PROYECTO DE GRADO FARFÁN-GUTIÉRREZ 2009 · direccionado el desarrollo del proyecto de manera...
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA DE CEPAS NATIVAS DE ACTINOMICETOS Y SU EFECTO ANTAGÓNICO SOBRE MICROORGANISMOS
FITOPATÓGENOS
DIANA MARCELA FARFÁN AYALA CAROLINA GUTIÉRREZ TRIVIÑO
APROBADO
____________________________ _____________________________ María Ximena Rodríguez Ph.D. Marcela Franco Correa Ph.D. Directora Co-Directora _____________________________ _____________________________ Balkys Quevedo. Profesor Asociado Ivonne Gutiérrez. Profesor Asistente Jurado Jurado
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA DE CEPAS NATIVAS DE ACTINOMICETOS Y SU EFECTO ANTAGÓNICO SOBRE MICROORGANISMOS
FITOPATÓGENOS
DIANA MARCELA FARFÁN AYALA CAROLINA GUTIÉRREZ TRIVIÑO
APROBADO
_____________________________ _____________________________ INGRID SCHULER JANETH ARIAS Decana Académica Directora de Carrera Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
i
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado a todos los que han aportado a nuestra formación a lo largo de la vida. A Dios por ser nuestra guía y brindarnos la fortaleza espiritual. A nuestros padres y
hermanos por su apoyo permanente, por la confianza que han depositado en nosotras y el inmenso amor que nos han dado. A nuestros amigos por los buenos consejos y enseñanzas
y a Ximena y Marcela por haber creído en nosotras hasta el final. Para ustedes, todos los frutos de esta experiencia.
ii
AGRADECIMIENTOS
MARIA XIMENA RODRÍGUEZ, Docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por haber direccionado el desarrollo del proyecto de manera permanente, por sus enseñanzas, dedicación, comprensión, paciencia, confianza y motivación.
MARCELA FRANCO CORREA, Docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por su comprensión, apoyo, explicaciones y aportes a lo largo del proceso.
A NUESTROS AMIGOS DEL LABORATORIO Yeimy Rivera, Susana Díaz, Carolina Mazo, Diana Vega, Carolina Ortiz, Andrés Hernández Y Rodrigo Muñoz, por los favores realizados y por su apoyo incondicional que permitió la culminación de este proyecto.
A Mile, Paola y Juan David, del laboratorio de aguas por su paciencia y colaboración en todos los momentos de dificultad.
GISELA, por su asesoría en los análisis estadísticos.
A INESITA Y RUCA por habernos consentido tanto y salvarnos de unas cuantas.
iii
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 3
2.1. El suelo y su composición 3
2.2. Actinomicetos 5
2.2.1. Características generales 5
2.2.2. Condiciones de crecimiento 8
2.2.3. Composición química 8
2.2.4. Aplicación industrial 10
2.3. Control Biológico 10
2.3.1. Actinomycetes como Agentes Biocontroladores 12
2.3.2. Mecanismos de antagonismo 14
2.3.3. Hongos Fitopátogenos 17
2.3.3.1. Fusarium oxysporum 17
2.3.3.2. Fusarium roseum 18
2.3.3.3. Rhizoctonia solani 18
2.4. Actividades hidrolíticas para control de hongos patógenos 19
2.4.1. Quitinasas 19
2.4.1.1. Producción de Quitinasas 23
2.4.1.2. Uso Biotecnológico de las Quitinasas 24
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 26
4. OBJETIVOS 28
5. METODOLOGÍA 29
5.1. Reconstitución de cepas de actinomicetos 29
5.2. Evaluación de actividad quitinolítica 29
iv
5.2.1. Preparación quitina coloidal 29
5.2.2. Diálisis de la quitina coloidal 30
5.2.3. Evaluación de producción de quitinasas en placa 31
5.2.3.1. Selección de cepas quitinolíticas 31
5.2.3.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad
quitinolítica 32
5.2.3.3. Determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica 32
5.3. Ensayo de la estandarización para la evaluación cuantitativa de la actividad quitinolítica 33
5.3.1. Curvas de calibración para la cuantificación de N-acetilglucosamina y proteínas 33
5.3.2. Determinación del agente precipitante de las proteínas 33
5.3.3. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la 34
actividad enzimática
5.4. Ensayo de la actividad antifúngica in vitro 37
5.5. Análisis estadístico 38
6. RESULTADOSY DISCUSIÓN 39
6.1 Reconstitución de cepas de actinomicetos 39
6.2. Evaluación de la actividad quitinolítica 41
6.2.1. Medio de cultivo 41
6.2.2. Evaluación de la producción de quitinasas en placa 41
6.2.2.1. Selección de las cepas quitinolíticas 41
6.2.2.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la
actividad quitinolítica 43
6.2.2.3. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica 44
6.3. Estandarización de la prueba para la evaluación cuantitativa de la actividad Quitinolítica 51
6.3.1. Determinación del agente precipitante de las proteínas 51
6.3.2. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la
v
actividad enzimática 53
6.4. Ensayo de actividad antifúngica in vitro 64
7. CONCLUSIONES 75
8. RECOMENDACIONES 77
9. BIBLIOGRAFÍA 79
10. ANEXOS 101
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Nª TABLA PÁG.
2.1. Tipos de paredes celulares de los actinomicetos 9
6.1. Detección de microorganismos quitinolíticos en medio mínimo
suplementado con quitina coloidal al 1% 43
6.2. Agrupamiento de Duncan para áreas bajo la curva-Área de
halo de hidrólisis para la actividad quitinolítica en placa 47
6.3. Agrupamiento de Duncan para medición de halo de
hidrólisis durante 9 días de evaluación 48
6.4. Agrupamiento de Duncan para días de medición 49
6.5. Agrupamiento Duncan para la comparación de halos de
hidrólisis de quitina por día 50
6.6. Evaluación agentes precipitantes de proteínas 51
6.7. Concentración de proteína extracto crudo Cepa 25 y Cepa Control 63
6.8. Agrupamiento Duncan de los promedios de los porcentajes de
inhibición de crecimiento radial, para Rhizoctonia sp. enfrentando
a los aislamientos de actinomicetos 66
6.9. Agrupamiento de Duncan de los promedios de los porcentajes
de inhibición de crecimiento radial, para Fusarium sp. enfrentando
a los aislamientos de actinomicetos 68
6.10. Correlación Pearson para porcentaje de inhibición de crecimiento radial para
Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. y área bajo la curva de
vii
producción de quitinasas en ensayo en placa 72
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Nª FIGURA PÁG.
2.1. Estructura molecular de la quitina 19
2.2. Reconocimiento y degradación de la quitina por microorganismos 21
quitinolíticos
5.1. Preparación quitina coloidal 30
5.2. Diálisis de la quitina coloidal 31
5.3. Montaje enfrentamiento dual actinomiceto/hongo.
A. Actinomiceto, B. Hongo fitopatógeno 38
6.1. Aspecto macroscópico cepas 7,8 y 3, crecidas en agar Avena 39
6.2. Hidrólisis de quitina coloidal en placa 43
6.3. Evaluación de la concentración de quitina cepa 4, 12 y 26. A. 0.5%,
B. 1%. C. 2% 46
6.4. Evaluación de la actividad quitinolítica semicuantitativa. A. cepa 26.
B. cepa Control. C. cepa 22 47
6.5. Inducción de quitinasas cepa 25 y Control, empleando medio
quitina coloidal y medio quitina en polvo 54
6.6. Evaluación de la actividad enzimática y específica de las cepas
Control (C) y 25 57
6.7. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para cepas
ix
de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición 66
6.8. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para
cepas de actinomicetos con los más bajos porcentajes de inhibición 67
6.9. Crecimiento libre de Rhizoctonia sp. en medio YGC 67
6.10. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas
de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición mcelial 68
6.11. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas
de actinomicetos con el más bajo porcentaje de inhibición 69
6.12. Crecimiento libre de Fusarium sp. en medio YGC 69
6.13. Técnica de enfrentamiento dual actinomiceto/hongo para la cepa
Control, A. 67.41% de inhibición micelial de Rhizoctonia sp. B. 64.17%
de inhibición micelial de Fusarium sp 69
6.14. Difusión de metabolitos secundarios en agar PDA, cepa 4 72
x
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO PÁG.
1. Aislamiento e identificación microscópica y macroscópica de cepas de
actinomicetos 101
2. Medios de cultivo 110
3. Curva Patrón para la cuantificación de azúcares reductores en términos
de N- acetilglucosamina 113
4. Curva Patrón para la cuantificación de proteínas, empleando Suero
albúmina de bovino (BSA) como proteína standard 115
5. Valores de medición en milímetros del diámetro de halos de hidrólisis en
agar quitina coloidal al 1% 117
6. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica. Análisis de
varianaza (ANOVA) 118
7. Estandarización de prueba para la evaluación cuantitativa de la
Actividad Quitinolítica 121
8. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR). Enfrentamiento cultivo
dual actinomiceto/hongo fitopatógeno 123
xi
9. Porcentaje de inhibición de crecimiento radia. Análisis de varianza (ANOVA) 124
xii
RESUMEN
El papel ecológico de los actinomicetos en la rizosfera como microorganismos antagonistas
ha generado gran interés en los últimos años. En el presente estudio se evaluó la producción
de enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas por parte de cepas nativas de actinomicetos y su
posible efecto antagónico sobre microorganismos fitopatógenos, Rhizoctonia sp. y Fusarium
sp. En primer lugar se realizó un screening a partir del banco de trabajo constituido por 23
cepas con el fin de determinar cuales presentaban actividad quitinolítica, las cepas fueron
sembradas por método de estría en medio mínimo suplementado con quitina coloidal 1% pH
6.8; 19 de las 23 cepas evaluadas mostraron zona de hidrólisis después de 5 días de
incubación a 25ºC, siendo consideradas preliminarmente como productoras de quitinasas.
Para determinar la concentración más baja de quitina que permitía una mejor visualización
de la hidrólisis enzimática, las cepas 4, 12 y 26 seleccionadas aleatoriamente fueron
sembradas en medio mínimo suplementado con tres concentraciones de quitina coloidal 0.5,
1 y 2%, la concentración de 1% fue la seleccionada para continuar con el ensayo en placa.
