INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

EXTRACCION E IDENTIFICACION DE PIGMENTOS

VEGETALES

AUTORES:

CLAUDIA ISABEL GARCIA ARRIAGA

EMMANUEL GONZALEZ TOVAR

PATRICIA FERNANDA GUERRERO SANCHEZ

BRANDON HERNANDEZ BAENA

HUMBERTO HERNANDEZ RAMOS

ANA GABRIELA TIRADO VÁZQUEZ

PROFESOR:

M. C. MIGUEL DAVID DUFOO HURTADO

ASIGNATURA:

FITOQUÍMICOS

GRUPO:

7° A

CORTÁZAR, GTO. A 9 DE NOVIEMBRE DE 2015

1

Universidad Politécnica de Guanajuato

INTRODUCCION

Los colores que presentan los vegetales son debidos a unos compuestos químicos

llamados pigmentos. El color que presenta un determinado órgano vegetal depende

generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinación de ellos. Además,

algunos de los pigmentos que condicionan el color están estrechamente ligados a las

actividades fisiológicas del propio vegetal (Dennis et al, 1998).

También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo,

cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la

presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos. Asociados

con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y

amarillo-anaranjados que son las xantofilas y carotenos (blafar.blogia.com). La extracción

y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para el estudio y conocimiento de sus

propiedades (Azcón-Bieto & Gruissem, 2000)

Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son moléculas

químicas que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de

un pigmento depende de la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de

la reflexión de otras (Blanco, 1983). La Clorofila, es el pigmento que da el color verde a los

vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria para realizar la fotosíntesis, proceso

que posibilita la síntesis de sustancias orgánicas a partir de las inorgánicas (Azcón-Bieto &

Gruissem, 2000).

En ocasiones, la presencia de clorofila no es tan patente al descomponerse y ocupar su lugar

otros pigmentos de origen isoprénico también presentes en los plastos como son los

carotenos (alfa, beta y gamma) y las Xantofilas (Azcón-Bieto & Gruissem, 2000).

Químicamente la mayoría de los carotenoides son tetraterpenoides, compuestos de 40

átomos de carbono formados por ocho unidades isoprenoides unidas de forma que la

secuencia se invierte en el centro de la molécula. Es decir, la unión de dichas unidades es

“cabeza-cola”, excepto en el centro de la molécula, donde es “cabeza-cabeza”.

2

Considerando los elementos químicos presentes en sus moléculas, los carotenoides pueden

dividirse en dos grandes grupos: carotenos, que son hidrocarburos, y xantofilas, que

contienen átomos de oxígeno (Britton, 1992)

Las clorofilas presentan una estructura molecular de gran tamaño de tipo

porfirinico, estando formada en su mayor parte por carbono e hidrógeno; constituyendo un

anillo tetrapirrolico ocupado en el centro por un único átomo de magnesio, rodeado por un

grupo de átomos que contienen nitrógeno. Del anillo parte una larga cadena de 20 átomos

de carbono, denominada fitol que constituye el punto de anclaje de la molécula de clorofila

a la membrana interna del cloroplasto, el orgánulo celular donde tiene lugar la fotosíntesis

(Buchanan et al, 2000)

Las técnicas cromatografías para el análisis y purificación de los productos de

reacción son ampliamente utilizadas en el laboratorio orgánico. Todas las técnicas

cromatografías dependen de la distribución de los componentes de la mezcla entre dos fases

inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias que se

separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil

puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido (Villarreal

F. et al, 1991)

Cromatografía de adsorción. Dentro de esta técnica pueden diferenciarse dos tipos

de cromatografías de adsorción denominadas cromatografía cromatografía de columna y de

capa fina. Para la técnica de cromatografía de adsorción en columna se emplean columnas

verticales de vidrio cerrada en su parte inferior con una llave que permita la regulación del

flujo de la fase móvil. Las columnas se rellenan con un adsorbente, como alúmina o gel de

sílice (fase estacionaria), mojado con el disolvente que se vaya a emplear en el proceso

cromatográfico (Villarreal et al, 1991).

