NTC5031[1] leche descremada en polvo determinación vitamina A.pdf

NORMA TCNICA NTC COLOMBIANA 5031

2002-02-20

LECHE DESCREMADA EN POLVO. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE VITAMINA A E: DRIED SKIMMED MILK. DETERMINATION OF VITAMIN A

CONTENT

CORRESPONDENCIA: DESCRIPTORES: leche; leche en polvo; determinacin

de vitamina A. I.C.S.: 67.100.10 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproduccin Editada 2002-03-01

PRLOGO El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 5031 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2002-02-20. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 311201 Leche y productos lcteos. ALGARRA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. BIOCONTROL S.A. CARULLA VIVEROS S.A. CHRISTIAN HANSEN - CENTRO AGROLECHERO CONSEJO NACIONAL LCTEO CONSEJO NACIONAL DE LA LECHE Y PREVENCIN DE LA MASTITIS COOPERATIVA DE LECHEROS DE ANTIOQUIA, COLANTA

INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO, ICA INDEPENDIENTE - HUGO PARDO LA ALQUERA S.A. LARKIN LTDA. MEALS DE COLOMBIA S.A. NESTL DE COLOMBIA S.A. PARMALAT COLOMBIA LTDA. PROCESADORA DE LECHES S.A., PROLECHE PLASTILENE S.A.

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: ASOCIACIN NACIONAL DE INDUSTRIALES ASOCIACIN NACIONAL DE LECHEROS, ANALAC COOPERATIVA DE LECHEROS DE LA COSTA, COOLECHERA FRESKALECHE FRIESLAND COLOMBIA COLPURACE INDUSTRIA COLOMBIANA DE LECHES S.A., INDUCOLSA

INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS, INVIMA JAIRO PASACHOA - INGENIERO DE ALIMENTOS LA CAMPIA S.A. MINISTERIO DE SALUD SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD TETRA PAK LTDA. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO

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ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 5031

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LECHE DESCREMADA EN POLVO. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE VITAMINA A. Advertencia. El uso de esta Norma Internacional puede incluir materiales, operaciones y equipo peligrosos. Esta norma no trata todos los problemas asociados con su uso. Es responsabilidad del usuario de la norma establecer las prcticas de seguridad e higiene y determinar previamente a su uso la aplicabilidad de limitaciones regulatorias. 1. OBJETO Esta norma especifica dos mtodos para la determinacin de vitamina A en leche descremada en polvo que contenga mnimo 10 UI de vitamina A/g, mediante el mtodo colorimtrico o por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). 2. DEFINICIONES 2.1 CONTENIDO DE VITAMINA A EN LECHE DESCREMADA EN POLVO: Es la fraccin de masa de sustancias determinada por el procedimiento especificado, en esta norma. Nota. Se expresa en microgramos de retinol por gramo o en Unidades Internacionales de actividad de vitamina A por gramo de producto. 3. PARTE 1: MTODO COLORIMTRICO 3.1 PRINCIPIO La muestra para ensayo se saponifica y se extrae la materia insaponificable, la que se hace reaccionar con cido trifluoroactico. Se mide la absorbancia a 620 nm. 3.2 REACTIVOS Se deben usar slo reactivos de grado analtico conocido, a menos que se especifique de otra forma, y agua destilada o desmineralizada o de pureza equivalente. 3.2.1 Etanol (CH3 CH2 0H), 95 % (en volumen), libre de aldehdo. 3.2.2 Solucin de ascorbato de sodio, 200 g/L. Si no est disponible lista para su uso, se prepara disolviendo 3,5 g de cido ascrbico (C6 H8 O6) en 20 ml de solucin de hidrxido de sodio (NaOH), de 1 mol/I y se mezcla. Se prepara esta solucin fresca diariamente.