Para evaluar la actividad quitinolítica de las 19 cepas seleccionadas se realizó una prueba
semicuantitativa en placa; para su efecto, en medio mínimo quitina coloidal al 1% se
realizaron 4 pozos equidistantes en los cuales se adicionaron 5 µL de un inóculo a una
concentración de 107 cél·mL-1, posteriormente las placas de petri se llevaron a incubar a una
temperatura de 25 ºC por un período de 9 días. Las cepas 24 y 22 presentaron los
promedios de diámetros de halos de hidrólisis más significativos 8,13 y 7,50 mm
respectivamente, en comparación a las demás cepas en estudio; por el contario las cepas
11, 19 y 1 presentaron los promedios de diámetros de halo de hidrólisis más bajos o no
evidenciables. Las cepas control y 25 fueron seleccionadas aleatoriamente para realizar la
estandarización para la evaluación cuantitativa de la actividad quitinolítica. El medio quitina
coloidal al 0.5% demostró ser el medio más adecuado para la inducción de producción de
quitinasas después de 7 días de agitación a temperatura ambiente, encontrándose la mayor
cantidad de azúcares reductores en comparación al medio quitina en polvo al 1.5%. Las
variables temperatura (40 y 50ºC) y proporción enzima/sustrato (1:1, 1:2 y 1:4) mostraron no
generar ninguna influencia sobre la actividad enzimática y actividad enzimática específica
para las dos cepas evaluadas. Adicionalmente se evaluó el efecto que generaba la
precipitación de proteínas con acetona en el proceso de preparación de extracto enzimático,
encontrándose que ésta no concentró la enzima en la medida esperada. La máxima
actividad enzimática específica alcanzada para la cepa 25 fue de 67,944 U/g, mientras que
un valor más bajo se obtuvo para la cepa control (60, 22 U/g). Finalmente se evaluó el efecto
xiii
antagónico de 13 cepas de actinomicetos sobre Rhizoctonia sp y Fusarium sp, para ello se
realizó un enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo fitopatógeno. Las cepas
11, 7 y 4 presentaron los porcentajes de inhibición de crecimiento radial más altos para
Rhizoctonia sp. con valores de 84.44, 74.07 y 68.89% respectivamente; para el caso de
Fusarium sp, las cepas 7, 8, 16,12 y 11 generaron la mayor inhibición sobre su crecimiento
radial, en donde los PICR obtenidos fueron 86,67, 84,17, 82, 50, 80,83 y 80%
respectivamente. Se realizó una correlación entre los valores de área bajo la curva obtenidos
en la determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica y los porcentajes de
inhibición de crecimiento radial (PICR) con el fin de identificar la relación existente entre
éstas dos variables. Los resultados mostraron una correlación de -0.264 entre las variables
área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Rhizoctonia
sp. y de -0.505 entre área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de
inhibición para Fusarium sp., indicando que posiblemente en el efecto antagónico generado
también estuvieron involucrados otros mecanismos adicionales a la acción de las quitinasas.
Palabras claves: actinomicetos, quitinasas, quitina coloidal, antagonismo, fitopatógenos,
Rhizoctonia sp., Fusarium sp.
xiv
ABSTRACT
Actinomycetes ecological roll, at rhizosphere, as antagonistic microorganisms has developed
a huge interest in the last years. This study evaluated the production of hydrolytic enzymes,
chitinases, by native actinomycetes strains and their possible antagonist effect against
phytopathogens (Rhizoctonia sp. and Fusarium sp.) The first step was a screening of the
native actinomycetal strains bank, comprising 23 strains, in order to determine chitinolytic
activity. The strains were inoculated by streaking in a minimal medium supplemented with 1%
colloidal chitin (pH 6.8); 19 of 23 evaluated strains showed a hydrolysis area after 5
incubation days at 25ºC, preliminarily considering them as chitinases producers. In order to
determine the lower chitin concentration which allow the better enzymatic hydrolysis
observation, strains 4, 12 and 26, randomly selected, were inoculated in minimal media
supplemented with 0.5, 1 y 2% colloidal chitin, concentration of 1% was selected for plate
enzymatic assay. A semi quantitative plate assay was performed to test the chitinolytic
activity of the 19 selected strains; to develop this 4 wells were done on a 1% colloidal chitin
minimal medium plate and then inoculated with 5 µL of a cells suspension (107 cell·mL-1). The
plates were incubated at 25 ºC for 9 days. Strains 24 and 22 showed the most significant
hydrolysis halos (8.13 and 7.50 mm, respectively); contrarily strains 11, 19 and 1 did not
show or showed the smaller hydrolysis halos. Then, strains 25 and control were selected for
quantitative chitinolytic activity assay standardization. The higher enzyme activities were
observed with colloidal chitin (0.5%) medium extracts, after 7 days shaking at room
temperature, compared to chitin powder (1.5%) medium extracts. Variables like temperature
(40 and 50ºC) and enzyme/substrate proportion (1:1, 1:2 y 1:4) did not influence the
enzymatic activity for both strains. Additionally, the effect of acetone protein precipitation in
the enzyme extract preparation was evaluated, determining that acetone did not concentrate
proteins as expected. The maximum specific enzymatic activity was reached by strain 25 with
67.944 U/g, while control strain rendered 60.22 U/g. Finally, the antagonist effect of 13
actinomycetal strains towards Rhizoctonia sp and Fusarium sp. was evaluated by dual
cultures actinomycete/fungal phytopathogen. The highest radial growth inhibition
percentages for Rhizoctonia sp., 84.44, 74.07 and 68.89% corresponded to strains 11, 7 and
4, respectively. In the case of Fusarium sp, strains 7, 8, 16, 12 and 11 showed the maximum
inhibition percentages, 86.67, 84.17, 82.50, 80.83 and 80% respectively. A correlation test
between the area under the curve values, obtained for semi quantitative chitinolytic activity,
and radial growth inhibition percentages were performed in order to identify the correlation
between this two variables. The results showed a correlation value of -0.264 between
xv
chitinolytic activity and Rhizoctonia sp. inhibition, and -0.505 between chitinolytic activity and
Fusarium sp. inhibition, suggesting that the antagonist effect involves additional mechanism
rather than chitinases activity.
Key words: actinomycetes, chitinases, colloidal chitin, antagonisms, phytopathogens,
Rhizoctonia sp., Fusarium sp.
1
1. INTRODUCCIÓN
La rizosfera es un hábitat propicio para el desarrollo de los microorganismos. Son muchas
las poblaciones microbianas que se encuentran asociadas a esta zona del suelo. Las
interacciones entre los microorganismos del suelo y las raíces de las plantas satisfacen los
requerimientos nutritivos básicos para la planta y para las comunidades microbianas
asociadas a ellas (Atlas, 2002). La estructura del sistema radicular contribuye a establecer la
población microbiana en la rizosfera por medio de los exudados radiculares liberados; estos
exudados consisten en una amplia variedad de componentes y sustratos simples de bajo
peso molecular como azúcares, compuestos fenólicos, aminoácidos, ácidos orgánicos y
otros metabolitos secundarios, y componentes de alto peso molecular tales como proteínas
(Sullivan, 2004). Dependiendo de la naturaleza de los componentes en los exudados
radiculares, estos pueden participar en la activación de genes microbianos responsables del
reconocimiento e iniciación de la asociación simbiótica o actuando simplemente como una
fuente de nutrientes y energía para los microorganismos (Sullivan, 2004). Las interacciones
entre las raíces y los microorganismos de la rizosfera se basan principalmente en la
modificación interactiva del ambiente del suelo por procesos como captación de agua por la
planta, liberación de compuestos orgánicos al suelo por las raíces, biodegradación de la
materia orgánica, captura de nutrientes minerales por parte de los microorganismos y
producción microbiana de factores de crecimiento vegetales (Atlas, 2002).
Se han realizado diversos estudios acerca de las interacciones entre plantas y actinomicetos
(Weller, 1988; Benson y Silvester, 1993; Tanaka y Omura, 1993; Locci, 1994),
determinándose que las asociaciones entre estos microorganismos y la raíz de la planta
pueden ser deletéreas o benéficas. Mientras que algunos actinomicetos secretan
compuestos herbicidas o causan daños tales como erupciones en el tejido vegetal, otros
pueden fijar nitrógeno atmosférico simbiótica y no simbióticamente o proteger las raíces
contra las infecciones fúngicas y bacterianas (Valois et al., 1996).
Mediante microorganismos antagonistas se puede llegar a disminuir la actividad de los
patógenos causantes de enfermedades. Esto se consigue mediante la acción directa o
indirecta que ejerce el organismo biocontrolador sobre el patógeno, por medio del efecto que
genera sobre el hospedero o el ambiente donde se desarrolla, causando así una acción
significativa en la interrelación hospedero-patógeno y ambiente. Esta acción puede afectar
2
las estructuras de supervivencia del patógeno y disminuir la gravedad de la infección de éste
sobre el hospedero (Goodfellow y Williams, 1983). El parasitismo sobre hongos patógenos,
facilitado por la producción de enzimas hidrolíticas, está involucrado en el control biológico
de enfermedades fúngicas. Entre las enzimas hidrolíticas, las quitinasas son las de mayor
importancia ya que la quitina es el principal constituyente estructural de la pared celular en la
mayoría de los hongos fitopatógenos. Las quitinasas inhiben la germinación de propágulos y
la elongación del tubo germinal, adicionalmente participan lisando las hifas (Ji y Ku, 1996;
Boer et al., 1998; Kishore et al., 2005).
Las cepas biocontroladoras con una alta expresión de quitinasas, presentan una buena
actividad antifúngica; por el contrario, aquellos microorganismos deficientes en cuanto a la
producción de éstas enzimas muestran tener una actividad antifúngica pobre y una baja
habilidad en el control de la enfermedad (Kishore et al., 2005).
Esta investigación busca determinar la capacidad de cepas nativas de actinomicetos para
producir enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas. Adicionalmente pretende evaluar el efecto
antagónico de estos microorganismos sobre algunos hongos fitopatógenos, de tal manera
que en un futuro pueda ser establecida la relación existente entre las enzimas producidas y
el antagonismo generado por aquellas cepas en las cuales así sea evidenciado.
3
2. MARCO TEÓRICO
2.1. EL SUELO Y SU COMPOSICIÓN
El suelo corresponde a la parte más externa de la corteza terrestre, este puede ser
considerado como un sistema de interacción entre una fase sólida, formada por materia
mineral y orgánica, una fase líquida, y una fase gaseosa. La materia mineral se origina a
partir de las rocas del subsuelo y los procesos edáficos que hayan tenido lugar en su
formación. La materia orgánica procede de la actividad de los organismos vivos del suelo, la
composición y cantidad resulta ser variable. Este sistema complejo alberga una gran
cantidad y variedad de especies vegetales, animales y microbianas (Cavaletti et al., 2006).
Los organismos del suelo establecen relaciones entre ellos de formas variadas y complejas,
contribuyendo también a las características propias del suelo modificando las fases sólida,
líquida y gaseosa del mismo. Los microorganismos resultan ser de gran importancia pues se
relacionan con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de elementos como el
carbono, el nitrógeno, el oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros metales; fertilidad de
las plantas, protección frente a patógenos, degradación de compuestos xenobióticos, entre
otros (Nogales, 2005). Se considera que el suelo es uno de los ambientes más complejos en
cuanto a vida microbiana se refiere, éste contiene cerca de 109 células bacterianas (por
gramo) y un estimado de 104 especies microbianas distintas por gramo (Cavaletti et al.,
2006).