Método de identificación. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y

utilizados es la espectroscopía, en general, y la espectroscopía ultravioleta-visible, en

particular. Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras

3

biológicas, con el empleo de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a

analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas. Se

basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la

cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo

de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de

onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. El espectro de absorción del β-caroteno muestra dos picos de absorbancia entre los 400 nm y

500 nm.

OBJETIVO

General

Separar e identificar los pigmentos presentes en las hojas de espinaca.

Específicos

Usar la cromatografía de absorción en columna para la extracción de pigmentos.

Identificar el pigmento extraído por medio de espectrometría UV-Visible.

METODOLOGIA

Materia prima

La materia prima que se utilizó para la extracción cromatografíca fue espinaca de

una marca comercial adquirida en uno de los formatos de supermercado Aurrera en la

Ciudad de Celaya, Gto.

Preparación de la muestra

4

Se pesaron alrededor de 40 g de hojas de espinaca sin tallos para después ser

triturados en un mortero con 10 gr de sulfato de sodio anhidro obteniendo un tipo de polvo

verde, posteriormente se transfiere la mezcla a un tubo Falcón de 50 ml añadiendo cantidad

suficiente de hexano para la obtención de la muestra, se agito alrededor de 5 minutos para

obtener una solución de color verde donde se encontraran los pigmentos a extraer, se llevó

a la centrifuga por 10 minutos a 2000 rpm. Por último se decanta la mezcla hasta obtener la

solución de hexano color verde que servirá como muestra a separar.

Método de separación

Cromatografía de absorción en columna

Para la separación de los pigmentos presentes en las hojas de espinaca se utilizó como

método de separación la cromatografía de absorción en columna colocando un tapón de

algodón en el extremo de la columna enseguida de medio centímetro de arena limpia

empacando con silica gel que servirá como fase estacionaria quedando alrededor de 20 cm

de altura y por último se añadió nuevamente medio centímetro de arena limpia dejando

alrededor de 5 cm de la columna donde quedara la muestra a separar, como fase móvil se

utilizó un solvente de polaridad baja que fue el hexano que nos ayudara a separar los

compuestos coloreados de la espinaca.

Acondicionamiento de la columna

Se empaco la columna de cromatografía con silica gel dejando circular hexano por

alrededor de 15 minutos hasta que fuera totalmente homogénea el gel.

Elución de la muestra

Introducir cuidadosamente la muestra en la parte superior de la columna dejando que

empiece a bajar por efecto de la gravedad. No dejar secar la columna con ayuda del

hexano que nos servirá como fase móvil para la separación de los compuestos. Los

5

pigmentos extraídos se colectaran en fracciones, la circulación de hexano se detendrá hasta

que el color amarillo allá salido de la columna cromatografica.

Método de identificación

Espectrometría UV-Visible

Para la identificación del pigmento extraído se utilizó como método la

espectrometría UV-Visible en el laboratorio de investigación donde se realizó un barrido de

una longitud de onda de 200 a 800 nm utilizando celdas de plástico y como blanco el

hexano que fue el solvente utilizado para la extracción.

RESULTADOS Y DISCUSION

Mediante la separación cromatografía se obtuvo una fracción de 100 ml de color

amarillo recolectada en un matraz Erlenmeyer después de un tiempo de elución de

aproximadamente 3 horas y media, la cual se analizó para ver el tipo de pigmento mediante

espectrometría UV-Visible; se realizando un barrido desde los 200 a 800 nm dando un

espectro como se muestra en la Figura 1.

Con lo reportado por Medina y Carreño en 2015 como se muestra en la Figura 2

el espectro obtenido en una separación cromatografica con silica gel se obtuvieron 2 picos

máximos en una longitud de onda de 448 nm y 473 nm, con la semejanza que muestra el

espectro de la Figura 1 de la fracción obtenida de las hojas de espinaca donde se obtuvo 2

picos máximos a una longitud de 460 nm y 475 nm, afirmando que el espectro pertenece a

los carotenos presentes en dichas hojas.