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3.2.3 Solucin acuosa de hidrxido de potasio (KOH), 50 % (en peso). Se disuelven 50 g de hidrxido de potasio en 50 ml de agua. Se mezcla y se deja enfriar la solucin. Se prepara esta solucin fresca antes de usarla. 3.2.4 Solucin de hidrxido de potasio en agua-alcohol Se disuelven 3 g de hidrxido de potasio (KOH) en agua y se adicionan 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) en un matraz aforado de 100 ml. Se diluye con agua hasta los 100 ml y se mezcla. Se prepara esta solucin fresca antes de usarla. 3.2.5 ter de petrleo, con un rango de ebullicin preferiblemente entre 40 C y 60 C, o el de rango de ebullicin entre 60 C y 80 C. 3.2.6 Cloroformo (CHCl3) 3.2.7 cido trifluoroactico (CF3COOH) Advertencia. El cloroformo y el cido trifluoroactico son carcingenicos. Se deben tomar todas las precauciones necesarias. 3.2.8 Reactivo de color Se mezcla 1 parte en volumen de cido trifluoroactico puro (vase el numeral 3.2.7) y 2 partes en volumen de cloroformo (vase el numeral 3.2.6). 3.2.9 Solucin patrn de vitamina A Se usa la solucin de referencia de vitamina A, de la US Pharmacopeia1) de todos-trans-retinil acetato cristalino, en aceite de semilla de algodn, equivalente a 30 mg de retinol (vitamina A - base alcohol, C20H300) por gramo de aceite, o como se establezca al momento de la compra. Nota. Se sugiere una solucin de referencia no inferior a 35 UI. Se puede usar una solucin patrn secundaria, si se normaliza contra la solucin patrn primaria o mediante la medicin de la absorbancia en la regin UV. Se corta la punta de la cpsula de la solucin patrn de referencia de vitamina A y se vierte el aceite en un matraz aforado de 100 ml, de color mbar. Se pesa el contenido, con una precisin de 0,1 mg. Se diluye con cloroformo (vase el numeral 3.2.6) hasta la marca de 100 ml. Se usa la solucin patrn de vitamina A, tan pronto como sea posible. Se desecha la solucin patrn despus de 8 h.

1) La solucin de referencia de vitamina A, de la United States Pharmacopeia Convention, Inc. 12601

Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852, USA, es un ejemplo de un producto apropiado, disponible comercialmente. Esta informacin se da para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la norma y no constituye una garanta para este producto.


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Nota. El anterior procedimiento de preparacin de la solucin patrn de referencia es equivalente al siguiente: en un matraz aforado de 100 ml, de color mbar se pesan 34,4 mg de retinil acetato cristalizado en el matraz con una precisin de 0,1 mg. Se diluye con cloroformo hasta la marca de 100 ml. Esta solucin contiene una concentracin de 1 000 UI / ml y es estable por 2 d si se mantiene a 4 C despus de lo cual debe verificarse su concentracin. 3.2.10 Hidroxitolueno butilado (BHT) 3.3 EQUIPOS Se usan los materiales y equipos de laboratorio usuales y en particular los siguientes: 3.3.1 Colormetro fotoelctrico o espectrofotmetro Con mecanismo ptico o filtro para longitud de onda de 620 nm (derivado de la vitamina A). Se deben usar celdas de absorcin pareadas, de vidrio y de 1 cm. Es preferible un instrumento que provea linealidad entre la absorbancia y la concentracin. 3.3.2 Vaso de precipitados o matraz, de 250 ml de capacidad. 3.3.3 Matraz de saponificacin, de aproximadamente 250 ml de capacidad, conectado a un condensador de reflujo. 3.3.4 Matraz aforado, de 100 ml y de 200 ml de capacidad. 3.3.5 Pipetas aforadas, de 2 ml, 10 ml, 25 ml y 50 ml de capacidad. 3.3.6 Pipetas automticas , apropiadas para solventes orgnicos, o una pipeta que entregue 10 ml. 3.3.7 Bao de vapor, bao de agua hirviente o plancha de calentamiento elctrico 3.3.8 Bao de agua, capaz de operar a una temperatura de hasta 40 C. 3.3.9 Embudo de separacin, de 500 ml de capacidad, preferiblemente con tapn de politetrafluoetileno (PTFE). 3.3.10 Bao ultrasnico 3.3.11 Papel filtro, de 9 cm de dimetro. 3.4 TOMA DE MUESTRAS La toma de muestras no hace parte de este mtodo. En la NTC 666 (ISO 707) se dan los mtodos recomendados de muestreo. Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y que no haya sido deteriorada durante el transporte o almacenamiento.