La rizosfera es el volumen de suelo inmediato a las raíces de las plantas. Interacciones entre
planta, suelo, microorganismos y microfauna, presentes en ésta parte del suelo, generan
una significativa influencia en el crecimiento de las plantas y por ende en el rendimiento de
los cultivos (Antoun y Prevost, 2005). En comparación a las demás partes del suelo el
número de microorganismos en la rizosfera es sustancialmente más alto debido a la
influencia de las plantas; así mismo se presentan modificaciones constantes en la
biodiversidad de los microorganismos generados por los cambios físicos, químicos o
biológicos en las raíces de las plantas o por las excreciones y desechos orgánicos
producidos por éstas (Antoun y Prevost, 2005).
4
Los rizodepósitos de varios exudados, tejidos muertos y raíces en senescencia proveen un
sustrato importante para la comunidad microbiana del suelo generándose un complejo en el
que se relaciona la comunidad con la cantidad y tipo de compuestos liberados. No solo los
rizodepósitos son rápidamente utilizados por los microorganismos, la adición de éstos al
suelo puede también acelerar la descomposición de materia orgánica en el suelo. (Gregory,
2006).
La rizodeposición genera una rizosfera con diferentes niveles y tipos de sustratos
microbianos en comparación al resto del suelo. Esto resulta en una rizosfera que contiene
diferentes poblaciones de bacterias, actinomicetos, hongos, protozoos, virus y nematodos
(Gregory, 2006).
Las raíces liberan un amplio rango de componentes orgánicos, aunque los azúcares y
polisacáridos, ácidos orgánicos y aminoácidos, péptidos y proteínas constituyen la mayor
parte de los rizodepósitos, gran parte de la investigación ha demostrado que otros
compuestos liberados por las raíces pueden actuar como mensajeros que comunican e
inician las interacciones raíz-raíz, raíz-microorganismo y raíz-fauna (Walker et al., 2003). Las
interacciones raíz-microorganismo y raíz-insecto pueden ser positivas (simbióticas) o
negativas para la planta; ellas involucran intercambio y percepción de señales, seguido por
la invasión de la planta por el microorganismo o insecto y cambios estructurales resultantes
de la interacción (Fray, 2002).
Las raíces de las plantas también pueden liberar compuestos que son capaces de
interrumpir la comunicación con las bacterias, reduciendo así su susceptibilidad a la
infección (Fray, 2002). Las bacterias de la rizosfera o rizobacterias se multiplican y colonizan
rápidamente las raíces de las plantas, así como todos los nichos ecológicos que se
desarrollan durante las etapas del crecimiento de éstas. La presencia de estas bacterias en
las raíces puede generar un efecto neutral, benéfico o perjudicial en su desarrollo. Algunas
rizobacterias pueden ocasionar efectos adversos como la producción de fitotoxinas,
descenso de nutrientes disponibles o la inhibición del proceso de micorrización. Por otro
lado, estas bacterias pueden estimular el crecimiento de la planta empleando diferentes
mecanismos como la fijación de nitrógeno atmosférico, la síntesis de hormonas vegetales, la
solubilización de minerales y la síntesis de enzimas. Estas bacterias pueden también
generar modificaciones en la pared celular vegetal dando lugar a cambios bioquímicos y
5
fisiológicos en las plantas; adicionalmente se encuentran involucradas en los mecanismos
de defensa de éstas, pudiéndose generar interacciones entre rizobacterias y patógenos,
rizobacterias y planta y/o rizobacterias y rizosfera (Siddiqui, 2005).
2.2. ACTINOMICETOS
Los actinomicetos representan un grupo ubicuo de microorganismos ampliamente distribuido
en ecosistemas naturales y presentan gran importancia por su participación en la
degradación de materia orgánica (Ghanem et al., 2000). Estos microorganismos resultan ser
abundantes en suelos, sin embargo, también son encontrados en ambientes acuáticos,
dulces y marinos (Leiva et al., 2004), dentro de sus características particulares presentan un
olor típico a suelo húmedo, debido a su actividad metabólica y a la producción de
terpenoides, pigmentos y enzimas extracelulares con las que son capaces de degradar
materia orgánica de origen vegetal y animal (Ezziyyani et al., 2004).
2.2.1. Características generales
Los actinomicetos constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos; son bacterias
Gram positivas que se caracterizan por formar filamentos ramificados. El orden de los
Actinomicetales comprende 63 géneros constituyendo, aproximadamente del 20-60% de la
población microbiana del suelo (Ezziyyani et al., 2004).
En la actualidad, los actinomicetos se encuentran incluidos en el domino bacteria debido a
varias razones: la pared celular está compuesta por peptidoglucano y no por quitina o
celulosa, son sensibles a los antimicrobianos pero presentan resistencia a los antifúngicos y
la disposición de su material genético es típicamente procariótica (Salazar et al., 1997),
aunque se caracterizan por presentar un alto contenido de guanina y citosina en su ADN,
siendo éste superior al 55%. Estas bacterias son aerobias y anaerobias, pudiéndose
encontrar en animales o en el hombre; son heterótrofas, por lo cual pueden utilizar fuentes
de carbono simples, complejas y compuestos moleculares orgánicos tales como ácidos,
azúcares, polisacáridos, lípidos, proteínas e hidrocarburos alifáticos. Utilizan como fuentes
6
de nitrógeno amonio, nitratos, aminoácidos, peptonas y un gran número de proteínas
(Leveau y Bouix, 2000).
El ciclo de vida de los actinomicetos comprende cuatro importantes procesos fisiológicos:
crecimiento vegetativo, diferenciación, senescencia celular y muerte. Estas bacterias tienen
la capacidad de formar filamentos ramificados en alguna de sus etapas de crecimiento,
atributo que permite diferenciarlas de otras bacterias Gram positivas (Goodfellow y Williams,
1983). En un ciclo típico de crecimiento, las esporas se convierten en largas hifas
filamentosas que crecen dentro y encima de la superficie de nutrientes; las hifas se van
ramificando y se da paso a la aparición de un micelio que se forma gradualmente. Esta fase
es conocida como una fase vegetativa de crecimiento; el crecimiento filamentoso de los
actinomicetos se encuentra fuertemente condicionado por las propiedades elásticas de las
paredes celulares y las propiedades físicas medioambientales. La fase vegetativa está
seguida por una segunda fase de crecimiento aéreo la cual puede estar acompañada por la
generación de antibióticos, en donde se genera una elongación de hifas constituyendo
estructuras helicoidales, y una división final formando esporas, las cuales dan de nuevo
origen al ciclo de crecimiento vegetativo (Goriely y Tabor, 2002). El crecimiento de los
actinomicetos es más lento en comparación a otras bacterias, el tiempo de multiplicación en
un cultivo oscila entre 2 y 3 horas. Ciertas bacterias como Mycobacterium tuberculosis
poseen un desarrollo aún mas lento, con tiempos de generación superiores a 15 horas
(Leveau y Bouix, 2000).
La diversidad morfológica de estos microorganismos varía desde formas cocoides o
bacilares hasta la formación de un micelio bien desarrollado, así mismo algunos géneros
pueden formar un micelio complejo generador de esporas envueltas en un esporangio, razón
por la cual estas bacterias desarrollan sobre un medio sólido una masa de hifas que
comprenden el micelio de sustrato y el micelio aéreo. La apariencia correosa y pulverulenta
de las colonias se debe a la producción de los conidios o esporas. Los actinomicetos se
asemejan a las bacterias por el contenido de peptidoglicano en su pared celular, siendo
sensibles a la lisozima, y por poseer flagelos similares al bacteriano, los actinomicetos
difieren de los hongos en la composición de la pared celular, al no poseer quitina ni celulosa,
polisacáridos presentes en dicha estructura (Titus y Pereira,2007; Leveau y Bouix, 2000); los
azúcares presentes en la pared celular de los actinomicetos son Madurosa, Arabinosa y
Galactosa (Hidrin et al., 2001).
7
Los actinomicetos abarcan una gran proporción de la biomasa microbiana presente en el
suelo, exceptuando aquellos que presentan condiciones extremas, por esta razón éste
resulta una fuente predominante de aislamiento; sin embargo, la disponibilidad de nutrientes
constituye un factor que controla su desarrollo (Goodfellow y Williams, 1983). La mayoría de
los actinomicetos usualmente aislados del suelo pertenecen al género Streptomyces, ya que
son los géneros que crecen fácilmente en medios sintéticos, caracterizándolos como los más
comunes del suelo. Éstos han sido ampliamente estudiados por la industria farmacéutica
debido a su habilidad para producir antibióticos (Goriely y Tabor, 2002). Las bacterias del
género Streptomyces son aerobias estrictas, catalasa positivas y, no se colorean como
ácido-alcohol-resistentes con la coloración de Ziehl-Neelsen, crecen en la superficie de
medios simples o complejos (medios de Sabouraud, Bennett, Lowenstein-Jensen), formando
filamentos ramificados (hifas) aéreos, que poseen cadenas de conidias que no se
fragmentan. Sólo Streptomyces, Nocardia, Actinomadura y Nocardiopsis forman micelios
aéreos en los cultivos (Hidrin et al., 2001). Los cultivos muestran su crecimiento entre dos y
diez días de incubación a una temperatura de 25ºC, aunque algunos pueden llegar a
desarrollarse entre los 27 y 30ºC, y algunos termófilos entre los 45–55ºC, los cuales resultan
ser muy importantes en la transformación de diversos residuos orgánicos en el proceso de
compostaje. Las colonias presentan aspecto ceroso, pulvurulento, de color blanco grisáceo,
común en la mayoría de los Streptomyces, variando de color crema a negro, como sucede
con S. somaliensis; sin embargo, estos aspectos no son específicos, y dependen de las
condiciones de cultivo (Hidrin et al., 2001); cabe resaltar que éstos géneros en particular
presentan una esporulación significativa en comparación con otros actinomicetos (Titus y
Pereira, 2007; Park et al., 2002).
La presencia de estas bacterias filamentosas y demás microflora del suelo genera una
importante influencia en la fertilidad de éste y en la salud de la planta participando en el
crecimiento de ésta e incrementando el área de absorción superficial de sus sistemas
radiculares. Los microorganismos del suelo, especialmente aquellos capaces de colonizar la
rizosfera ayudan a las plantas en la toma de nutrientes altamente vitales, tales como fósforo,
nitrógeno y potasio a partir del suelo; siendo así como la productividad y sostenibilidad de los
sistemas agrícolas resultan ser dependientes de los procesos funcionales de las
comunidades microbianas del suelo (Johansson et al., 2004; Ikeda et al., 2006).
