PRODUCCION DE ENZIMAS
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TEMA 2
PRODUCCIN INDUSTRIAL DE ENZIMAS A PARTIR DE ALIMENTOSProcedencia comercial de las enzimas:microbianas, de plantas, de animales
Etapas en la obtencin de enzimas industriales:seleccin de la fuente optimizacin de la produccin extraccin, aislamiento y purificacin ingeniera y diseo de enzimas
TEMA 2
PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS ANIMALES PLANTAS MICROORGANISMOS
CULTIVOS CELULARES
TEMA 2
Los microorganismos son la fuente principal de enzimas de aplicacin industrial. Presentan numerosas ventajasLos microorganismos son muy verstiles y tericamente se puede encontrar un microorganismo que produzca un enzima concreto. Los microorganismos pueden ser modificados genticamente para producir mayor cantidad de enzima. La recuperacin de las enzimas microbianas suele ser fcil, puesto que, generalmente, son extracelulares. La produccin de enzimas microbianas requiere materias primas fciles de conseguir ya que crecen en medios de cultivo con escasos requerimientos. Los microorganismos son fciles de cultivar, tienen velocidades crecimiento y de produccin de enzimas muy alta (baratas, abundantes) de
La tecnologa a gran escala para su produccin se encuentra hoy bien establecida. Fcil escalado Las enzimas microbianas son ms estables que sus homlogas de plantas y animales.
TEMA 2
ENZIMAS INTRACELULARES: permanecen en el interior de la clula.Actan sobre sustratos de bajo peso molecular. Glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, penicilin acilasa, a-galactosidasa pullulanasa y lactasa.Es necesaria la integridad de la clula para que se sintetice el enzima y preservar su estabilidad. Para obtener el producto es necesario romper las clulas y separar el producto de los restos celulares. Operacin difcil y costosa Las enzimas aparecen contaminadas con otras protenas intracelulares.
la separacin de las clulas del medio de cultivo permite obtener preparados muy concentrados que facilitan la purificacin
TEMA 2
ENZIMAS EXTRACELULARES: actan sobre sustratos de altopeso molecular. Se sintetizan en grandes cantidades. Muy reguladas.
Hidrolasas
Dado que la molcula es segregada fuera de la clula, no se requieren tcnicas de ruptura celular que a veces son difciles de aplicar a gran escala. El nmero de protenas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fcil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura ms compacta y menos susceptibles a la desnaturalizacin que las correspondientes intracelulares.
TEMA 2
ETAPAS EN LA OBTENCIN DE ENZIMAS INDUSTRIALES
Seleccin de la fuente Produccin de clulas con un alto nivel de la enzima Rotura celular y eliminacin de los restos celulares (enzimas intracelulares) Concentracin y enriquecimiento Purificacin con alta resolucin (dependiendo de su uso final)
Concentracin y formulacin del preparado
TEMA 2
OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCINMaximizar la velocidad de sntesis concentracin para reducir costos. de enzima y su
Experimentacin previa en el laboratorio:
Ciclo celular. Requerimientos nutricionales. Constitutiva o inducible. Intracelular o extracelular. Mecanismos de control de su sntesis.
TEMA 2
OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Seleccin de una cepa, a partir del medio natural o de colecciones de cultivo. Factores a considerar: criterios de seguridad:
daos sobre el producto (propio organismo o por un metabolito)contaminacin con toxinas debe crecer en medios simples y baratos estable en sus propiedades genticas producir alta cantidad de producto en poco tiempo fcil de separar
ORGANISMOS TERMFILOS
TEMA 2
OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Mejora de estirpesIncrementar la productividad de la enzima
Reducir o eliminar enzimas contaminantesConseguir su sntesis sin necesidad de inductores Permitir su sntesis en condiciones inadecuadas
1. Mutacin y seleccin2. Hibridacin 3. Tecnologa de ADN recombinante
TEMA 2
OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCINFormulacin y preparacin del medio de cultivo: baratos y fciles de reproducir. Consideraciones:Requerimientos nutricionales (C, N, P,S,O, Mg, Ca, etc) Propiedades de la enzima: Induccin Represin por catabolitos Inhibicin por producto Mecanismos de liberacin
ESTERILIZACIN EXTRACCIN DE LA BIOMASA Y RECUPERACIN DE ENZIMA
TEMA 2
OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCINDiseo del equipo y del proceso de fermentacinFERMENTACIN EN SUSTRATO SLIDO: sustrato insoluble sin fase lquida libre El proceso est limitado a hongos Difcil medida de los parmetros del proceso Difcil control del pH, T, transferencia de oxgeno
La mayora de los sustratos requieren un pretratamientoMedios de cultivo muy simples No suele haber contaminacin bacteriana- ESTERILIZACIN Enzima se recoge muy concentrado No es necesario mantener inculos FERMENTACIN SUMERGIDA
TEMA 2
PURIFICACINConsideraciones Generales
Necesidad de purificacin Prdida del enzima: prdida fsica inactivacin
pH y temperatura formacin de espuma Proteasas agentes quelantes.