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3.5 PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO Se mezcla completamente la muestra para ensayo rotando e invirtiendo repetidamente, el recipiente. Si es necesario, se transfiere toda la muestra para ensayo a un recipiente de suficiente capacidad, con tapa hermtica. 3.6 PROCEDIMIENTO 3.6.1 Generalidades Nota. Si se requiere verificar el cumplimiento del lmite de repetibilidad (vase el numeral 3.11.2), se deben realizar dos determinaciones sencillas de acuerdo con lo establecido en los numerales del 3.6.2 al 3.8. Para todas las operaciones se debe trabajar con luz suave o usar recipientes de vidrio antiactnico de baja transmisin de la luz. 3.6.2 Solucin para ensayo Se pesan 20 g de la muestra para ensayo, con aproximacin de 0,001 g, en un vaso de precipitado o matraz (vase el numeral 3.3.2) y se disuelven en 50 ml de agua a una temperatura de al menos 80 C. Se deshace cualquier grumo presente, con una esptula, o usando un bao ultrasnico (vase el numeral 3.3.10). Se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Se diluye con agua hasta completar el aforo de 100 ml. 3.6.3 Saponificacin y extraccin 3.6.3.1 Se transfieren, por medio de una pipeta (vase el numeral 3.3.5), 25 ml de la solucin para ensayo preparada (vase el numeral 3.6.2), a un matraz de saponificacin (vase el numeral 3.3.3). Se adicionan 20 ml de solucin de hidrxido de potasio (vase el numeral 3.2.3) y 10 ml de solucin de ascorbato de sodio (vase el numeral 3.2.2). Se adicionan 50 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) y se mezcla bien. 3.6.3.2 Se mantiene en reflujo por 30 min en un bao de vapor a 85 C (vase el numeral 3.3.7) agitando de vez en cuando. Se pone a enfriar inmediatamente bajo el chorro de agua. 3.6.3.3 Se transfiere el lquido a un embudo de separacin (vase el numeral 3.3.9) usando dos porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) y dos porciones de 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5). Se agita vigorosamente durante 30 s y se permite que permanezca en reposo hasta que las dos capas sean claras. Se transfiere la fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separacin y se agita con una mezcla de 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) y 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5). Se deja separar. 3.6.3.4 Se transfiere la fase acuosa a un tercer embudo de separacin y la fase que contiene ter de petrleo al primer embudo de separacin. Se lava el segundo embudo de separacin con dos porciones de 10 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5). Se adiciona el lquido de lavado al primer embudo de separacin.


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3.6.3.5 Se agita la fase acuosa con 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5) y 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1). Se adiciona la fase que contiene ter de petrleo al primer embudo de separacin. Se lavan los extractos combinados de ter de petrleo con tres porciones de 40 ml de solucin alcohlica de hidrxido de potasio(vase el numeral 3.2.4), agitando vigorosamente. Enseguida se lavan, con porciones de 40 ml de agua hasta que el ltimo lavado sea neutro a la fenolftalena. Se dejan escurrir las ltimas gotas de agua, y se adicionan al embudo de separacin dos hojas de papel filtro (vase el numeral 3.3.11) cortadas en tiras y se agita. Nota. En lugar de usar papel de filtro cortado en tiras, se sugiere hacer pasar los extractos etreos por un papel filtro conteniendo sulfato de sodio anhidro; despus de pasar todo el extracto, este papel filtro se lava dos veces con porciones de 10 ml de ter para recuperar algo de vitamina retenida en el filtro. 3.6.3.6 Se transfiere el extracto que contiene ter de petrleo, el cual se ha secado como se describi en 3.6.3.5, a un matraz aforado de 200 ml (vase el numeral 3.3.4). Se enjuaga el embudo de separacin y el papel con ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5), se adicionan los enjuagues al matraz, y en seguida se adicionan de 10 mg a 20 mg de BHT (vase el numeral 3.2.10). Se diluye con ter de petrleo hasta el aforo de 200 ml y se mezcla bien. 3.7 PREPARACIN DE LA SOLUCIN COLORIMTRICA PARA ENSAYO Se pipetea una alcuota del extracto diluido (vase el numeral 3.6.3.6) en un matraz de fondo redondo. Se evapora hasta sequedad, en vaco, con agitacin, en un bao de agua (vase el numeral 3.3.8) hasta una temperatura que no exceda de 40 C. Se deja enfriar bajo un chorro de agua y se restablece la presin atmosfrica, preferiblemente con nitrgeno. Inmediatamente se disuelve el residuo en 10,0 ml de cloroformo (vase el numeral 3.2.6). Nota. Una concentracin tpica de la solucin de ensayo es de 10 UI de vitamina A por mililitro de cloroformo. La cantidad de alcuota se puede ajustar dependiendo del tamao y sensibilidad de la celda espectromtrica. 3.8 DETERMINACIN Se marcan dos celdas colorimtricas pareadas, como 1 y 2. Se pipetean 2 ml de la solucin colorimtrica de ensayo (vase el numeral 3.7) en la celda 1. Se pipetean 2 ml de la solucin patrn diluida de vitamina A (vase el numeral 3.9) en la celda 2. Se adiciona, rpidamente, a cada celda, usando preferiblemente una pipeta automtica (vase el numeral 3.3.6), 10,0 ml del reactivo de color (vase el numeral 3.2.8) y se mezcla. Se mide la absorbancia de las soluciones a 620 nm, con el espectrofotmetro o el colormetro fotoelctrico (vase el numeral 3.3.1) medido contra el blanco de 2 ml de cloroformo (vase el numeral 3.2.6) y 10 ml de reactivo color (vase el numeral 3.2.8) hasta que la absorbancia alcance su mximo. Se grafican las absorbancias obtenidas contra el contenido de vitamina A. (Vase el numeral 3.9). Los volmenes y proporciones usados deben ajustarse de acuerdo con la capacidad de las celdas colorimtricas usadas. 3.9 PREPARACIN DE LA GRFICA DE CALIBRACIN Se preparan cinco diluciones, o ms, en concentraciones diferentes de solucin patrn de vitamina A (vase el numeral 3.2.9) con cloroformo (vase el numeral 3.3.6) de manera que las alcuotas de 2 ml tratadas en la determinacin colorimtrica, den absorbancias en un rango de 0,07 a 0,7 a una longitud de onda de 620 nm. Se grafican las absorbancias contra el contenido