2.2.2. Condiciones de crecimiento
8
La adición de materia orgánica a los suelos estimula la multiplicación y actividad de los
actinomicetos. Los suelos alcalinos y neutros resultan ser más favorables para el desarrollo
de estas bacterias; el rango de pH óptimo para las actividades de estos microorganismos se
encuentra entre 6.5 y 8.0. Los actinomicetos al ser principalmente aerobios se desarrollan
favorablemente en suelos bien aireados; suelos con humedades entre el 80 y el 90% son
perjudiciales para el crecimiento de los actinomicetos. El porcentaje de actinomicetos en la
población total microbiana incrementa en la profundidad del suelo, sin embargo pueden ser
encontrados en la superficie de éste. Los géneros Streptomyces, Nocardia, y
Micromonospora se encuentran frecuentemente como habitantes del suelo (Titus y Pereira,
2007).
2.2.3. Composición química
Las células de los actinomicetos químicamente están compuestas por un 45% de carbono y
un 10% de nitrógeno, el contenido lipídico varía de un 12 a un 65% (Titus y Pereira, 2007).
Su pared celular difiere químicamente según los grupos, dando paso a la identificación y
clasificación de los mismos; básicamente se diferencian siete tipos de pared celular,
teniendo en cuenta el aminoácido diaminado, los azúcares característicos y la presencia de
glicina en el puente interpeptídico (Tabla 2.1).
9
TIPOS DE PARED
CELULAR
AMINOÁCIDO DIAMINADO
AZÚCARES CARACTERÍSTICOS
GLICINA EN EL PUENTE
INTERPEPTÍDICO
MICROORGANISMOS REPRESENTATIVO
I L-DAP NA + Streptomyces
Intrasporangium
II m-DAP NA + Actinoplanes
Micromonospora
III m-DAP Madurosa - Microbispora, Frankia
IV m-DAP Arabinosa, Galactosa - Corynebacterium
Nocardia
V N.A. NA - Actinomyces israelii
VI N.A. Galactosa - Oerskovia turbata
Cellulomonas
VII DAB NA + Agromyces
NA (no aplicable, o bien no se detecta un azúcar diferencial); DAB (Ácido diaminobutírico); DAP (Ácido diaminopimélico).
Tabla 2.1. Tipos de paredes celulares de los Actinomicetos (Serrano y Sandoval, 2008; Duque y Quintana,
2008).
Algunas especies presentan hexosamina en la pared celular en un 2 a un 18%.
Adicionalmente especies como Streptomyces y Nocardia contienen alanina, metionina,
valina, arginina, lisina, leucina, hexosamina, isoleucina, ácido glutámico, treonina y
asparagina (Titus y Pereira,2007). De igual manera se presentan diversos tipos de
peptidoglucano que se clasifican de acuerdo al tipo de aminoácido ubicado en la posición 3
de la cadena lateral del tetrapéptido, a la posición del puente entre dos cadenas vecinas
(posición 3 y 4 para peptidoglucano tipo A y 2 y 4 para peptidolucano tipo B) y al tipo de
péptido presente en la cadena interpeptídica (Serrano y Sandoval, 2008).
2.2.4. Aplicación industrial
10
Los actinomicetos son cuantitativa y cualitativamente importantes en la rizosfera, pueden
influir en el crecimiento de las plantas y la protección de sus raíces contra la invasión por
hongos patógenos. Adicionalmente éstos pueden participar en la formación de micorrizas, y
en la producción de compuestos herbicidas e insecticidas (Crawford et al, 1993).
Los actinomicetos participan principalmente en procesos de degradación de materia
orgánica, incluyendo lignina y quitina, así como en la formación y estabilización de pilas de
compostaje y humus (Titus y Pereira, 2007). Además de la función ecológica de los
actinomicetos, estos microorganismos son de suma importancia debido a que han
demostrado ser la fuente más importante de metabolitos secundarios bioactivos de valor
industrial y comercial (Ezziyyani et al., 2004).
Los antibióticos constituyen la aplicación industrial más importante de los actinomicetos.
Éstas moléculas de origen natural manifiestan, a bajas concentraciones, actividades
biológicas con efecto antibacteriano, antifúngico, anticanceroso, antiviral o antiparasitario.
Adicionalmente, estas bacterias tienen la capacidad de sintetizar enzimas hidrolasas
extracelulares que permiten la descomposición de la materia orgánica o la degradación de
las paredes de hongos o plantas (Leveau y Bouix, 2000). Los actinomicetos son
considerados como los principales organismos involucrados en la producción de quitinasas y
en consecuencia en la descomposición de la quitina en el suelo; teniendo en cuenta que la
quitina es un componente significativo de la pared celular de la mayoría de los hongos,
resulta lógico asumir que los actinomicetos pueden atacar las hifas y esporas de los hongos,
pudiendo ser considerados como potenciales agentes de control biológico (Ames, 1989).
2.3. CONTROL BIOLÓGICO
Las enfermedades de las plantas causadas por hongos son una de las mayores
preocupaciones en el campo de la agricultura. En el suelo se encuentran diversos hongos
patógenos tales como Pythium, Fusarium, Rhizoctonia y Phytophthora, los cuales atacan
cultivos de importancia económica ya sea atacando la raíz o las semillas antes de la
germinación o posterior a que dicho proceso germinativo se haya llevado a cabo, resultando
en grandes pérdidas monetarias. Muchos microorganismos quitinolíticos poseen la habilidad
de controlar hongos fitopatógenos pero en ciertos casos no resultan ser satisfactorios, entre
11
otras razones, por causas ambientales. Es entonces como surge la necesidad de encontrar
cepas altamente quitinolíticas que contribuyan al desarrollo de un agente biocontrolador
potencial (Gohel et al., 2006).
La ecología microbiana se ha ido convirtiendo en una alternativa biológica para el control de
plagas de plantas. El control biológico se encuentra dividido en efectos directos e indirectos,
en los efectos directos se presenta competencia por nutrientes o por espacio, producción de
enzimas líticas, antibióticos y parasitismo. Cuando se generan cambios biológicos y
bioquímicos en las plantas tales como tolerancia al estrés y mayor adsorción de nutrientes
inorgánicos, el control biológico está dado por efectos indirectos los cuales incrementan
resistencia por parte de la planta ante el patógeno (Gohel et al., 2006).
El uso de agentes químicos para el control de patógenos ha mostrado problemas como por
ejemplo la resistencia que la cepa patógena puede llegar a adquirir, con el fin de reducir el
uso de éstos se ha estudiado el control biológico en plantas para el tratamiento de
enfermedades causadas por fitopatógenos (Compant et al., 2005). Según Weller (1988), los
microorganismos que colonizan la rizosfera son ideales para ser utilizados como agentes
para el control biológico contra las enfermedades transmitidas por el suelo. La habilidad del
microorganismo control para mantener una densidad poblacional suficiente en la rizosfera
por un largo periodo de tiempo es crítico para el éxito del método de biocontrol (Getha et al.,
2005).
Para determinar si un microorganismo puede ser empleado como agente biocontrolador se
deben tener en cuenta características tales como: competencia significativa en la rizosfera,
mantener in-situ un tamaño poblacional considerable, colonización rápida de la raíz,
capacidad de antagonizar patógenos de rápido crecimiento y producción estable de agentes
antifúngicos (Neiendam et al., 1998). Un agente ideal de control biológico de hongos
patógenos generadores de síntomas infecciosos en la raíz de las plantas debe mostrar una
suficiente actividad antagónica en la rizosfera y ser capaz de reducir significativamente la
enfermedad (Yuan y Crawford, 1995).
Actualmente el biocontrol ya es considerado como una de las prácticas de manejo de
enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos del suelo, principalmente
de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium, Phytophthora y Fusarium entre otros. En la
12
lucha por la erradicación de dichas especies, resulta importante la selección de potenciales
bioantagonistas que puedan ser utilizados como controladores biológicos para lo cual es
necesario realizar ensayos in vitro que generen una orientación respecto a su capacidad
antagónica y permitan que posteriormente puedan ser formulados y utilizados en pruebas de
campo (Duñabeitia et al., 2007). La búsqueda de microorganismos nativos puede ser eficaz
en el control biológico de fitopatógenos y una alternativa principal a la utilización de
productos químicos (Ezziyyani et al., 2004).
2.3.1. Actinomicetos como agentes biocontroladores
Los actinomicetos se caracterizan por producir enzimas con actividad antimicrobiana,
aspecto que ha sido evaluado en relación al biocontrol de fitopatógenos (Crawford et al.,
1993; Anderson y Wellington, 2001; Park et al., 2002). El parasitismo de los hongos
patógenos, facilitado por la producción de enzimas hidrolíticas, está involucrado en el control
biológico de enfermedades fúngicas. Entre las enzimas hidrolíticas, las quitinasas son de
suma importancia teniendo en cuenta que la quitina es el mayor constituyente de la pared
celular en la mayoría de los hongos fitopatógenos. Las quitinasas inhiben la germinación de
las esporas fúngicas y la elongación del tubo germinal, y lisan los tipos hifales (Kishore et al.,
2005). Hasta la fecha se sabe que varios antifúngicos activos contra hongos patógenos se
han aislado y caracterizado a partir de cepas de Streptomyces sp (Aizawa et al., 1982; Kim
et al., 1999; Hwang et al., 2001; Rodríguez et al., 2002; Remsing et al., 2003).
Varias cepas de Streptomyces sp han mostrado suprimir el crecimiento de fitopatógenos in
vitro, muchos de sus metabolitos han sido usados para inhibir el crecimiento de éstos
patógenos in vivo, algunos de estos metabolitos incluyen macrólidos, benzoquinonas,
aminoglucósidos entre otros. De igual forma, enzimas extracelulares como quitinasas y β-
1,3- glucanasas desempeñan una significativa función en la actividad antifúngica y
biocontroladora, siendo posiblemente responsables del micoparasitismo potencial ejercido
por algunas cepas de Streptomyces sp. y la supresión de enfermedades de las plantas, que
se observa cuando el suelo es modificado, siendo suplementado con pared celular fúngica,
quitina y/o laminarina (González et al., 2003). Estudios de Streptomyces sp. han reportado la
capacidad que tienen los microorganismos de esta especie para generar efecto antagónico y
control sobre una amplia gama de enfermedades de las plantas, en su gran mayoría
generada por compuestos de origen antibiótico y no enzimático. En la década de los años
13
50´s Pridham y colaboradores reportaron la represión de al menos una enfermedad
generada en plantas tratadas en invernadero por 9 de los 10 metabolitos secretados por
Streptomyces sp. Así mismo, Reddi y Rao (1971) reportaron el control de Pythium y
especies de Fusarium nativas, patógenos de plantas de tomate y algodón respectivamente
en suelos infestados artificialmente. Otros estudios muestran la represión del desarrollo de
estos fitopatógenos empleando Streptomyces sp en forma de esporas y micelios o
combinación de los dos (Yuan y Crawford, 1995).
