn o Cd, fijan 7 átomos de metal por molécula de proteína.

Los metales se agrupan en dos dominios:

● α (C-terminal), que tiene 11 cisteínas capaces de fijar 4 átomos de metal.● β (N-terminal), que tiene 9 cisteínas,capaces de fijar 3 átomos de metal.

- Los iones metálicos divalentes como el Zn y el Cd se coordinan tetraédricamente con cuatro Cisteínas divalentes.

- Cada molécula de MT es capaz de unir 12 metales monovalentes.

Empleando técnicas de proteolisis parcial para separar los dominios de las MT, se ha encontrado que cada uno de éstos fija 6 átomos del metal monovalente. Actualmente no se conoce la estructura tridimensional de las MT con iones metálicos monovalentes, sin embargo, los complejos cisteína-metal forman enlaces de coordinación trigonales.

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Inducción y síntesis 7

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METALES ANTIBIÓTICOS

Cd, Zn, Cu, Hg, Au, Ag, Co, Ni, Bi Estreotozotocina, Acetaminofeno, Cicloheximida

HORMONAS Y FACTORES DE CRECIMIENTO AGENTES CITOTÓXICO

Glucocorticoides, Progesterona, Estrógenos, Catecolaminas, Glucagón, Insulina, Angiotensina II, IGF-1, EGF

Hidrocarburos, Etanol, Isopropanol, Cloroformo, Tetracloruro de carbono, EDTA

AGENTES INFLAMATORIOS Y CITOQUINAS CONDICIONES ESTRESANTES

LPS, Dexametazona, Turpentina, IL-1, IL-6, IFN-α y –γ, TNF-α

Privación de movimiento, inflamación, irradiación, inmovilización

AGENTES INDUCTORES DE MT-I Y MT -2 in vivo y/o in vitro

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Estudio de caso 8

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“MODULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE

METALOTIONEÍNAS EN Perna viridis PRE EXPUESTOS A COBRE Y EXPUESTOS A

CADMIO Lemus, M., Eucaris, E., Salazar-Lugo, R., Chung, K.

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La inducción a la síntesis de MTs ocurre durante exposición a iones metálicos en la células (Mao et al. 2012), se han propuesto el uso de estas proteínas como indicador bioquímico específico para la bioacumulación de metales en organismos en ambientes contaminados.Las relaciones dadas entre la proteína y los metales depende de la especie de bivalvo, de factores bióticos y abióticos (Webb y Keaugh 2002, Rojas et al. 2009, Mao et al. 2012).

La historia de vida de un organismo determinará la magnitud de la respuesta.El objetivo de la investigación fue evaluar los efectos de pre exposiciones de Cu sobre la posterior bioacumulación a Cd y los efectos sobre los niveles de Mts en juveniles de P. viridis.

INTRODUCCIÓN

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METODOLOGÍA

Se recolectaron en un banco natural ubicado en la localidad de Guayacán

Se transportaron en contenedores isotérmicos al laboratorio

Talla promedio : 18 ± 3 mm de longitud.15 días en acuarios con agua de mar, aireación continua, salinidad 36, temperatura promedio de 25 ± 2ºC, alimentados con microalga (previamente)

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1. Grupos de 8 organismos por acuario (Límite de tolerancia media).

2. Los bioensayos duraron 96 horas y se realizaron por duplicado.

3. Se utilizó CdCl2 como fuente de Cd y CuSO2 como fuente de Cu.

4. Utilización el método de Logit.

DETERMINACIÓN DEL LC 50 PARA Cu y Cd en Perna viridis

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BIOENSAYO DE EXPOSICIÓNUbicación de 15 ejemplares de P. viridis con talla promedio de 16,5 ± 3,6

mm de longitud en un acuario de PVC de 2,6 L .

Se expusieron a una dosis 10 veces por debajo del LC50.

Grupo Cd: La concentración subletal utilizada fue de 5,48 µg Cd/L.

Grupo Cu/Cd: Fue pre expuesto a 0,33 µg Cu/L durante 15 días y posteriormente expuesto a Cd.

Grupo no expuesto: Estudiado como control.