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de vitamina A en microgramos. Si la curva es una lnea recta, se debe calcular un factor para el contenido de vitamina A en las muestras. 3.10 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS Se calcula el contenido de vitamina A, w, en microgramos de retinol por gramo (o la actividad de la vitamina A, expresada en Unidades Internacionales por gramo), usando la siguiente ecuacin:

m.V.VV.V.V.c

w52

431=

Donde: c = es la concentracin, en microgramos de retinol por mililitro (o actividad de

vitamina A en UI / ml) en el ensayo de la solucin colorimtrica de ensayo (vase el numeral 3.7), calculada a partir de la curva de calibracin (vase el numeral 3.9);

V1 = es el volumen total en mililitros de extracto de ter de petrleo (V1 = 200 ml);

V2 = es el volumen en mililitros de la alcuota tomada de V1 (vase el numeral 3.7);

V3 = es el volumen en mililitros de cloroformo en el cual se disuelve el residuo

(V3 = 10 ml);

V4 = es el volumen total en mililitros de la solucin de ensayo (vase el numeral 3.6.2) (V4 = 100 ml);

V5 = es el volumen en mililitros de la parte de alcuota de la solucin de

ensayo (vase el numeral 3.6.3.1) (V5 = 25 ml);

m = es la masa de la muestra de ensayo en gramos. 3.11 PRECISIN 3.11.1 ENSAYOS INTERLABORATORIOS Se han publicado detalles sobre la precisin del mtodo en una prueba interlaboratorios llevada a cabo, de acuerdo con la NTC 3529-1:1999 (ISO 5725-1:1994) y NTC 3529-2:1999 (ISO 5725-2:1994). Los valores derivados de la prueba interlaboratorios pueden no ser aplicables a los rangos de concentracin y matrices diferentes a los dados. 3.11.2 REPETIBILIDAD La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas sencillas e independientes, obtenidas usando el mismo mtodo sobre muestras idnticas en el mismo laboratorio con el mismo operario, usando el mismo equipo dentro de un intervalo de tiempo corto, no ser mayor del 14 % del promedio aritmtico de los dos resultados, en el 5 % de los casos.


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3.11.3 REPRODUCIBILIDAD La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas sencillas e independientes, obtenidas usando el mismo mtodo sobre muestras idnticas en diferentes laboratorios con diferentes operarios, usando diferentes equipos no ser mayor del 42 % del promedio aritmtico de los resultados en el 5 % de los casos. 3.12 INFORME DEL ENSAYO El informe del ensayo debe especificar lo siguiente:

- Toda la informacin necesaria para la identificacin de la muestra; - El mtodo de muestreo usado, si se conoce;

- El mtodo de ensayo usado, junto con la referencia a esta norma;

- Todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados

como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influenciado el (los) resultado(s) del ensayo;