La adición de quitina al suelo ha sido estudiada como un posible método para el control de
hongos patógenos. El suplemento del suelo con quitina puede facilitar el incremento en el
número de organismos quitinolíticos que podrían degradar la quitina de la pared celular de
los hongos, conllevando a la supresión de los patógenos. Otra posibilidad es usar los
actinomicetos directamente como productores de quitinasas actuando contra la pared celular
de los patógenos fúngicos (Gomes, 1999).
Se han realizado estudios que determinan el efecto de microorganismos quitinolíticos
aislados de la rizosfera y del suelo no rizosférico sobre el desarrollo de hongos patógenos,
determinándose que los microorganismos rizosféricos presentan mayor actividad quitinolítica
en comparación a los no rizosféricos. Streptomyces violaceusniger, microorganismo
asociado la rizosfera de Paraserianthes falcataria, ha demostrado antagonismo frente a
hongos fitopatógenos tales como Pythium sp., Phytophthora sp. y Fusarium sp.; esto ha
permitido determinar que existen diferencias en el perfil de las quitinasas basado en el
hábitat a partir del cual fueron aislados (Trejo et al., 1998; Sembiring et al., 2000).
En el mar se encuentra acumulada una alta proporción de quitina, presumiendo que la
mayoría de bacterias marinas tienen la capacidad de degradar este polímero, sin embargo
estudios han reportado que son pocas las bacterias marinas capaces de hidrolizarlo (0,4-
19%). El uso de enzimas quitinolíticas presenta gran importancia en la industria de comida
de mar, de ahí los numerosos estudios en donde se comparan las enzimas derivadas de
organismos terrestres con las de origen marino, mostrando que éstas últimas presentan una
mayor tolerancia a condiciones altas de salinidad y pH, presentando un posible potencial
biotecnológico (Han et al., 2008).
14
La actividad de los actinomicetos como patógenos de humanos, animales y plantas ha sido
más que compensada por los beneficios que éstos tienen en el suelo, tales como
antagonistas de patógenos en plantas, estimuladores de crecimiento vegetal, productores de
biocidas, productores de antibióticos e hiperparásitos de hongos. Los actinomicetos han
desempeñado un importante papel en el control de los fitopatógenos, sin embargo han
recibido poca atención como agentes de control biológico de nemátodos y parásitos de
plantas (Park et al., 2002).
Estos microorganismos son de suma importancia en la rizosfera, en la medida en que
pueden influir sobre el crecimiento vegetal y proteger las raíces de las plantas contra la
invasión de hongos patógenos (Crawford et al., 1993). Además de la función ecológica, los
actinomicetos han demostrando ser la fuente más importante de metabolitos secundarios
bioactivos de valor industrial y comercial. Estos microorganismos se encuentran entre los
agentes biocontroladores más estudiados, especialmente aquellos pertenecientes al género
Streptomyces sp., los cuales se conocen ampliamente por la capacidad de producir
antibióticos y compuestos bioactivos que participan en el control de patógenos de las plantas
(Goodfellow y Williams, 1983; Fermino et al., 2006). Diferentes especies de Streptomyces
han sido estudiadas extensivamente como potenciales agentes controladores contra hongos
fitopatógenos tales como Pythium ultimum, Fusarium oxysporum, Sclerotinia homeocarpa,
Phytophthora fragariae, Phytophthora infestans y Verticillium dahliae (Franco-Correa, 1999;
Getha et al., 2005).
Los actinomicetos al producir metabolitos secundarios biológicamente activos, tales como
quitinasas, son agentes prometedores en el biocontrol de hongos patógenos de plantas
(Ezziyyani et al., 2004).
2.3.2. Mecanismos de antagonismo
Los métodos de biocontrol se han puesto en práctica para tratar enfermedades causadas en
las plantas por los patógenos presentes en el suelo; por ésta razón el suelo representa una
fuente óptima para el aislamiento de microorganismos con actividad antagónica, los cuales
pueden ser empleados como agentes de control (Goodfellow y Williams, 1983).
15
Entre los mecanismos de acción que utilizan los microorganismos antagonistas para el
control biológico se encuentran: antibiosis, competencia, parasitismo, lisis celular y
resistencia inducida en el hospedero. Diversos investigadores citan a las quitinasas,
glucanasas y proteasas como enzimas involucradas en el control biológico de fitopatógenos
(Nuero, 1995; Aceves et al., 2005).
La antibiosis es el fenómeno mediante el cual un organismo antagonista inhibe o destruye a
otro organismo por medio de la producción metabólica de pequeñas moléculas tóxicas
volátiles y de enzimas líticas, las cuales disuelven o dañan polímeros estructurales, como
quitina y β- 1,3- glucanos de la pared celular en la mayoría de los hongos fitopatógenos,
produciendo un efecto adverso sobre su desarrollo, actividad metabólica y diferenciación.
Entre mayor sea la cantidad de productos metabólicos, el poder antagónico se incrementa
(Aceves et al., 2005). En la antibiosis no se requiere contacto directo entre el
microorganismo antagonista y el patógeno, debido a que el efecto negativo que se está
ejerciendo es generado por la molécula de antibiótico, razón por la cual la inhibición del
crecimiento del fitopatógeno puede continuar incluso después de la muerte del antagonista;
por el contrario el parasitismo involucra un contacto directo entre el hospedero y el parásito,
éste último sustrae todos los nutrientes necesarios para su desarrollo a partir del hospedero
e involucra la producción de enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular del
hospedero (Di Pietro et al., 1993; Nuero, 1995).
La lisis celular, genera la degradación enzimática total o parcial de la pared celular del
patógeno. La actividad de las enzimas quitinasas y β-1,3-glucanasas se encuentran
involucradas en la hidrólisis de la pared celular fúngica, causando la inhibición de
crecimiento microbiano. Así mismo, las plantas también pueden sintetizar enzimas
hidrolíticas, las cuales pueden ser inducidas por el ataque de hongos fitopatógenos o por la
presencia de sustancias químicas como el etileno. Los hongos también secretan de manera
constitutiva o inducida, enzimas de éste tipo generando la hidrólisis de la pared celular de
otros hongos o de su propia pared cuando en medio de cultivo estas se encuentran como
única fuente de carbono. Actualmente, Trichoderma sp. es uno de los pocos agentes
antagonistas que se encuentra disponible comercialmente para el biocontrol de patógenos
en el suelo, se ha reportado que este género produce quitinasas y β-1,3-glucanasas que
inhiben el crecimiento de Fusarium oxisporum f.sp. radicis-lycopersici y Rhizoctonia solani en
16
medios de cultivo que contienen las paredes de éstos microorganismos como única fuente
de carbono disponible (Nuero, 1995).
La liberación de enzimas extracelulares como quitinasas y β- glucanasas por parte de
algunos microorganismos hace parte de un mecanismo de defensa contra patógenos como
hongos ya que éstas degradan polímeros estructurales como quitina y glucano
respectivamente, presentes en la pared celular de estos organismos, actuando como
agentes de protección (Gomes et al., 2000). Estas enzimas han mostrado ejercer un
significativo control biológico, por este motivo algunas estrategias suponen la expresión de
los genes que codifican para estas enzimas en plantas, para así aumentar y/o reforzar la
defensa primaria ante un ataque de patógenos, suprimiendo la colonización del tejido
vegetal. La expresión de estos genes conduce a una más rápida interacción y neutralización
de los fitopatógenos (Gohel et al., 2006).
Adicionalmente, entre los mecanismos de acción que impiden la infección de la planta por el
patógeno se encuentran la competencia y la inducción de resistencia sistémica en la planta.
Los saprofitos compiten por los nutrientes disponibles en la rizosfera mientras que los
patógenos lo hacen por zonas de infección en la raíz. Mediante la resistencia sistémica se
induce una respuesta de defensa en la planta por agentes bióticos o abióticos, la raíz puede
ser colonizada por microorganismos que desencadenan una cascada de reacciones de
defensa contra el patógeno (Larkin y Fravel, 1999).
Los actinomicetos tienen la capacidad de producir una amplia variedad de hidrolasas
extracelulares que les otorga un importante papel en la descomposición de la materia
orgánica en el suelo. Adicional a su función activa en la descomposición, los actinomicetos
parecen tener importancia entre la flora microbiana de la rizosfera (Valois et al., 1996).
El antagonismo de los actinomicetos contra hongos ha sido demostrado para una amplia
variedad de patógenos de plantas, tales como Alternaria, Rhizoctonia, Verticillum, Fusarium
y Macrophomina sp. Además, los actinomicetos del género Streptomyces han sido usados
comercialmente para el control de los daños en plantas. Por ejemplo, la cepa 5406 de
Streptomyces sp. ha sido usada en China por mas de 30 años para proteger los cultivos de
algodón de patógenos del suelo (Valois et al., 1996). Adicionalmente, Lahdenpera y
17
colaboradores (1991) desarrollaron un biofungicida que contiene células de Streptomyces
griseoviridis para proteger los cultivos contra infecciones de Fusarium y Alternaria. Por otro
lado, estudios han reportado que Streptomyces sioyaensis exhibe antagonismo contra varios
hongos patógenos como Pythium aphanidermatum, Colletotrichum higginsianum,
Acremonium lactucum y Fusarium oxysporum (Hong et al., 2002).
2.3.3. Hongos fitopatógenos
2.3.3.1. Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum es un hongo que se presenta principalmente como saprófito en el
suelo, o como patógeno especializado, siendo capaz de generar enfermedad a un amplio
rango de hospederos. Entre los síntomas generados en la planta por este fitopatógeno se
encuentra el amarillamiento parcial de las hojas y el doblamiento de los brotes hacia el lado
de la planta enferma, así mismo se presentan fenómenos de enanismo y disminución del
crecimiento por parte de la planta. Los síntomas avanzan lentamente de manera ascendente
hasta causar un marchitamiento generalizado y en consecuencia la muerte. Fusarium
oxysporum penetra la epidermis de la raíz, la corteza y la endodermis, entra a los vasos del
xilema, colonizando el sistema vascular e interfiere en la capacidad de la planta para adquirir
agua y nutrientes (Garcés de Granada et al., 2001; Sastoque, 2006).
En agar papa dextrosa Fusarium oxysporum presenta un crecimiento rápido a 25ºC,
macroscópicamente se puede evidenciar un micelio aéreo abundante, algodonoso y con
pigmentación que varía de blanco a rosa durazno y generalmente un pigmento púrpura o
violeta más intenso al reverso de la colonia. Este hongo se caracteriza por producir tres tipos
de propágulos: microconidias, macroconidias y clamidosporas; estas últimas tienen paredes
muy gruesas, lo cual las hace muy resistentes a condiciones ambientales desfavorables y a
la ausencia de hospedantes (Garcés de Granada et al., 2001; Sastoque, 2006).
