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Prctica 6:
Metabolismo
de Glucosa
Prcticas de Bioqumica
Clnica
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Objetivos
Aplicar la curva de calibracin para la
determinacin de glucosa en muestras
biolgicas.
Determinar la concentracin de la glucosa
en estado basal en una muestra biolgica
mediante el mtodo enzimtico
colorimtrico.
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Resultados
Profesionales en formacin con destrezas
y conocimientos para la determinacin
de glucosa mediante el mtodo
colorimtrico.
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Generalidades
La principal funcin bioqumica de la glucosa es la de proporcionar energa
para los procesos de la vida. El adenosn trifosfato (ATP) es la fuente de energa universal para las reacciones
biolgicas. La oxidacin de la glucosa por las vas glucoltica y del cido ctrico es la fuente principal de energa para la biosntesis del ATP.
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El sistema para regular los niveles de glucosa
sangunea funciona para lograr dos fines:
1. Almacenar glucosa en exceso en relacin
a las necesidades corporales inmediatas
en un reservorio compacto (glucgeno)
2. Movilizar la glucosa almacenada de
manera que mantenga el nivel de glucosa
sangunea.
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La regulacin de la glucosa sangunea es
esencial para mantener al cerebro, cuya
fuente energtica primaria es la glucosa,
abastecido por una cantidad constante de la
misma.
INSULINA
La funcin de la insulina es desviar la glucosa
extracelular a los sitios de almacenamiento
intracelular en la forma de macromolculas
(como el glucgeno, lpidos y protenas). Es as
que la glucosa es almacenada en tiempos de
abundancia para los momentos de necesidad.
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Fundamento del mtodo utilizado
en esta prctica (GOD-PAP):
La glucosa se determina despus de la oxidacin
enzimtica en presencia de glucosa oxidasa. El
perxido de hidrgeno formado reacciona bajo
la catlisis de peroxidasa con fenol y
4-aminoantipirina formando un complejo
rojo-violeta usando la quinonemina con indicador.
La determinacin de glucosa se efecta segn las
siguientes reacciones:
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GOD Glucosa + O2+ H2O H2O2 + Acido glucnico
POD 2 H2O2 + Fenol + 4- aminoantipirina quinoneimina + 4H2O2
GOD= Glucosa oxidasa
POD= Peroxidasa
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Recomendaciones
La muestra debe recolectarse en ayuno excepto por el agua, durante ocho horas cuando menos antes de la prueba.
La muestra debe recolectarse en tubo recolector de tapn rojo para suero (sin anticoagulante) o de color lila (EDTA)
En casos de emergencia o de control de diabticos la prueba se puede realizar en cualquier momento.
La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm de 5 a 10 min. para separar el suero o plasma.
La glucosa en suero o plasma es estable al menos 3 das a 2-8 C.
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Tips
Los anticoagulantes de uso corriente como la EDTA,
oxalato, heparina o fluoruro no afectan los
resultados.
La hemlisis hasta 0,3 g/dL no interfiere
La muestra es inaceptable si:
El suero se obtiene turbio
La identificacin es inadecuada
El tubo de recoleccin no es el adecuado
Cuando haya excedido el tiempo mximo de
anlisis permisible.
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Tips Revisar la fecha de caducidad del reactivo, y
su correcto almacenamiento despus de abierto.
Realizar alcuotas para trabajar ya que el reactivo abierto es estable por 2 semanas de 15 a 20C (revisar condiciones fabricante).
Puede haber interferencia en los resultados en el caso de sueros lipmicos o ictricos; o con valores elevados de creatinina o galactosa.
Cuando la concentracin de la muestra excede la linearidad del reactivo, diluir el suero con agua destilada (1+2), repetir la determinacin y multiplicar el resultado por 3.
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Materiales
Suero o plasma
Tubos de ensayo
Pipetas automticas de 2ml
Micropipeta de 20 l
Centrfuga
Espectofotmetro para lecturas de 540 nm
Gradilla
Kit de reactivos para determinacin de glucosa: patrn, reactivo enzimtico.
Agua destilada
Suero fisiolgico
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Condiciones de ensayo:
Longitud de onda: 540 nm
Temperatura ambiente
Tiempo de reaccin: 10 minutos
Tiempo de estabilidad de color hasta 60
minutos
Cubeta: 1cm. Paso de luz
Medicin frente a blanco de reactivo
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Procedimiento
Obtenido el suero o plasma y
debidamente identificado, colocar en los
tubos de ensayo numerados
Numerar los tubos que corresponden a la
prueba de glucosa
Medir en los tubos de ensayo de acuerdo
a lo siguiente:
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Blanco Estndar Muestra Muestra
control
Estndar
(STD)
------- 20 l
-------
-------
Muestra ------- ------- 20 l
-------
Muestra
control
------- ------- -------
20 l
Reactivo 2 ml 2 ml
2 ml
2 ml
Mezclar, incubar por 10 min a 20-25C o 5 min a 37C.
Mida la absorbancia del estndar y las muestras frente a
un blanco de reactivo antes de 60 minutos.
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Clculos:
Podemos realizar lecturas en la curva de
calibracin, considerando que la curva cumpla
con los estndares establecidos.
Se puede calcular mediante la concentracin del
patrn:
mg/dl glucosa = Abs. Muestra x concentracin STD
Abs. STD
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Valores de referencia
Dependen del mtodo, reactivo y
poblacin analizada, se considera normal
en suero o plasma en ayunas 75-115 mg/dl
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Informe de la prctica
Valores obtenidos en la muestra y valores de referencia.
Investigar pruebas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos y a qu patologas se asocian.
Investigar los mtodos para determinar hemoglobina glicosilada
Problemas y soluciones que se presentaron en la prctica.