- El (Los) resultado(s) obtenidos del ensayo, o, si se ha verificado la repetibilidad,

el resultado final obtenido. 4. PARTE 2. MTODO USANDO CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN 4.1 PRINCIPIO La muestra para ensayo se saponifica y se extrae. La vitamina A se separa de las impurezas por HPLC. El contenido se determina usando un detector ultravioleta o con un detector fluorescente. 4.2 REACTIVOS Slo se deben emplear reactivos de grado analtico reconocido, a menos que se especifique de otra manera y agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente. 4.2.1 Etanol, (CH3 CH2 OH), de 95 % (en volumen), libre de aldehdo. 4.2.2 Solucin de ascorbato de sodio, 200 g/l. Si no se encuentra disponible ya elaborada, se puede preparar disolviendo 3,5 g de cido ascrbico (C6H8O6) en 20 ml de solucin de hidrxido de sodio, 1 mol/l y se mezcla. Se prepara esta solucin fresca diariamente. 4.2.3 Solucin acuosa de hidrxido de potasio, 50 % (en masa). Se disuelven 50 g de hidrxido de potasio, (KOH) en 50 ml de agua. Se mezcla y se deja enfriar, la solucin obtenida, hasta temperatura ambiente. Se prepara la solucin fresca antes de usarse. 4.2.4 Solucin alcohlica acuosa de hidrxido de potasio, 30 g/l Se disuelven 3 g de hidrxido de potasio (KOH), en agua, se le adicionan 10 ml de etanol (vase el numeral vase el numeral 4.2.1) y se diluyen hasta 100 ml con agua, en un matraz volumtrico. Se prepara una solucin fresca antes de usarse.


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4.2.5 ter de petrleo, preferiblemente con intervalo de ebullicin de 40 C a 60 C, de 60 C a 80 C de intervalo de ebullicin. 4.2.6 Metanol, (CH3OH), grado HPLC. 4.2.7 Fase mvil Mezcla de metanol y agua, por ejemplo, en relacin 90:10 (por volumen). (Vase la Nota del numeral 4.9). 4.2.8 Solucin patrn de vitamina A Se usa una solucin de referencia de vitamina A, de la US Pharmacopeia1), elaborada a partir de todos-trans-retinil acetato cristalino en aceite de semilla de algodn, equivalente a 30 mg de retinol (vitamina A - base alcohol, C20H30O) por gramo de aceite, o como se establezca al momento de la compra. Se corta la punta de la cpsula de la solucin patrn de referencia de vitamina A y se pesan aproximadamente 20 mg de la solucin patrn en el matraz de saponificacin, con una precisin de 0,1 mg. Se adicionan 40 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1), 10 ml de solucin de ascorbato de sodio (vase el numeral 4.2.2) y 10 ml de solucin de hidrxido de sodio (vase el numeral 4.2.3) Se saponifica y se extrae el contenido del matraz de saponificacin, como se describe en los numerales del 4.7.2 al 4.7.5. Se prepara una solucin de referencia para ensayo como se indica en el numeral 4.8. 4.2.10 Butil hidroxitolueno (BHT) 4.3 EQUIPOS Equipo usual de laboratorio y, en particular, el siguiente. 4.3.1 Cromatgrafo lquido Adaptado con un detector ultravioleta. Las condiciones de operacin tpicas son:

- Detector UV variable que vigile la absorcin a 325 nm, o un detector de longitud de onda fija que vigile, con sensibilidad de 0,128 AUFS (unidades de absorcin, escala completa), a una longitud de onda entre 300 nm y 360 nm.

- Velocidad de flujo del efluente de 2 ml/min (a aproximadamente 10,13 MPa

(100 atm)); - Temperatura ambiente;

- Volumen de inyeccin de 20 ml;

1) La solucin de referencia de vitamina A, de la United States Pharmacopeia Convention, Inc. 12601

Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852, USA, es un ejemplo de un producto apropiado, disponible comercialmente. Esta informacin se da para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la norma y no constituye una garanta para este producto.