TEMA 2
FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACINFactor inactivante Fuente de enzima frecuencia Modo de contrarrestarlo
Calor Frio Proteasa Productos oxidacin de fenoles oxidacin Dilucin protena Prdida de estabilidad Inhibidores especficos Metales pesados Cambios de fase
cualquiera cualquiera mayora Plantas y hongos
universal raro Comn Bastante comn
Enfriamiento Calentamiento Inhibidores de proteasas o fro Agentes reductores
cualquiera cualquiera cualquiera Plantas y bacterias cualquiera cualquiera
comn Bastante comn Bastante comn Raro Raro comn
Agentes reductores Concentracin rpida Restauracin de ese factor Separacin del inhibidor Agentes quelantes Mnima agitacin
TEMA 2
EXTRACCIN, AISLAMIENTO Y PURIFICACINMATERIAL DE PARTIDA
ROTURA CELULAR
Detergente
Tratamiento con lcali
Tamizacin lquida
Agitacin con abrasivos
Tratamiento enzimtico
Choque osmtico
Tamizacin slida
ELIMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS
SEPARACIN SLIDO-LQUIDO
Centrifugacin CONCENTRACIN
Filtracin
Precipitacin
Adsorcin
Secado
Liofilizacin PURIFICACIN
Ultrafiltracin
Cromatografa
Sistemas en dos fases
TEMA 2
EXTRACCINCONSIDERACIONES PARTICULARES: SEGN LA NATURALEZA INTRACELULAR O EXTRACELULAR necesidad o no de rotura celular
SEGN LA FUENTE DE ENZIMA: Microorganismos Animales Vegetales
TEMA 2
ELECCIN DEL MTODO DE ROTURA
Susceptibilidad de la clula Caractersticas de estabilidad del enzima Velocidad del mtodo
Facilidad de separacin de los restos celulares COSTE del proceso
TEMA 2
MTODOS DE ROTURA1. Mtodos qumicos de lisis celular:1.1 lcali 1.2 lisozima y EDTA 1.3 detergentes: inicos no inicos
2. Mtodos fsicos de lisis celular:2.1 sonicacin 2.2 shock por enfriamiento 2.3 choque osmtico 2.4 congelacin y descongelacin 2.5 tamizacin slida 2.6 homogeneizacin con abrasivos 2.7 tamizacin lquida
TEMA 2
EXTRACCIN, AISLAMIENTO Y PURIFICACINMATERIAL DE PARTIDA
ROTURA CELULAR
Detergente
Tratamiento con lcali
Tamizacin lquida
Agitacin con abrasivos
Tratamiento enzimtico
Choque osmtico
Tamizacin slida
ELIMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS
SEPARACIN SLIDO-LQUIDO
Centrifugacin CONCENTRACIN
Filtracin
Precipitacin
Adsorcin
Secado
Liofilizacin PURIFICACIN
Ultrafiltracin
Cromatografa
Sistemas en dos fases
TEMA 2
CONCENTRACIN Y ENRIQUECIMIENTO1er paso: Eliminacin de cidos nucleicos: pH alto, fuerza inica baja, nucleasas 2 paso: Eliminacin de restos celulares: Centrifugacin Filtracin
3er paso: Concentracin: Precipitacin Adsorcin Ultrafiltracin Secado Liofilizacin
TEMA 2
AISLAMIENTO Y PURIFICACIN: CENTRIFUGACIN Centrfugas discontinuas
Centrfugas de flujo continuo:De disco De rotor tubular De cestillo
TEMA 2
AISLAMIENTO Y PURIFICACIN: FILTRACIN Ultrafiltracin: Opera a temperatura y presin baja Suave y no destructiva No hay inactivacin del enzima Econmica
Filtracin de flujo tangencial. Fcil escalado
TEMA 2
AISLAMIENTO Y PURIFICACIN: CONCENTRACINPrecipitacinSulfato amnico Solventes orgnicos Polmeros de alto peso molecular
Adsorcin polisacridos aninicos polisacridos catinicos Cromatografa de afinidad Otros
Ultrafiltracin Secado Evaporacin rotatoria Secado en spray liofilizacin
TEMA 2
TCNICAS DE PURIFICACIN: CROMATOGRAFACromatografa a gran escala:
Se pueden aplicar los mismos mtodos que en cromatografa analtica. El objetivo principal es purificar grandes cantidades en el menor tiempoposible (flujos elevados).
