OXIDACIONES DEL RECEPTOR DE RIANODINA EN EL MODELO DE...
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OXIDACIONES DEL RECEPTOR DE RIANODINA EN EL MODELO DE CORAZÓN ATONTADO Cuando el corazón es sometido a un breve período de isquemia seguido reperfusión (I/R) el restablecimiento del flujo 2+ sanguíneo provoca una sobrecarga de Ca y un aumento en la generación de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) (Fig. 1) que conducen a daños que van desde una disminución transitoria de la contractilidad (atontamiento), hasta la aparición de arritmias e incluso muerte celular (1). Estos trastornos aparecen asociados a alteraciones 2+ postraduccionales (como fosforilación y oxidación) de proteínas que manejan el Ca intracelular (2). Nosotros 2+ demostramos que el aumento de la fosforilación del canal liberador de Ca del retículo sarcoplasmático o receptor de rianodina (RyR2) es un factor proarritmogénico (3). Además el RyR2, es altamente sensible a los cambios redox, debido a la Corazones de ratas Wistar aislados y perfundidos por la técnica de Langendorff se sometieron a I/R (20min/30min), en presencia y ausencia de: L-NAME (inhibidor de la óxido nítrico sintasa) Apocinina (APO,inhibidor de la NADPH oxidasa) MPG (atrapador de ROS). Durante el protocolo se evaluaron parámetros mecánicos (presión desarrollada por el ventrículo izquierdo, LVDP) y eléctricos (potenciales monofásicos epicárdicos, MAPs). Luego de 1 minuto de reperfusión, como indica la flecha, los corazones fueron congelados en N líquido para realizar 2 los ensayos bioquímicos determinándose cambios redox del RyR2 por inmunodetección y cantidad de glutatión reducido (GSH) en homogenatos de tejido ventricular. 1 2 1 Román B. , Schinella G. , Mundiña-Weilenmann C. 1 1 Becerra R. , Said M. , 1 Centro de Investigaciones Cardiovasculares, CCT-CONICET La Plata. Cátedra de Fisiología y Física Biológica, Facultad de Ciencias Médicas, UNLP. 2 Facultad de Ciencias Médicas, UNLP, CIC-PBA. I/R 30 min 20 min 20 min Estabilización Isquemia Reperfusión Immunodetección de SNO-RyR2, GSH-RyR2 y GSH Homogeneización de corazones Electrodo Transductor de presión Cánula de perfusión 1 min 10 ìM Apocinina 100 ìM L-NAME Evaluación de la función contráctil y arritmias Los resultados muestran que la remoción de las oxidaciones reversibles al inicio de la reperfusión acentúa la generación de arritmias sólo en un entorno pro-oxidante (APO y L-NAME). Estos hallazgos sugieren que la S-Glutationilación y S-Nitrosilación del RyR2 surgen como un mecanismo que protege a la proteína de cambios oxidativos irreversibles que conducen a la arritmogénesis. El tratamiento con MPG, que evita el aumento de la producción de ROS/RNS en la I/R, limita las oxidaciones del RyR2 y las arritmias de reperfusión. CONCLUSIÓN Latidos prematuros GSH-RyR2/RyR2 SNO-RyR2/RyR2 2 mM MPG ISQUEMIA REPERFUSIÓN ESTABILIZACIÓN ESTABILIZACIÓN GSH S-S SH SH SH P RyR2 SNO SH Medida de GSH APO L-NAME MPG Ctrol I/R L-NAME APO MPG 0 25 50 75 100 125 150 175 Ctrol I/R L-NAME APO MPG 0 25 50 75 100 125 150 # # * * * * # # Ctrol I/R L-NAME APO MPG 0 20 40 60 * * * OBJETIVO Nuestro objetivo fue estudiar las oxidaciones del RyR2 que ocurren durante la reperfusión y su relación con la aparición de arritmias. 