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- Grfico de velocidad de 10 mm/min. Cuando se usa un detector fluorescente, se ajusta a 325 nm para la exitacin y a 450 nm para la emisin. 4.3.2 Columna cromatogrfica, de acero inoxidable, 250 mm x 4,6 mm (di), empacada con C8 o C18, de 10 mm de tamao de partcula, ligada qumicamente a partculas de microsilicio o una columna de desempeo equivalente. 4.3.3 Vaso de precipitado o matraz cnico, de 250 ml de capacidad. 4.3.4 Matraz de saponificacin, de aproximadamente 200 ml de capacidad, adaptado con un condensador de reflujo. 4.3.5 Matraces volumtricos aforados, de 100 ml y 200 ml de capacidad. 4.3.6 Pipetas aforadas, de 10 ml, 25 ml y 50 ml. 4.3.7 Bao de vapor, bao de agua hirviendo o plancha de calentamiento elctrica 4.3.8 Bao de agua, capaz de operar a una temperatura hasta de 40 C 1 C. 4.3.9 Embudo de separacin, de 500 ml de capacidad, adaptado preferiblemente con un tapn de politetrafluoetileno, (PTFE). 4.3.10 Bao ultrasnico 4.3.11 Papel de filtro, de 9 cm de dimetro. 4.4 TOMA DE MUESTRAS La toma de muestras no hace parte del mtodo especificado en la presente norma. En la NTC 666 (ISO 707) se ofrece un mtodo de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado o modificado durante el transporte o almacenamiento. 4.5 PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO Se mezcla por completo la muestra para ensayo, rotndola varias veces, e invirtiendo el recipiente con la muestra. Si para esto es necesario, se transfiere toda la muestra para ensayo a un recipiente hermtico, de suficiente capacidad, para permitir la realizacin de esta operacin. 4.6 PROCEDIMIENTO 4.6.1 Generalidades Nota. Si se requiere verificar el lmite de repetibilidad encontrado (vase el numeral 4.11.2), se hacen dos corridas de dos determinaciones simples de acuerdo con lo indicado en los numerales del 4.6.2.1 al 4.6.2.4.


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Para todas las operaciones, se trabaja con luz atenuada y se emplea material de vidrio antiactnico de baja transmisin de la luz. 4.6.2 Solucin para ensayo Se pesan, con aproximacin a 0,010 g, cerca de 20 g (m1) de leche en polvo en un vaso de precipitado o en un matraz cnico (vase el numeral 4.3.3) y se disuelven en 50 ml de agua caliente, por lo menos a 80 C. Se desbarata cualquier grumo con una esptula o usando un bao ultrasnico (vase el numeral 4.3.10). Se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, (vase el numeral 4.3.5) y se diluye con agua hasta completar los 100 ml. 4.7 SAPONIFICACIN Y EXTRACCIN 4.7.1 Por medio de una pipeta, se adicionan al matraz de saponificacin (vase el numeral 4.3.4), 25 ml de muestra para ensayo preparada (vase el numeral 4.6.2). Se le adicionan 20 ml de solucin de hidrxido de potasio (vase el numeral 4.2.3) y 10 ml de solucin de ascorbato de sodio (vase el numeral 4.2.2), luego se le adicionan 50 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1) y se mezcla muy bien. 4.7.2 Se somete a reflujo durante 30 min en un bao de vapor a 85 C (vase el numeral 4.3.7), y se agita de vez en cuando. Se deja enfriar de inmediato bajo agua corriente. 4.7.3 Se transfiere el lquido a un embudo separador (vase el numeral 4.3.9) empleando dos porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1) y dos porciones de 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se agita vigorosamente durante 30 s y se permite que repose hasta que las dos capas se diferencien. Se transfiere la fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separacin y se agita con una mezcla de 10 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1) y 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se permite que se separen las fases. 4.7.4 Se transfiere la fase acuosa a un tercer embudo separador y la fase que contiene ter de petrleo al primer embudo separador. Se lava el segundo embudo separador con dos porciones de 10 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se adicionan los lavados al primer embudo separador. 4.7.5 Se agita la fase acuosa con 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5) y 10 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1). Se adiciona la fase que contiene ter de petrleo al primer embudo separador. Se lavan los extractos de ter de petrleo combinada con tres porciones de 40 ml de solucin alcohlica de hidrxido de potasio preparada recientemente (vase el numeral 4.2.4), se agita vigorosamente. A continuacin se lavan con porciones de 40 ml de agua hasta que el ltimo lavado sea neutro a la fenolftalena. Se dejan escurrir las ltimas gotas de agua, y se adicionan dos hojas de papel de filtro cortadas en tiras (vase el numeral 4.3.11) al embudo de separacin y se agita. 4.7.6 Se transfiere el extracto de ter de petrleo, secado como se describi anteriormente, a un a matraz volumrico de 200 ml (vase el numeral 4.3.5). se enjuaga el embudo de separacin y el papel con ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5), se adicionan los enjuagues al matraz volumtrico y se adicionan de 10 mg a 20 mg de BHT (vase el numeral 4.9). Se diluye con ter de petrleo hasta completar los 200 ml aforados.


