Estrategia para el diagnóstico mediante PCR de los niños nacidos de padres seropositivos al VIH-1.

Hacer análisis de cada niño, desde el punto de vista

serológico, con la edad y las veces que ha arribado la muestra al laboratorio.

1- Realizar Western - Blot 2- Realizar PCR para el gen GAG.3- Realizar PCR para el gen POL.4- Realizar PCR para el gen ENV.5- Realizar análisis de forma integral.(WB-PCR-edad).

* Niños menores de 1 año hacer las 3 alternativas de PCR.(Según el algoritmo aprobado)

* Niños mayores de 1 año, valorar resultados serológicos, (si estos son negativos), hacer PCR gen GAG, (si son positivos) hacer las 3 alternativas de PCR.

ESQUEMA DE DIAGNÓSTICO EN NIÑOS NACIDOS DE MADRES SEROPOSITIVAS

MUESTRA 3 MESES DE EDAD

PCR+

CVCD4POSITIVA

Tomar muestra de inmediato y repetir TODAS las pruebas

NEGATIVA

Repetir TODAS las pruebas a los 6 meses de edad

PCR positiva

CONFIRMAR

PCR negativa

A los 12 y 18 meses de edad repetir ELISAs y WB

ELISA Ag/Ac

WB

ELISA Ag P24

+

En los niños con alguna enfermedad indicativa o signo de SIDA tomar muestra de inmediato y realizar el esquema recomendado

Muestra sangre en seca en papel de filtro para PCR a los 15 días de nacido.

ESPECIFICIDADES EN LA TOMA DE MUESTRA PARA CADA EXAMEN

PARA PCR EN PAPEL DE FILTRO

•SE PUEDE USAR EL PAPEL EMPLEADO EN EL ENSAYO DE FENILCETONURIA E HIPOTIROIDISMO (903) •SERA NECESARIO COMPLETAR BIEN LOS CUATRO CIRCULOS CON SANGRE•DEJAR SECAR, COLOCAR EN UN SOBRE CON LA IDENTIFICACION DE LA MUESTRA (NOMBRE DEL NIÑO, DE LA MADRE, FECHA DE NACIMIENTO DEL NIÑO, PROVINCIA )•LA MUESTRA PODRA CONSERVARSE A 4˚C O A TEMPERATURA AMBIENTE HASTA SU TRASLADO, QUE NO REQUIERE REFRIGERACION.

ESPECIFICIDADES EN LA TOMA DE MUESTRA PARA CADA EXAMEN

PARA PCR USANDO SANGRE TOTAL

•SE TOMARAN DE 3 A 5 mL DE SANGRE DE VENA PERIFERICA

•COLOCAR LA SANGRE EN TUBO CON ANTICOAGULANTE (ACD O EDTA, NUNCA HEPARINA) QUE SERA SUMINISTRADO POR EL LABORATORIO DE REFERENCIA.

•MEZCLAR BIEN CON EL ANTICOAGULANTE Y CONSERVAR A 4˚C HASTA SU TRASLADO A LISIDA, EL MISMO DIA DE TOMADA.

•EL TRASLADO DEBERA REALIZARSE EN CONDICIONES DE REFRIGERACION (NEVERA O CONTENEDOR APROPIADO CON REFRIGERANTE)

CRITERIO DE DEFINICIÓN DE LA INFECCIÓN POR VIH EN NIÑOS (MMWR, REVISED SURVEILLANCE CASE DEFINITION FOR HIV INFECTION VOL 49/ No. RR-13, 29-31, 1999)

NIÑOS CON EDAD ≥ 18 MESES, SE CONSIDERA INFECTADO SI CUMPLE

CRITERIO DE LABORATORIO

►►RESULTADO POSITIVO EN ENSAYOS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS (ELISA Y WB)

O

►► RESULTADO POSITIVO O CANTIDADES DETECTABLESEN ENSAYOS VIROLÓGICOS (NO DE ANTICUERPOS)

---DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE VIH (DNA O RNA)---ENSAYO DE Ag p24 (INCLUYENDO LA NEUTRALIZACIÓN)---AISLAMIENTO DE VIH (CULTIVO VIRAL)

EN NIÑO CON EDAD < 18 MESES SE CONSIDERA INFECTADO SI CUMPLE

CRITERIO DE LABORATORIO

DEFINITIVO

►►RESULTADO POSITIVO EN DOS MUESTRAS INDEPENDIENTES (EXCLUYENDO SANGRE DEL CORDÓN UMBILICAL) USANDO UNO O MÁS DE LOS ENSAYOS SIGUIENTES (NO DE ANTICUERPOS) ---DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE VIH (DNA O RNA) ---ENSAYO DE Ag p24 (INCLUYENDO LA NEUTRALIZACIÓN) EN NIÑO ≥ 1 MES DE EDAD ---AISLAMIENTO DE VIH (CULTIVO VIRAL)

PRESUNTIVO (EN NIÑO QUE NO CUMPLE LOS CRITERIOS DEFINITIVOS PERO TIENE)

►►RESULTADO POSITIVO EN SOLO UNA MUESTRA (EXCLUYENDO DE CORDÓN) USANDO LAS PRUEBAS VIROLÓGICAS Y QUE NO EXISTAN RESULTADOS SUBSIGUIENTES NEGATIVOS VIROLÓGICOS O DE Ac.