6

Comparando con los resultados obtenidos por Gutiérrez en 1997 observados en la

Figura 3, el estándar 1 muestra un espectro similar al de la fracción amarilla obtenida en

este estudio sugiriendo que pertenece a la β-Criptoxantina. Duran y Moreno (2000)

reportan que las hojas de espinaca tienen en su composición los pigmentos tales como la

clorofila a y b, el α y β caroteno estando el β caroteno en mayor proporción así como las

xantofilas quedando descartado que sea β-Criptoxantina; retomando el espectro de los

estándares de carotenoides el espectro de la Figura 1 comparado con el estándar 3 y 4 de

la Figura 3 se especula que perteneciera al α o β caroteno.

Con lo reportado por Hernández y

Carreño en 1977 los espectros

7

mostrados en la figura 4 pertenecen al del β-Caroteno encontrados en la pulpa del melón

fresco extraído con diferentes solventes como el CS2, Hexano y Éter de petróleo llegando

a afirmar que el pigmento extraído en este estudio pertenece al β-caroteno no importando el

tipo de solvente utilizado ya que su espectro de absorción va desde los 400 a los 500 nm.

CONCLUSION

En base a los resultados obtenidos y las comparaciones realizadas con artículos y

estudios similares quedamos de acuerdo a que la extracción e identificación realizada

pertenece a los β-Carotenos por sus similitudes con los espectros referenciados así como

las longitudes de onda parecidas pertenecientes a los picos más altos, y para que sea más

certero este resultado se recomienda hacer replicas en la separación cromatografica, así

como usar diferentes solventes por ejemplo éter de petróleo, acetona o sus combinaciones

para la obtención de las demás fracciones y quedar con un resultado más exacto del

compuesto estudiado.

8

Figura 4: Espectros de absorción de β caroteno con diferentes solventes

En cuanto al método de separación se recomienda usar una columna cromatografica

de un diámetro mayor al utilizado ya que el tiempo de elución fue muy largo pudiendo

reducirlo y acelerara el estudio, además de dar un buen tratamiento a la muestra para que no

haya ningún inconveniente a la hora de la extracción.

REFERENCIAS

Azcón-Bieto, M. Talón (eds.). Fundamentos de Fisiología Vegetal. Madrid:

McGraw Hill/Interamericana, Edicions Universitat de Barcelona, 2000

Blanco Prieto F. Manual del Laboratorio de Química. Gráficas Cervantes.

Salamanca, 1983

B.B. Buchanan, W. Gruissem, R. Jones. Biochemistry and Molecular Biology of

plants.Rockville (USA): American Society of Plant Physiologists, 2000.

M. G. Durán & M. J. Moreno Alvarez (2000) EVALUACIÓN DE ALGUNAS MEZCLAS DE SOLVENTES EN LA EXTRACCIÓN DE CAROTENOIDES DEL PERICARPIO DETAMARILLO: (Cyphomandra betacea Sendt). Venezuela. 2000.

Hernández N. R. y Carreño D. R. CARACTERIZACION DE LOS CAROTENOS

DEL MELON (Cucumis melo L.) Venezuela 1977

Gutiérrez, M. L. Determinación cuantitativa de carotenoides en hojas de cinco

especies del genero Leucaena. Universidad Autónoma de Nuevo León. 1997

J. Dennis AND D.H. Turpin (eds). Plant metabolism. Plant physiology,

Biochemistry, and Molecular Biology. Orlando, USA: Academic Press, 1998.

Myrna L. Medina B. y Rafael J. Carreño D. EVACUACIÓN DEL MATERIAL FOLIAR DE RAYO DE SOL COMO POSIBLE FUENTE DE XANTOFILAS. Venezuela. 2015

Villarreal F. et al. Experimentos de Química. Ed. Trillas. Mexico, 1991

http://blafar.blogia.com/2007/040901-lospigmentos-vegetales.php

9