0 10 20 30 40 50 60 70 nº de latidos prematuros * * * # # Reperfusión 3` L-NAME APO I/R Ctrol MPG # * Citosol ROS RNS Arritmias RS RyR2 GSH SNO OX SH P P ROS RNS Arritmias RyR2 SH P P SH SH SH MPG ROS RNS Arritmias RyR2 SNO SH P P APO OX OX ROS RNS Arritmias RyR2 SH P P OX OX L-NAME GSH Citosol RS Citosol RS Citosol RS Figura 5. Registro representativo obtenido durante el protocolo de I/R a través del cual se evalúan los parámetros mecánicos y eléctricos simultáneamente, y se observan las arritmias típicas. Figura 7. Resultados totales de la S- Glutationilación del RyR2 (GSH-RyR2/RyR2), en Control y luego de 1 minuto de reperfusión en ausencia (I/R) y presencia de L-NAME, APO y MPG. Al minuto de reperfusión se detectó un aumento de la S-Glutationilación del RyR2. La perfusión con APO y MPG disminuyeron la S- Glutationilación significativamente, mientras que con L-NAME los niveles permanecieron sin cambios respecto I/R. * p< 0.05 vs. Control y # p<0.05 vs. IR. n=5-9 por intervención. 80 μ G H/g d e do g S r e t ji % rol C t l % Ctro M AP (mV ) L VDP H g) (mm Figura 1. Esquema representativo de las principales fuentes de especies reactivas del oxigeno (ROS) y del nitrógeno (RSN) en el miocito cardíaco: NADPH oxidasa (NOX), óxido nítrico sintasa (NOS), xantina oxidasa (XO) y la mitocondria. Figura 3. Foto del preparado experimental 175 gran cantidad de grupos sulfhidrilos (SH) que posee (Fig. 2). Estas oxidaciones pueden ser reversibles (como la S-Glutationilación, S- Nitrosilación) o irreversibles y poco se conoce sobre los efectos que estos cambios pueden tener sobre la actividad del canal y la generación de arritmias de reperfusión (posdespolarizaciones tardías). Túbulo T LTCC NCX NOX NADP+ NADPH eNOS Cav3 Ca+2 RyR2 CQS SERCA2a PLN nNOS xo Mitocondria ROS/RNS Figura 8. Número de arritmias contadas como latidos prematuros (LP) observados en Control y luego de 3 minutos de reperfusión en ausencia y en presencia de L-NAME, APO y MPG. Se detectó un aumento de LP durante la I/R, que fue aún mayor en los corazones tratados con L- NAME y APO, mientras que el tratamiento con MPG lo disminuyó.* p< 0.05 vs. Control y # p< 0.05 vs. reperfusión en ausencia de los inhibidores. n = 5-7 por intervención. Figura 4. Esquema del protocolo experimental de I/R global Figura 9. Cantidad de GSH libre expresado en μg/g de tejido. El contenido de GSH libre disminuyó en los corazones sometidos a I/R. Mientras que el tratamiento con APO y L-NAME no modificó los valores obtenidos en I/R, la perfusión con MPG impidió esa caída. * p< 0.05 vs. pre-isquemia y # p< 0.05 vs. reperfusión en ausencia de los inhibidores n=3-6 por intervención. Figura 6. Resultados totales de la S- Nitrosilación (SNO-RyR2/RyR2) en Control y luego de 1 minuto de reperfusión en ausencia (I/R) y presencia de L-NAME, APO y MPG. Al minuto de reperfusión se detectó un aumento de la S-Nitrosilación del RyR2. La presencia de L- NAME y MPG f disminuyeron la S-Nitrosilación, mientras que la perfusión con APO no tuvo nengún efecto con respecto a I/R. * p< 0.05 vs. Control y # p<0.05 vs. IR. n=5-9 por intervención. REFERENCIAS 1. Bolli R. et al. Physiol Rev. 1999;79:609-34. 2. Fauconnier J. et al. Pharmacol Ther. 2013;138(3):323-32. 3. Said M. et al. J Mol Cell Cardiol. 2011;51:936-44. Figura 2. Cambios postraduccionales que pueden ocurrir sobre el RyR2: fosforilación (P), S-Glutationilación (GSH), S-Nitrosilación (SNO) y formación de puentes disulfuros (S-S).