2.3.3.2. Fusarium roseum
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Fusarium roseum es un fitopatógeno que se puede evidenciar en plantas jóvenes y se
manifiesta como una podredumbre rosada o violácea desde la base del esqueje hasta el
segundo nudo de la planta de clavel. Las lesiones que se manifiestan de color café rojizas se
van extendiendo a partir de los tejidos infectados de manera ascendente hasta llegar a la
base de la planta, la decoloración vascular de la planta a diferencia de la generada por
Fusarium oxysporum solo se presenta en la zona inmediatamente cercana a los tejidos
podridos (Sastoque, 2006).
2.3.3.3. Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani es uno de los hongos más importantes reconocido como patógeno de
plantas, provocando la pudrición de raíces y órganos subterráneos y aéreos. Se caracteriza
por producir basidiosporas y no producir esporas asexuales (conidios). Es un hongo de
hábito saprófito, aunque en algunos casos puede formar micorrizas sobre orquídeas u otras
plantas. Presenta pigmentación hifal dematiácea, estrechamiento de hifa y formación de
septos doliporos a una distancia corta del ápice a la ramificación de la hifa y células
multinucleadas en la hifa vegetativa joven. Macroscópicamente las colonias jóvenes de éste
hongo se caracterizan por ser blancas, algodonosas adheridas al medio de cultivo, aunque
dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o amarillentas. Al producirse
la maduración, la colonia puede tomar una coloración marrón.
Rhizoctonia solani se caracteriza por ser un buen competidor capaz de colonizar diferentes
sustratos y tolerar cambios amplios de ambiente, éstas características favorecen su
supervivencia y su acción patogénica sobre tejidos juveniles vegetales. Este fitopatógeno
ocasiona pérdidas importantes en plantas perennes y anuales, incluyendo la mayoría de los
cultivos hortícolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. El damping-off o caída de las
plántulas es una de las enfermedades más conocidas, que a través de un estrangulamiento
ocasiona necrosis del tallo a nivel de cuello en plántulas recién emergidas. Adicionalmente,
este hongo es causante de una reducción en el vigor de las plantas y en la producción de
tubérculos en cultivos de papa (Tovar, 2008).
2.4. ACTIVIDADES HIDROLÍTICAS PARA CONTROL DE HONGOS PATÓGENOS
19
2.4.1. Quitinasas
La quitina es un homopolímero formado por residuos de N-acetil-D-Glucosamina con enlaces
β-1,4. Su estructura es similar a la de la celulosa exceptuando que el grupo hidroxilo (-OH),
presente en el carbono dos de la celulosa, es reemplazado por un grupo acetamida
(NH.CO.CH3) en la estructura de la quitina (Figura 2.1.). Este polímero es el recurso
renovable más abundante después de la celulosa. Se encuentra ampliamente distribuido en
la naturaleza como un componente estructural de hongos (22% - 44%), insectos y
crustáceos (25% - 58%) y protozoos (Hoster et al; 2005, Mukherjee y Sen, 2006;
Bhattacharya et al., 2007).
Figura 2.1. Estructura molecular de la quitina (Fuente: Sabry, 1992).
La quitina y sus derivados presentan un especial interés por encontrarse involucrados en
diferentes actividades biológicas como inmunoadjuvantes, floculantes de lodos en aguas
residuales y disminución del uso de agroquímicos. El uso comercial de ésta se centra en la
necesidad de desarrollar soluciones enzimáticas de quitinasas estables y de bajo costo.
Los residuos de mariscos han reportado ser una adecuada fuente de quitina, lo cual
promueve aún más el valor económico de los productos marinos (Wang y Chang, 1997). Se
ha demostrado que oligómeros de quitina y el quitosano (quitina con baja acetilación) tienen
actividades antitumorales, inmunoreguladoras, antibacterianas y antifúngicas (Guo et al.,
2004). La pesca comercial de crustáceos y su proceso subsiguiente, generan grandes
cantidades de residuos que pueden ser un problema ambiental si no son tratados de la
20
manera adecuada. Estos residuos pueden ser aprovechados por medio de métodos
biológicos ó químicos, desarrollando procesos que involucren la hidrólisis enzimática del
polímero (Sastoque et al., 2007).
El proceso biológico es llevado a cabo mediante la acción de quitinasas, hidrolizando el
enlace glucosídico β1-4 (Sastoque et al., 2007). La quitina es hidrolizada por un complejo
quitinasa que comprende tres enzimas: exoquitinasa, endoquitinasa y β-N-
acetilglucosaminidasa. La primera hidroliza el extremo no reductor de la cadena de quitina;
la segunda cliva los enlaces internos β- 1,4 glicosídicos de N-acetilglucosamina y la última
hidroliza unidades secuenciales de N-acetilglucosamina en el extremo no reductor del
sustrato. El clivaje enzimático que realizan las quitinasas se lleva a cabo aleatoriamente en
la naturaleza en toda la estructura del polímero, esto genera la liberación de compuestos
solubles de bajo peso molecular de N-acetilglucosamina como quitotetraosa, quitotriosa,
quitobiosa y pequeños oligosacáridos los cuales resultan ser los más predominantes y
pueden ser utilizados como sustrato por la β-N-acetilglucosaminidasa. El microorganismo
quitinolítico reconoce la quitina por colisión aleatoria u otro mecanismo; la degradación de
este polímero se lleva a cabo por la acción del complejo quitinolítico extracelular,
generándose oligosacáridos que pueden entrar a la célula a través de la zona
periplasmática. Estos oligosacáridos posteriormente son degradados a residuos de N-
acetilglucosamina, los cuales son trasportados al citoplasma mediante la vía del fosfoenol-
piruvato empleando el sistema N-acetilglucosamina fosfotransferasa. Finalmente la N-
acetilglucosamina fosfato sufre una conversión en dos pasos, en el primero de ellos pierde
su grupo acetil y en el segundo se libera amonio, generando como productos finales
amoniaco, acetato y fructosa-6-fosfato (Figura 2.2.) (Sastoque, 2006; Bhattacharya et al.,
2007).
21
Figura 2.2: Reconocimiento y degradación de la quitina por microorganismos quitinolíticos (Fuente: Yu et al., 1991).
Di Pietro y colaboradores (1993) estudiaron la producción de enzimas quitinolíticas del tipo
endoquitinasas, glucosaminidasas y quitiobiosidasas, indicando la existencia de un complejo
patrón funcional y regulatorio para éstas enzimas, involucradas en funciones como la
liberación de nutrientes a partir de sustratos de quitina, micoparasitismo, competencia y
funciones reguladoras en el desarrollo fúngico.
Las quitinasas son glicosil hidrolasas y se encuentran presentes en una gran variedad de
organismos tales como bacterias, hongos, insectos, plantas y animales. Estas enzimas
22
juegan roles fisiológicos y ecológicos importantes. Los invertebrados requieren quitinasas
para la degradación parcial de sus exoesqueletos viejos y las plantas como un mecanismo
de defensa contra hongos patógenos (Hoster et al., 2005). Las bacterias producen
quitinasas principalmente para degradar quitina y usarla como fuente de energía.
Adicionalmente, algunas quitinasas de bacterias quitinolíticas son agentes potenciales para
el control biológico de enfermedades de plantas causadas por diversos hongos
fitopatógenos, pues hidrolizan la quitina presente en la pared celular del hongo. Las
bacterias fitopatógenas también pueden ser controladas por estas enzimas debido a que
algunas presentan actividad lisozimal, lo cual permite la degradación de la pared celular
bacteriana (De la Cruz et al., 1992). Estas enzimas pertenecen a muchas especies
bacterianas, entre las más conocidas se encuentran los géneros Aeromonas, Serratia,
Myxobacter, Vibrio, Streptomyces y Bacillus (Hoster et al., 2005).
Las quitinasas se clasifican en dos categorías generales: las endoquitinasas clivan la quitina
aleatoriamente en sitios internos, generando multímeros de N-acetilglucosamina de bajo
peso molecular, tales como quitotetraosa, quitotriosa y diacetilquitobiosa. Las exoquitinasas
pueden dividirse en dos subcategorías: quitobiosidasas que se encargan de catalizar la
liberación progresiva de diacetilquitobiosa iniciando en el terminal no reductor de la quitina, y
las β-(1,4) N-acetilglucosaminidasas, que clivan los productos oligoméricos de las
endoquitinasas y quitobiosidasas, generando monómeros de N-acetilglucosamina. Una ruta
alternativa involucra la deacetilación de la quitina a quitosano, que es finalmente convertido
a residuos de glucosamina por acción de la quitosanasa (Dahiya et al., 2006).
Las quitinasas presentan diferente talla molecular que va desde 20 kDa hasta 90 kDa, las
quitinasas bacterianas oscilan entre 20 y 60 kDa, presentando un peso molecular similar a
las quitinasas secretadas por las plantas (25 – 40 kDa) pero menor a las enzimas producidas
por los insectos (40 – 85 kDa). Las quitinasas resultan ser activas en diferentes rangos de
temperatura y pH, esta variación se ve reflejada de acuerdo a la fuente de aislamiento,
permitiendo que las quitinasas sean empleadas en diferentes procesos que difieren en las
condiciones de pH y temperatura (Bhattacharya et al., 2007).
Las quitinasas se encuentran clasificadas en dos familias de glicosil-hidrolasas (18 y 19),
sobre la base de la similitud de la secuencia de aminoácidos. La familia 18 de quitinasas se
distribuye en una amplia variedad de organismos incluyendo bacterias, hongos, virus,
23
plantas y animales. Por otro lado, estudios han reportado la secreción de enzimas de la
clase I, II y IV por plantas y Streptomyces griseus HUT 6037 (quitinasas C) las cuales
pertenecen a la familia 19. (Itoh et al., 2003)
La quitinasa C (chiC) fue la primera quitinasa bacteriana de la familia 19 descubierta en
Streptomyces griseus HUT 6037, la cual mostró generar la inhibición de la extensión hifal de
Trichoderma reesei in vitro; por el contrario en cultivos de arroz la familia 19 no generó esta
misma inhibición. Sin embargo estudios han reportado el incremento de resistencia en
plantas a enfermedades fúngicas por la introducción del gen chiC en plantas de arroz
(Mitsutomi et al., 1995; Tanabe et al., 2000).
2.4.1.1 Producción de quitinasas
Las quitinasas de origen microbiano han sido producidas por medio de fermentación líquida
continua y fermentación alimentada. Adicionalmente, la fermentación en fase sólida y los
sistemas celulares bifásicos han sido usados para la producción de quitinasas.