EN NIÑO CON EDAD < 18 MESES NACIDO DE MADRE VIH INFECTADA

SE CONSIDERA “NO INFECTADO” SI NO CUMPLE LOS CRITERIOS ANTERIORES PERO

CUMPLE LOS CRITERIOS SIGUIENTES:

CRITERIO DE LABORATORIO

DEFINITIVO

►► AL MENOS DOS ENSAYOS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS VIH NEGATIVOS EN DOS MUESTRAS INDEPENDIENTES OBTENIDAS CON EDAD ≥ 6 MESES

►►AL MENOS DOS ENSAYOS VIROLÓGICOS NEGATIVOS EN DOS MUESTRAS INDEPENDIENTES TOMADAS CON EDAD ≥ 4 MESES

Y QUE NO TENGA OTRAS EVIDENCIAS CLÍNICAS O DE LABORATORIO DE INFECCIÓN POR VIH.

PCR VIH-1POL ENV GAG

662pb 500pbGel de Agarosa 3 % , 100 Volts, 1 hora, tinción con Br Et

442pb

AMPLICOR

HIV-1 DNA Test

1 ml de BLDWS1 ml de BLDWS

Mezclar,Mezclar,Incubar 5’ @ TAIncubar 5’ @ TA

Centrifugar 3’, Max Vel.Centrifugar 3’, Max Vel.Remover SobrenadanteRemover Sobrenadante

Centrifugar 3. Max Vel.’Centrifugar 3. Max Vel.’Remover SobrenadanteRemover Sobrenadante

1.0 mL1.0 mL

1 ml de BLDWS1 ml de BLDWS

500 ul sangre total500 ul sangre total

Almacenar secoAlmacenar secoa -70 a -70 °C°C

Resuspender Resuspender eel Pellet l Pellet

en 200 ul en 200 ul Reactivo de extracciónReactivo de extracción

200 ul Reactivo de Extracción + VIH-1 C-

200 ul Reactivo de Extracción + VIH-1 C+

Extracción

del ADN

Incubar todos los tubos 30´a 60°C y 30´a 100°C

AMPLIFICACIÓN EN TERMOCICLADOR

PTC-100

AMPLICOR HIV-1 DNA TEST, VERSIÓN 1.5

Control de Calidad

Control Negativo < 0.2 OD A450 unitsControl Positivo > 1.5 OD A450 unitsInternal Control > 0.2 OD A450 units

Resultados de los especimenesHIV IC Interpretación

< 0.2 > 0.2 ADN VIH-1, no detectado

< 0.2 < 0.2 Invalidado. Repitir el ensayo.

> 0.8 CUALQUIER ADN VIH-1, detectado

≥0.2,<0.8 CUALQUIER Resultado dudoso, Repitir el ensayo.

AMPLICOR HIV-1 DNA TEST, VERSIÓN 1.5

ESTUDIO DE LA INFECCION PERINATAL POR VIH

EMBARAZADAS3 643 535

POSITIVO INDETERMINADO NEGATIVO

140 (0,003%) 280 (0,007%) 3 643 115 (99,9%)

DECIDIERON INTERRUMPIREL EMBARAZO

SI (47) NO (74)+

ESTADO DE LOS NIÑOS (75)

POSITIVO EN ESTUDIO NEGATIVO

4 ** 23 48

+ AÑADIR 19 PORPRECISAR, O AÚN

GESTANTES** 2 FALLECIDOS

FUENTE: LABORATORIO DE INVESTIGACIONES DEL SIDA. CUBA 28/09/06

5,3%

ESTUDIO DE LA INFECCION PERINATAL POR VIH

SEROPOSITIVAS PREVIAMENTE DIAGNOSTICADASQUE DECIDIERON

NO INTERRUMPIR EL EMBARAZO

150

ESTADO DE LOS HIJOS

155

POSITIVOSEN ESTUDIO

NEGATIVOS

10*43

102

* 4 FALLECIDOS

FUENTE: LABORATORIO DE INVESTIGACIONES DEL SIDA. CUBA 28/09/06

6,45%

ESTUDIO DE LA INFECCION PERINATAL POR VIH

MADRES NO DIAGNOSTICADAS COMO SEROPOSITIVASANTES DEL

PRIMER TRIMESTRE DEL EMBARAZO

65

ESTADO DE LOS HIJOS

72

14* 5 53

* 3 FALLECIDOS

FUENTE: LABORATORIO DE INVESTIGACIONES DEL SIDA. CUBA 28/09/06

POSITIVOS EN ESTUDIO NEGATIVO 19,4%

TOTAL DE NIÑOS ESTUDIADOS Y SU SITUACIÓN ACTUAL SEGÚN DIAGNÓSTICO MATERNO AL NACER

TOTAL DE NIÑOS ESTUDIADOS Y SU SITUACIÓN ACTUAL POR PROVINCIAS.

NIÑOS SEROPOSITIVOS DIAGNOSTICADOS POR AÑO SEGÚN DIAGNÓSTICO MATERNO AL NACER