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OXIDACIONES DEL RECEPTOR DE RIANODINA EN EL MODELO DE CORAZÓN ATONTADO
Cuando el corazón es sometido a un breve período de isquemia seguido reperfusión (I/R) el restablecimiento del flujo 2+sanguíneo provoca una sobrecarga de Ca y un aumento en la generación de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno
(ROS/RNS) (Fig. 1) que conducen a daños que van desde una disminución transitoria de la contractilidad (atontamiento), hasta la aparición de arritmias e incluso muerte celular (1). Estos trastornos aparecen asociados a alteraciones
2+postraduccionales (como fosforilación y oxidación) de proteínas que manejan el Ca intracelular (2). Nosotros 2+ demostramos que el aumento de la fosforilación del canal liberador de Ca del retículo sarcoplasmático o receptor de
rianodina (RyR2) es un factor proarritmogénico (3). Además el RyR2, es altamente sensible a los cambios redox, debido a la
Corazones de ratas Wistar aislados y perfundidos por la técnica de Langendorff se sometieron a I/R (20min/30min), en presencia y ausencia de: L-NAME (inhibidor de la óxido nítrico sintasa) Apocinina (APO,inhibidor de la NADPH oxidasa) MPG (atrapador de ROS). Durante el protocolo se evaluaron parámetros mecánicos (presión desarrollada por el ventrículo izquierdo, LVDP) y eléctricos (potenciales monofásicos epicárdicos, MAPs). Luego de 1 minuto de reperfusión, como indica la flecha, los corazones fueron congelados en N líquido para realizar 2
los ensayos bioquímicos determinándose cambios redox del RyR2 por inmunodetección y cantidad de glutatión reducido (GSH) en homogenatos de tejido ventricular.
1 2 1Román B. , Schinella G. , Mundiña-Weilenmann C.1 1Becerra R. , Said M. ,
1Centro de Investigaciones Cardiovasculares, CCT-CONICET La Plata. Cátedra de Fisiología y Física Biológica, Facultad de Ciencias Médicas, UNLP. 2Facultad de Ciencias Médicas, UNLP, CIC-PBA.
I/R
30 min20 min20 min
Estabilización Isquemia Reperfusión
Immunodetección de SNO-RyR2, GSH-RyR2 y GSH
Homogeneización de corazonesElectrodo
Transductor de presión
Cánula de perfusión
1 min
10 ìM Apocinina
100 ìM L-NAME
Evaluación de la función contráctil y arritmias
Los resultados muestran que la remoción de las oxidaciones reversibles al inicio de la reperfusión acentúa la generación de arritmias sólo en un entorno pro-oxidante (APO y L-NAME). Estos hallazgos sugieren que la S-Glutationilación y S-Nitrosilación del RyR2 surgen como un mecanismo que protege a la proteína de cambios oxidativos irreversibles que conducen a la arritmogénesis. El tratamiento con MPG, que evita el aumento de la producción de ROS/RNS en la I/R, limita las oxidaciones del RyR2 y las arritmias de reperfusión.
CONCLUSIÓN
Latidos prematuros
GSH-RyR2/RyR2SNO-RyR2/RyR2
2 mM MPG
ISQUEMIA REPERFUSIÓNESTABILIZACIÓNESTABILIZACIÓN
GSH
S-S
SHSHSH
P
RyR2
SNO
SH
Medida de GSH
APO
L-NAME
MPG
Ctrol I/R L-NAME APO MPG0
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Ctrol I/R L-NAME APO MPG
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OBJETIVO
Nuestro objetivo fue estudiar las oxidaciones del RyR2 que ocurren durante la reperfusión y su relación con la aparición de arritmias.