Generalmente, las quitinasas producidas por los microorganismos son inducidas
naturalmente. Se ha estudiado que la producción extracelular de quitinasas es influenciada
por los componentes del medio tales como fuentes de carbono, y de nitrógeno, provenientes
de residuos agrícolas como arroz y salvado de trigo, entre otros (Bhushan et al., 1998;
Dahiya et al., 2005). Un efecto de la glucosa en el incremento en la producción de quitinasas
fue mostrado por Bhushan y Hoondal (1998) cuando ésta fue usada con quitina en un medio
de producción. Sin embargo Miyashita y colaboradores (1991) reportaron un efecto contario
en donde la producción de quitinasas se vio inhibida en presencia de glucosa. Por otro lado,
Dahiya y colaboradores (2006) encontraron un aumento en la producción de quitinasas
cuando se empleó salvado de trigo en combinación con quitina. Muchos otros factores
físicos tales como la aireación, pH y temperatura de incubación también pueden afectar la
producción de las quitinasas. Por otro lado Bhushan y Hoondal (1998) reportaron una
estimulación en la producción de quitinasas por Bacillus sp. BG-11 cuando al medio de
crecimiento se le adicionaron aminoácidos como triptófano, tirosina, glutamina y arginina
(0,1mM). Algunos otros métodos como la inmovilización (Bhushan y Hoondal, 1998),
sistemas bifásicos celulares (Chen y Lee, 1995), fermentaciones en fase sólida, y otros, han
sido usados para mejorar la producción de quitinasas a partir de diferentes microorganismos
(Bhushan y Hoondal 1998).
24
2.4.1.2. Uso Biotecnológico de las Quitinasas
Las quitinasas son de interés biotecnológico debido a su potencial uso como agentes
preservantes de alimentos y semillas y para la ingeniería de plantas con resistencia a
hongos fitopatógenos (Hoster et al., 2005). De igual manera éstas pueden estar involucradas
en la salud humana, participando por ejemplo en soluciones oftalmológicas junto con
microbiocidas. Un medicamento de uso directo a partir de quitinasas ha sido sugerido para la
terapia de enfermedades fúngicas potenciando la actividad de drogas antifúngicas. Estas
también pueden ser usadas como potenciales aditivos en cremas antifúngicas y lociones
debido a sus aplicaciones tópicas (Dahiya et al., 2006).
Preparaciones de quitinasas han sido empleadas para producir diversos quitooligosacáridos,
glucosaminas y N-acetilglucosamina con un inmenso potencial farmacéutico. Los
quitooligosacáridos son potencialmente útiles en la medicina para humanos. Por ejemplo la
quitohexaosa y la quitoheptaosa mostratron actividad antitumoral. Una quitinasa generada a
partir de Vibrio alginolyticus fue usada para preparar quitopentaosa y quitotriosa a partir de
quitina coloidal (Murao et al., 1992). Para lograr obtener oligómeros con una longitud de
cadena deseada se requiere hacer uso de combinaciones específicas de enzimas
quitinolíticas; por ejemplo, la producción de quitooligosacáridos requiere altos niveles de
endoquitinasa y bajos niveles de N-acetilglucosaminidasa y exoquitinasa, mientras que la
producción de N-acetilglucosamina requiere alta proporción de exoquitinasa y N-
acetilglucosaminidasa (Aloise et al., 1996). Alternativamente, la actividad de
transglicosilación de una variedad de endoquitinasas y N-acetilglucosaminidasas puede ser
también útil para generar quitoligómeros (oligómeros con cambios en las uniones
glicosídicas y glicopéptidos) (Dahiya et al., 2006).
A nivel ambiental, el uso de microorganismos o sus secreciones para prevenir a las plantas
de patógenos e insectos ofrece una alternativa o un complemento para el control de
enfermedades vegetales (Dahiya et al., 2006). Adicionalmente éstas pueden ser adicionadas
como suplemento a los fungicidas e insecticidas comúnmente usados no solo para hacerlos
más potentes sino también para minimizar la concentración de ingredientes activos
sintetizados químicamente de los insecticidas y fungicidas que de lo contrario resultan ser
altamente nocivos para el medio ambiente (Bhushan y Hoondal, 1998)
25
Las enzimas de tipo quitinasas han recibido especial importancia por el control que ejercen
sobre los hongos patógenos del suelo. Singh y colaboradores (1999) reportaron la supresión
de Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum por Streptomyces sp. 385, demostrando la
fuerte acción antagónica de enzimas quitinasas y otras sustancias antifúngicas sobre el
fitopatógeno causante del marchitamiento de plantas de pepino.
Los actinomicetos se consideran los organismos dominantes involucrados en la
descomposición de quitina en el suelo (Ames, 1989). En especial, especies del género
Streptomyces, han sido reportadas como microorganismos productores de enzimas
extracelulares líticas como las quitinasas, y mencionados como agentes antagonistas
prometedores para el biocontrol debido a la reacción de hidrólisis sobre el micelio de los
hongos en suelos ácidos y hojarascas que catalizan estas enzimas (Gomes et al., 2001). Las
especies pertenecientes al género Streptomyces se consideran como el principal grupo
microbiano quitinolítico en el suelo debido a su habilidad para degradar quitina, han
mostrado ser los mayores degradadores de quitina in vitro, en comparación a otras bacterias
y hongos que demostraron constituir entre el 1 a 3% y el 1%, respectivamente, de la
población quitinolítica (Metcalfe et al., 2002).
Los actinomicetos endofíticos han sido aislados de varios tejidos de plantas y algunos de
ellos han mostrado un alto potencial como agentes biocontroladores contra hongos
fitopatógenos. Algunas cepas de actinomicetos endofíticos que producen quitinasas podrían
proteger contra hongos fitopatógenos en tejidos de plantas (Taechowisan et al., 2003).
Teniendo en cuenta esto, el papel de las quitinasas de los actinomicetos en la actividad
fúngica podría ser estudiada, ya que estos microorganismos pueden contribuir a su planta
hospedera con alguna protección natural contra infecciones, participando en técnicas de
control biológico llegando a ser una aproximación importante para facilitar la agricultura
sostenible (Wang et al., 2002; Taechowisan et al., 2003).
26
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Las enfermedades generadas por hongos se han convertido en una de las mayores
preocupaciones para la producción agrícola, por este motivo ha surgido la necesidad de
buscar alternativas para aumentar el rendimiento de los cultivos y poder mantener constante
el suministro de alimentos. Se ha demostrado que el uso de productos químicos como
fungicidas y pesticidas (pentaclorofenol, sodio borato, cobre y arsenato) en el control de las
enfermedades causadas en plantas genera efectos perjudiciales para el medio ambiente y
los seres humanos. Por otra parte, estudios basados en técnicas de biología molecular
buscan el desarrollo de plantas transgénicas que presenten resistencia a los patógenos
causantes de la enfermedad, sin embargo son pocos los informes que han reflejado el
desarrollo de resistencia por parte de la planta. Esto genera la necesidad de emplear otras
técnicas para contrarrestar el efecto negativo generado en las plantas a causa de la acción
de los fitopatógenos (Gohel et al., 2006). De igual manera, la fertilidad del suelo se ha visto
influenciada por la intensificación de su uso agrícola, generándose un descenso en el
contenido de materia orgánica, nitrógeno total y cationes básicos intercambiables, así como
el incremento de la concentración de fósforo soluble en el suelo debido a la aplicación
frecuente de fertilizantes, fungicidas y pesticidas (Álvarez y Anzuelo, 2004). Los productores
han creado una dependencia de estos agroquímicos como un método relativamente fiable
para la protección de los cultivos ayudando con la estabilidad económica de sus operaciones
(Compant et al., 2005).
Los fungicidas químicos son ampliamente usados en la agricultura; sin embargo el uso
excesivo de éstos ha llevado a un deterioro en la salud humana y en el ambiente
contribuyendo a la generación de alteraciones en el suelo de tipo químico como pérdida de
nutrientes, acidificación, salinización y sodificación, aumento de la toxicidad por liberación y
concentración de determinados elementos químicos; y alteraciones físicas como pérdida de
estructura, disminución de la permeabilidad y disminución de la capacidad de retención de
agua (Brissio, 2005). Adicionalmente, la aplicación de dichos productos de origen industrial
tiene un alto costo para el mantenimiento de los cultivos y pueden generar resistencia de los
patógenos hacia los mismos (Prapagdee et al., 2008). Por otro lado, en muchos casos, se
presentan enfermedades en los cultivos para las cuales las soluciones químicas son muy
pocas, inefectivas, o simplemente no existen (Compant et al., 2005).
27
En consecuencia de lo anterior, surge la necesidad de identificar métodos alternativos para
la protección de las plantas, menos dependientes de químicos y más seguros a nivel
ambiental. Los microorganismos antagonistas son ampliamente usados para el control de
enfermedades de plantas causadas por hongos. Muchas especies de actinomicetos,
particularmente aquellas pertenecientes a los géneros Streptomyces, son bien conocidos
como agentes antifúngicos. La actividad antagonista de Streptomyces sp. contra los hongos
patógenos usualmente está relacionada con la producción de compuestos antifúngicos y
enzimas hidrolíticas extracelulares. Las quitinasas y las β-1,3-glucanasas son enzimas
importantes en la lisis de paredes celulares de hongos, por ejemplo de Fusarium oxysporum
y Sclerotinia minor (Prapagdee et al., 2008).
El uso de tecnologías limpias, incluye el empleo de biofertilizantes usando inóculos fúngicos
y bacterianos sobre el sustrato edáfico en el que se desarrollan las plantas, o sobre las
semillas antes de la siembra, evitando los efectos secundarios de los métodos actuales de
fertilización y protección frente a plagas (Ramos, 1999). La aplicación de dichos
microorganismos como agentes de control biológico requiere un profundo estudio de su
comportamiento en condiciones controladas, los ensayos previos a los experimentos de
campo son absolutamente necesarios antes de su aplicación a gran escala (Ramos, 1999).
Los actinomicetos, son microorganismos que han sido poco evaluados como
biocontroladores de hongos fitopatógenos, por tal razón se decidió evaluar la capacidad de
aislamientos de actinomicetos para sintetizar enzimas involucradas en la degradación de la
pared celular de patógenos fúngicos, y como complemento de investigaciones adicionales y
paralelas, se pueda pensar en estas bacterias como sustituyentes de fungicidas de uso
común, minimizando los efectos perjudiciales sobre el suelo y generando efectos benéficos
adicionales característicos de los microorganismos promotores del crecimiento vegetal.
28
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la producción de enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas por parte de cepas nativas
de actinomicetos y su posible efecto antagónico sobre algunos hongos fitopatógenos.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Establecer las condiciones óptimas para inducir y detectar la producción de
quitinasas.
• Evaluar la capacidad de cepas nativas de actinomicetos para sintetizar quitinasas.
• Evidenciar el efecto antagónico de cepas nativas de actinomicetos sobre hongos
fitopatógenos (Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.).