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4.8 PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE REFERENCIA Y DE LA SOLUCIN PARA ENSAYO

Se adicionan a matraces de fondo redondo separados, alcuotas de los extractos diluidos (vase el numeral 4.7.5) obtenidas a partir de ambas, la solucin para ensayo (vase el numeral 4.6.2) y la solucin patrn de vitamina A (vase el numeral 4.2.8). Se evaporan hasta sequedad, bajo vaco, mediante agitacin con movimientos giratorios en un bao de agua (vase el numeral 4.3.8) a una temperatura que no exceda de 40 C. Se dejan enfriar bajo agua corriente y se restaura la presin atmosfrica, preferiblemente con nitrgeno. Se disuelve el residuo inmediatamente en 10 ml de metanol (vase el numeral 4.2.7) 4.9 DETERMINACIN Se inyectan 20 ml de la solucin de muestra para ensayo y de la solucin de referencia (vase el numeral 4.8) a una columna, y se ajustan las condiciones de operacin del detector para dar el pico de vitamina A sobre la escala ms grande posible. Se miden las reas de los picos de vitamina A. PRECAUCIN. Los detalles del procedimiento cromatogrfico dependen, entre otros, del equipo, el tipo, edad, y el proveedor de la columna, los medios de introduccin del ensayo y de la solucin de referencia, el tamao de la muestra y del detector. La relacin de metanol a agua variar de acuerdo con estos factores; el incremento del contenido de agua de la fase mvil causa un incremento en el tiempo de retencin. 4.10 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS Se calcula el contenido de vitamina A, w, en microgramos de retinol por gramo (o la activiadad de la vitamina A, expresada en Unidades Internacionales por gramo), usando la siguiente ecuacin:

m.V.V.A

V.V.V.A.cw

r

s

52

431=

Donde:

c = es la concentracin, en microgramos de retinol por mililitro (o actividad de la vitamina A en UI por mililitro) en la solucin de referencia (vase el numeral 4.8);

As = es el valor numrico del rea del pico de vitamina A en la solucin de

ensayo (vase el numeral 4.9);

Ar = es el valor numrico del rea del pico de vitamina A en la solucin de referencia (vase el numeral 4.9);

V1 = es el volumen total, en mililitros, del extracto de ter de petrleo (V1 = 200 ml);

V2 = es el volumen, en mililitros, de la alcuota tomada en V1;


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V3 = es el volumen, en mililitros, de metanol en el cual el residuo se disuelve (V3 = 10 ml);

V4 = es el volumen total, en mililitros, de la solucin de ensayo (vase el

numeral 4.6.2) (V4 = 100 ml);

V5 = es el volumen, en mililitros, de la parte de alcuota de la solucin de ensayo (vase el numeral 4.7.1) (V5 = 25 ml)

m = es la masa de la muestra para ensayo, en gramos.

4.11. PRECISIN 4.11.1 ENSAYO INTERLABORATORIO Se han publicado los detalles de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la NTC 3529-1:1999 (ISO 5725-1:1994) y NTC 3529-2:1999 (ISO 5725-2:1994). Los valores derivados de este ensayo interlaboratorio pueden no ser aplicables a otros rangos de concentracin y matrices diferentes a aquellos dados. 4.11.2 REPETIBILIDAD La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo, nicos, independientes, obtenida empleando el mismo mtodo, sobre material de ensayo idntico, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, utilizando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, no ser en ms del 5 % de los casos superior al 14 % de la media aritmtica de los dos resultados. 4.11.3 REPRODUCIBILIDAD La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nicos, independientes, obtenida empleando el mismo mtodo, sobre material de ensayo idntico, en diferentes laboratorios, con diferentes operadores, usando diferentes equipos, no ser en ms del 5 % de los casos superior al 17 % de la media aritmtica de los dos resultados. 4.12 INFORME DE ENSAYO El informe del ensayo debe especificar:

- toda la informacin requerida para la completa identificacin de la muestra;

- el mtodo de muestreo empleado, si se conoce;

- el mtodo de ensayo empleado, con referencia a la presente norma;

- todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados opcionales, junto con detalles de los incidentes que puedan haber influido en el (los) resultado(s) del ensayo;

- el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; y

- si se ha verificado la repetibilidad, el resultado final obtenido.