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Arritmias
RyR2
OX SH
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L-NAME
GSH
Citosol
RS
Citosol
RS
Citosol
RS
Figura 5. Registro representativo obtenido durante el protocolo de I/R a través del cual se evalúan los parámetros mecánicos y eléctricos simultáneamente, y se observan las arritmias típicas.
Figura 7. Resultados totales de la S-Glutationilación del RyR2 (GSH-RyR2/RyR2), en Control y luego de 1 minuto de reperfusión en ausencia (I/R) y presencia de L-NAME, APO y MPG. Al minuto de reperfusión se detectó un aumento de la S-Glutationilación del RyR2. La perfusión con APO y MPG disminuyeron la S-Glutationilación significativamente, mientras que con L-NAME los niveles permanecieron sin cambios respecto I/R. * p< 0.05 vs. Control y # p<0.05 vs. IR. n=5-9 por intervención.
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Figura 1.
Esquema representativo de las principales fuentes de especies reactivas del oxigeno (ROS) y del nitrógeno (RSN) en el miocito cardíaco: NADPH oxidasa (NOX), óxido nítrico sintasa (NOS), xantina oxidasa (XO) y la mitocondria.
Figura 3. Foto del preparado experimental
175
gran cantidad de grupos sulfhidrilos (SH) que posee (Fig. 2). Estas oxidaciones pueden ser reversibles (como la S-Glutationilación, S- Nitrosilación) o irreversibles y poco se conoce sobre los efectos que estos cambios pueden tener sobre la actividad del canal y la generación de arritmias de reperfusión (posdespolarizaciones tardías).
Túbulo T
LTCC
NCX
NOX
NADP+
NADPH
eNOS Cav3
Ca+2
RyR2
CQSSERCA2a PLN
nNOS
xoMitocondria
ROS/RNS
Figura 8. Número de arritmias contadas como latidos prematuros (LP) observados en Control y luego de 3 minutos de reperfusión en ausencia y en presencia de L-NAME, APO y MPG. Se detectó un aumento de LP durante la I/R, que fue aún mayor en los corazones tratados con L-NAME y APO, mientras que el tratamiento con MPG lo disminuyó.* p< 0.05 vs. Control y # p< 0.05 vs. reperfusión en ausencia de los inhibidores. n = 5-7 por intervención.
Figura 4. Esquema del protocolo experimental de I/R global
Figura 9. Cantidad de GSH libre expresado en µg/g de tejido. El contenido de GSH libre disminuyó en los corazones sometidos a I/R. Mientras que el tratamiento con APO y L-NAME no modificó los valores obtenidos en I/R, la perfusión con MPG impidió esa caída. * p< 0.05 vs. pre-isquemia y # p< 0.05 vs. reperfusión en ausencia de los inhibidores n=3-6 por intervención.
Figura 6. Resultados totales de la S-Nitrosilación (SNO-RyR2/RyR2) en Control y luego de 1 minuto de reperfusión en ausencia (I/R) y presencia de L-NAME, APO y MPG. Al minuto de reperfusión se detectó un aumento de la S-Nitrosilación del RyR2. La presencia de L-NAME y MPG f disminuyeron la S-Nitrosilación, mientras que la perfusión con APO no tuvo nengún efecto con respecto a I/R. * p< 0.05 vs. Control y # p<0.05 vs. IR. n=5-9 por intervención.
REFERENCIAS1. Bolli R. et al. Physiol Rev. 1999;79:609-34. 2. Fauconnier J. et al. Pharmacol Ther. 2013;138(3):323-32. 3. Said M. et al. J Mol Cell Cardiol. 2011;51:936-44.
Figura 2. Cambios postraduccionales que pueden ocurrir sobre el RyR2: fosforilación (P), S-Glutationilación (GSH), S-Nitrosilación (SNO) y formación de puentes disulfuros (S-S).