Fcilmente escalable (aumento del dimetro de la columna) Optimizacin previa en el laboratorio.
Saltos de escala progresivos. Destino final del producto (posible presencia de contaminantes) Seleccin del tipo de matriz. Eliminacin material particulado, evitar laadsorcin inespecfica y contaminacin bacteriana.
TEMA 2
TCNICAS DE PURIFICACIN: CromatografaTipo de matrizDextrano con enlaces entrecruzados Poliacrilamida entrecruzados Agarosa Agarosa con enlaces entrecruzados Compuesto poliacrilamida/dextrano Compuesto poliacrilamida/agarosa Polmero acrlico hidroxilado Copolmero etilenglicol-metacrilato Celulosa Slice porosa Polmero orgnico rgido con enlaces
PorosidadBaja Baja Alta Alta Alta Media Media Baja/media Media/alta Baja/media Media/alta
Adsorcin noespecficaBaja Baja Baja Baja Media Baja Media Media Alta Alta Baja
RigidezBaja Baja Baja Media Media Media Media Media Baja Alta Alta
EstabilidadBuena Buena Deficiente Buena Buena Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena
Facilidad de modificacinbuena buena buena buena buena buena buena buena buena deficiente buena
Coste relativoBajo/medio Medio Medio Medio Medio Medio/alto Medio Medio Bajo Alto Alto
TEMA 2
TCNICAS DE PURIFICACINCromatografaIntercambio inico Cromatoenfoque Afinidad Interaccin hidrofbica Filtracin en gel HPLC
Sistemas acuosos en dos fases
TEMA 2
TCNICAS DE PURIFICACIN: CromatografaCaracterstica molecular aprovechada Tamao
Tipo de cromatografaFiltracin en gel
Caractersticas Resolucin moderada para el fraccionamiento y buena para tampones intercambiadores. Capacidad limitada por el volumen de la muestra
Aplicacin El fraccionamiento es mejor en las ltimas etapas de la purificacin. En cualquier momento se pueden usar tampones intercambiadores y podr existir una limitacin respecto al volumen de muestra
Carga
Intercambio inico
La resolucin puede ser alta. Capacidad alta no limitada por el volumen de la muestra. La velocidad puede ser muy elevada dependiendo de la matriz.La resolucin puede ser alta. La capacidad puede ser alta. La velocidad puede ser alta Resolucin buena Capacidad muy alta y no limitada por el volumen de muestra. Velocidad alta La resolucin puede ser elevada. Capacidad puede ser alta o baja, dependiendo del ligando y no limitada por el volumen de la muestra. Velocidad alta.
Es ms efectiva en las primeras fases del fraccionamiento cuando se van a manipular grandes volmenes.
Cromatoenfoque
Es mejor usarla en una purificacin posterior, ya que las matrices son caras. Puede ser utilizada en cualquier fase, pero es mejor aplicarla cuando la fuerza inica es alta tras la precipitacin con sales o despus de un inter-cambio inico Puede emplearse en cualquier etapa, aunque normalmente no es recomendable en las primeras fases
Polaridad
Interaccin hidrofbica
Afinidad biolgica
Afinidad
TEMA 2
TCNICAS DE PURIFICACINSolucin acuosa de dos polmerosPEG y dextrano
Sistemas acuosos en dos fases:Solucin acuosa de un polmero y una salPEG y fosfato potsico Protenas hidrofbicas Protenas hidroflicas fase superior (rica en PEG) fase inferior
- Aplicaciones: separacin de restos celulares enriquecimiento para posteriores pasos de purificacin concentracin y purificacin de protenas en baja concentracin - Operacin:- Mezcla y equilibrado - separacin
Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology, 3:6 (139-144) 1985
TEMA 2
TCNICAS DE PURIFICACINDiseo de enzimas: La fusin de un gen de inters a secuencias promotoras eficientes hace que una protena se sobreexprese. Dirigir la protena sintetizada de novo al periplasma de la clula. Adicin de colas de afinidad.