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5. NORMAS QUE DEBEN CONSULTARSE Las siguientes normas contienen disposiciones que, a travs de la referencia en este texto, constituyen disposiciones de la presente norma. Dichas publicaciones no se aplican para referencias fechadas, subsecuentes enmiendas o actualizaciones. No obstante, se invita a las partes que lleguen a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la posibilidad de aplicar las ediciones ms recientes de las normas indicadas a continuacin. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin de la norma referenciada. NTC 666:1996, Leche y productos lcteos. Gua para muestreo. (ISO 707:1997, Milk and Milk products Guidance on sampling) NTC 2175:1986, (Reaprobada 1999) Material de vidrio para laboratorio. Buretas. Requisitos generales. (ISO 385-1:1984, Laboratory Glassware Burettes Part 1. General Requirements) NTC 3529-1:1999, Precisin de los mtodos de medicin y de los resultados. Principios generales y definiciones. (ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1. General Principles and Definitions). NTC 3529-2: Exactitud (veracidad y precisin) de mtodos de medicin y resultados. Parte 2. Mtodo bsico para la determinacin de repetibilidad y reproducibilidad en un mtodo normalizado de medicin. (ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2. A basic Method for the Determination of Repeatability and Reproductibility of a Standard Measurement Method). 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Dried Skimmed Milk. Determination of Vitamin A Content. Part 1. Colorimetric Method. Switzerland, ISO, 2000. 7 p. (ISO 12080-1). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Dried Skimmed Milk. Determination of Vitamin A Content- Part 2. Method using High-Performance Liquid Chromatography. Switzerland, ISO, 2000. 7 p. (ISO 12080-2).


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Anexo A (Informativo)

Actividad expresada en Unidades Internacionales (UI)

A1. ACTIVIDAD DE LA VITAMINA A La actividad de la vitamina A se expresa en Unidades Internacionales. Se ha definido en la Farmacopea Europea (European Pharmacopoeia, Monograh vitamin A), que 1 UI de vitamina A corresponde a la actividad de 0,344 mg todo de trans-retinil acetato. La actividad de otros compuestos de vitamina A se calcula estequiomtricamente tal que 1 Ul corresponde a la actividad de 0,300 mg todo de trans-retino, 0,359 mg todos de trans-retinil propionato o 0,500 mg todos de trans-retinil palmitado, respectivamente. Esto significa que la actividad de 1 g, todo de trans-vitamina A alcohol y ester, expresado en Unidades internacionales, es igual a: - vitamina A alcohol (reitnol) 3 333 000 Ul; - vitamina A acetato 2 907 000 Ul; - vitamina A propionato 2 785 000 Ul; - vitamina A palmitato 1 818 000 Ul; A2. ENSAYO DE VITAMINA A ESTNDAR Con una aproximacin de 0,1 %, se pesan 25 mg de vitamina A ester en un matraz. Se disuelve esta en 5 ml de pentano y se diluye, dependiendo de la cantidad pesada, con 2-propanol a una presunta concentracin de 10 Ul/ml hasta 15 Ul/ml. Se verifica que la absorcin mxima, Am, de la solucin est situada entre 325 nm y 327 nm usando 2-propanol como lquido de compensacin (blanco). Se mide la absorbancia, An, a 300 nm, 326 nm y 730 nm. Se calcula la relacin An/Am para cada longitud de onda mencionada. Si las relaciones no exceden de 0,593 a 300 nm, 0,537 a 350 nm, 0 0,142 a 370 nm respectivamente, entonces se calcula el contenido, w, de vitamina A en Unidades Internacionales por gramo usando la ecuacin:

md.V.A

w m100

=

Donde: Am = es el valor numrico de la absorbancia mxima obtenida a 326 nm; V = es el volumen total al cual la vitamina A ester ha sido diluida para dar 10

Ul/ml hasta 15 Ul/ml;


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d = es el factor para convertir la absorbancia especfica de steres de vitamina A a unidades Internacionales por gramo (d = 1 900);

m = es la masa de steres de vitamina A pesados en gramos.


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Anexo B (Informativo)

Otras normas internacionales sobre el mismo tema

Organismo internacional

Nmero norma Tema Principio Norma ISO relacionada

INTERNATIONAL DIARY FEDERATION, IDF

IDF Standard 142: 1990

Leche en polvo descremada. Determinacin del contenido de vitamina A

Mtodo colorimtrico

ISO 12080-1

Official Methods of Analysis of AOAC, 17 th Edition 2000

AOAC 992.04 Vitamina A (Retinol Isomers) in Milk and Milk-Based Infant Formula

Leche y frmula infantil a base de leche

Mtodo de cromatografa lquida

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