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DETERMINACIÓN DE Cd

◉ Se tomó 1,0 mL de homogeneizado realizado para la determinación de Mts y digerido con ácido nítrico (HNO3 ).

◉ Se filtraron las muestras en papel Whatman Nº 2

◉ Se diluyó con agua desionizada hasta 10 mL.

◉ Finalmente se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 228 nm en espectrofotómetro de absorción atómica PERKIN-ELMER, calibrado con estándares de metal con rango de 0,25-4,00 mg/L.

◉ Se usó el método de Viarengo.◉ Se extrajo el tejido húmedo de cada

organismo, se pesó y se homogeneizó en frío con 3 mL de una solución buffer por cada gramo de tejido.

◉ Se centrifugó, se añadió etanol frío y Cloroformo, se centrifugó otra vez.

◉ Se realizó un secado bajo atmósfera de nitrógeno y otros procesos de mezcla y centrifugación.

◉ Se leyó la absorbancia del sobrenadante de las muestras a 412 nm.

◉ La concentración de Mts se estimó utilizando una curva de calibración, usando glutatión reducida (GSH) como estándar.

◉ Se usó el método de Bradford.◉ Las muestras fueron leídas a

595 nm, utilizando un espectrofotómetro de luz visible Helios λ modelo 1.0.

◉ Se realizó una curva de calibración con albúmina sérica de bovino (20 mg/dL, Sigma) como estándar.

DETERMINACIÓN DE MT’s DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

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ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se aplicó análisis de varianza doble para ver si existían diferencias significativas en las concentraciones de Mts y de Cd con respecto al tiempo de exposición, en los grupos experimentales y el control.

Además se realizó análisis de regresión lineal simple para determinar si existe relación entre los niveles de Mts y la bioacumulación de Cd.

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RESULTADOS

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RESULTADOS

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DISCUSIÓNEVENTO GRUPO PRE EXPUESTO A Cu GRUPO EXPUESTO A Cd

Acumulación de Cd en los tejidos de organismos 6,64 ± 1,90 µg/g. 4,74 ± 2,33 µg/g.

Concentraciones de MTs (durante los 21 días de

exposición)Cu/Cd : 1,36 ± 0,52 µg/g. 0,79 ± 0,47 µg/g

Relación entre los niveles de Mts y la bioacumulación

de CdLineal y significativa No lineal

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Cu CONCENTRACIÓN DE MT’s

Acumulación de Cd

Tolerancia y bioacumulación de

Cd

InductorAumento

Aumenta

Determina

Exposiciones previas

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CONCLUSIÓNLa preexposición de Perna viridis a una dosis subletal de un metal esencial como el Cu aumentó la capacidad de incorporación de Cd en el organismo y su tolerancia al metal, sugiriendo un efecto protector de las Mts previamente inducidas por el Cu, al efecto tóxico de una posterior exposición a Cd.

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BIBLIOGRAFÍA , IMÁGENES Y REFERENCIASNatthiya, S. (2012). Metallothionein: An Overview on its Metal Homeostatic Regulation in Mammals / Metalotioneina: Una Visión General de su Regulación Homeostática de Metales en Mamíferos. International Journal Of Morphology, (3), 1007. doi:10.4067/S0717-95022012000300039.

Brambila, M., Lozano, P., (1996). Metalotioneínas, bioquímica y funciones propuestas. Centro de investigaciones microbiológicas. Puerto Rico. From: http://www.smb.org.mx/smb-anterior/text/beb/beb991812127.pdf.

Artículo :Lemus, M., Eucaris, E., Salazar-Lugo, R., Chung, K. (2014), Modulación de la síntesis de metalotioneínas en perna viridis pre-expuestos a cobre y expuestos a cadmio SABER. Revista Multidisciplinaria del Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, vol. 26, núm. 1, enero-marzo, 2014, pp. 10-17 Universidad de Oriente Cumaná, Venezuela. From: http://www.redalyc.org/pdf/4277/427739465003.pdf.

https://es.wikipedia.org/wiki/Metalotione%C3%ADnashttp://www.deaventura.pe/blog/wp-content/uploads/2014/10/Buceo-modalidad-Apnea.jpeghttp://www.jaxshells.org/green7.htm