29
5. METODOLOGÍA
5.1. RECONSTITUCIÓN DE CEPAS DE ACTINOMICETOS
A partir del banco de cepas de actinomicetos del Laboratorio UNIDIA de la Pontificia
Universidad Javeriana, las cuales fueron aisladas e identificadas microscópicamente y
macroscópicamente previamente por Duque y Quintana (2008) (Anexo 1), se realizó la
reconstitución de 23 aislamientos de actinomicetos y de la cepa de Streptomyces sp.
proporcionada por el Laboratorio de Biotecnología, estudiada como cepa quitinolítica por
Sastoque (2006), la cual fue empleada como cepa Control.
En la reconstitución se tomaron 40mL de medio avena líquido (avena comercial en hojuelas
y sacarosa, pH 6.8), y se inocularon con 100 µL de cada uno de los aislamientos
crioconservados. Cada medio inoculado se incubó en agitación a 120 rpm durante 5 días a
20ºC. A continuación se sembraron placas de agar avena suplementado con nistatina 0.1%
(v/v) y se incubaron a 25ºC durante 10 días, obteniéndose así el banco de trabajo constituido
por 24 aislamientos, el cual se mantuvo viable por pases sucesivos en agar avena (Anexo
2).
5.2. EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA
5.2.1 Preparación de quitina coloidal
La quitina coloidal fue preparada siguiendo el protocolo de Skujins y colaboradores (1965)
modificado por Rodríguez (2001) con una variación en el volumen a utilizar de H3PO4. Para
su efecto se tomaron 10 g de quitina comercial (SIGMA) y se disolvieron en 150 mL de
H3PO4 concentrado (85%), la mezcla fue dejada en agitación durante 48 h a 4ºC. La
solución resultante fue filtrada empleando fibra de vidrio, posteriormente se adicionó etanol
acuoso al 50% alcanzando un volumen final de 300 ml. A continuación la mezcla se colocó
en agitación hasta que se observó una solución homogénea y de aspecto coloidal. Se
realizaron 15 lavados con agua destilada mediante centrifugación a 4500 x g a una
30
temperatura de 10ºC con el fin de alcanzar un pH cercano a la neutralidad (Figura 5.1), la
concentración final de la quitina coloidal fue estimada de acuerdo al volumen final obtenido.
La quitina coloidal empleada para el ensayo de actividad enzimática fue dializada contra
agua destilada durante 48 h.
Figura 5.1. Preparación Quitina coloidal
5.2.2. Diálisis de la quitina coloidal
Con el fin de evitar contaminaciones en la quitina coloidal a dializar, las membranas fueron
pretratadas con una solución que contenía NaHCO3 100mM y EDTA 10 mM a 60 ºC durante
2 horas, repitiéndose la incubación con solución fresca. Una vez finalizadas las
subsiguientes dos horas de tratamiento, la solución fue reemplazada con agua destilada,
siguiendo el procedimiento de incubación anteriormente señalado. Se realizaron 5 ciclos de
lavado con agua destilada, con el fin de eliminar trazas de la solución inicial. Luego de
incubar las membranas a 4 ºC, estas se transfirieron a un frasco que contenía agua destilada
con cloroformo (0.1% v/v) mientras eran utilizadas.
31
Las membranas pretratadas fueron cortadas para obtener fragmentos de 25 cm.
Posteriormente 30 mL de quitina coloidal fueron adicionados en cada uno de los fragmentos
obtenidos. Una vez selladas las membranas se ubicaron en un recipiente con agua destilada
en agitación a 4 ºC durante 48 h, como se observa en la figura 5.2 (Wright, 2004).
Con el fin de determinar la concentración final de la quitina dializada se relacionó el volumen
obtenido tras el proceso de diálisis con el inicial, la quitina fue llevada a una concentración
final de 0,5% (p/v) empleando una solución tampón de fosfato de potasio (K2HPO4 0.1M,
KH2PO4 0.1M pH 6.0), la preparación fue almacenada a 4 ºC para su posterior uso (De la
Cruz et al., 1992; Kamil et al., 2007).
Figura 5.2. Diálisis de la Quitina Coloidal
5.2.3. Evaluación de producción de quitinasas en placa
5.2.3.1. Selección de cepas quitinolíticas
Se realizó un screening a partir del banco de trabajo con el fin de seleccionar las cepas de
actinomicetos que presentaban actividad quitinolítica. Las cepas de actinomicetos fueron
sembradas por método de estría en medio mínimo, preparado a partir de soluciones stock de
K2HPO4 y KH2PO4 3%, MgSO4.7H2O y CaCl2, FeCl3 y NaCl (Hoster et al., 2005; Franco,
2008). El medio fue suplementado con quitina coloidal al 1% (p/v) como única fuente de
carbono. Para determinar la viabilidad de las cepas, se empleó medio mínimo suplementado
32
con glucosa 1% (p/v) como única fuente de carbono, el pH de los medios de cultivo fue
ajustado a 6.8 (Anexo 2). Después de 5 días de incubación a 25ºC las cepas que
presentaron zonas de hidrólisis en el medio con quitina coloidal 1% (p/v), fueron
consideradas como posibles cepas productoras de quitinasas; se seleccionaron 19 cepas del
banco para continuar con el estudio.
5.2.3.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad
quitinolítica
La concentración óptima de quitina coloidal para el estudio se determinó empleando las
cepas 4, 12, 26 (seleccionadas al azar) y Control, previamente seleccionadas como cepas
quitinolíticas en la evaluación en placa; éstas fueron sembradas en medio mínimo con 3
concentraciones de quitina coloidal: 0,5, 1 y 2% (p/v) (Taechowisan et al., 2003) para
determinar la concentración más baja que permitía una mejor visualización de la hidrólisis
enzimática; dichas concentraciones fueron evaluadas por triplicado para cada una de las
cepas ya mencionadas (Anexo 2).
5.2.3.3. Determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica
A partir de cada una de las cepas de actinomicetos seleccionadas para el estudio se realizó
un recuento de conidios en Cámara de Neubauer hasta obtener un inóculo de 107 cél·mL-1. A
cada caja de petri estéril se le adicionó 30 mL de medio mínimo con quitina coloidal 1% (p/v)
pH 6.8, para formar una capa de espesor grueso, posteriormente se realizaron cuatro pozos
con capacidad de 30 µL a una distancia equidistante, a continuación se agregaron 20 µl de
agar agua con el fin de conformar una capa sellante, y sobre esta capa se adicionaron 5 µL
del inóculo (Anexo 2). Este procedimiento se realizó en los cuatro pozos formados. Los
volúmenes empleados se seleccionaron de acuerdo a la estandarización realizada. El
montaje fue llevado a cabo por triplicado para cada una de las cepas evaluadas. Las placas
de petri se llevaron a incubar a una temperatura de 25ºC por un período de 9 días, y se
realizaron mediciones del diámetro de los halos de hidrólisis que se iban formando en el
medio los días 3, 5, 7 y 9.
33
5.3. ENSAYO DE LA ESTANDARIZACIÓN PARA LA EVALUACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA
5.3.1. Curvas de calibración para la cuantificación de N-acetilglucosamina y proteínas
La cuantificación de azúcares reductores se realizó siguiendo el método de Somogyi Nelson,
modificado por Rodríguez (2001) (Anexo 3). Por medio de una curva de calibración se
determinó la concentración de N-acetilglucosamina a partir de una solución de 0.4 µg·µL-1. A
partir de ésta se prepararon soluciones a diferentes concentraciones, usando como diluyente
agua destilada. Se estableció un rango de concentraciones que iba desde 0.08 hasta 0.36
µg·µL-1., la curva fue realizada con 3 repeticiones. Por otro lado la cuantificación de
proteínas se llevó a cabo siguiendo el método de Bradford (1976) (Anexo 4), realizando una
curva patrón con suero albúmina de bovino (acrónimo del inglés: BSA), partiendo de una
solución concentrada de 2000 µg·mL-1, de igual manera se prepararon soluciones con
concentraciones diferentes, usando cloruro de sodio (NaCl 0.15M) como diluyente. El rango
varió de 50 µg·mL-1 hasta 1400 µg·mL-1, la curva se realizó con 3 repeticiones (Rodríguez,
2001).
5.3.2. Determinación del agente precipitante de las proteínas
Con el fin de determinar el agente a emplear para obtener una mejor precipitación y
concentración de la enzima, se realizó un ensayo con una muestra de BSA a diferentes
concentraciones (0.4 y 0.8 mg mL-1) y volúmenes (1.5, 2 y 3.0 mL), las cuales fueron
tratadas con sulfato de amonio y acetona, determinando la concentración de proteína
posterior al tratamiento y así lograr definir el agente con mayor eficiencia para dicho proceso.
A partir de una solución patrón de BSA 1 mg·mL-1se prepararon dos soluciones de ésta
misma proteína (0.4 mg·mL-1 y 0.8 mg·mL-1), empleando NaCl (0.15 M) como diluyente. A
partir de estas soluciones se transfirieron 3 volúmenes (1.5; 2.0 y 3.0 ml) a tubos tipo falcon
de 15 ml para obtener un total de 3 tubos por volumen para cada una de las concentraciones
de BSA, teniendo en cuenta que las muestras fueron evaluadas por triplicado.
34
Posteriormente se realizó la precipitación de las muestras para el ensayo. Para el caso de la
acetona, la cual se encontraba fría, se adicionó un volumen equivalente al doble del volumen
de proteína transferido inicialmente a cada uno de los tubos falcon; el tratamiento fue
realizado por separado para las dos concentraciones de BSA. Por otro lado la precipitación
con sulfato de amonio se llevó a cabo adicionando un volumen de una solución saturada al
80% calculada a partir de la siguiente fórmula:
Donde
Vs: Volumen de la solución saturada de Sulfato de amonio
VP: Volumen de la solución de proteínas
X1: Fracción de saturación inicial
X2: Fracción de saturación final
Las muestras tratadas con acetona fueron almacenadas a -20ºC por 24 horas mientras que
las muestras tratadas con sulfato de amonio se conservaron a 4ºC por el mismo periodo de
tiempo. Luego de 24 horas, las proteínas precipitadas fueron recuperadas por centrifugación
a 13000 x g por 30 min a una temperatura de 4 ºC, posteriormente el pellet obtenido fue
resuspendido en 1ml de una solución tampón de fosfato de potasio (K2HPO4 0.1M, KH2PO4
0.1M, pH 6.0). La cuantificación de las proteínas se llevó a cabo siguiendo el método de
Bradford (1976). Las absorbancias leídas en el espectrofotómetro a una longitud de onda de
595nm fueron convertidas a concentraciones de miligramo de proteína por mililitro utilizando
la curva de calibración de BSA.
5.3.3. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la actividad enzimática
35
Para determinar el efecto del tipo de quitina sobre la inducción de actividad enzimática, se
realizó una evaluación de la quitina coloidal y la quitina en polvo (Sigma) como única fuente
de carbono.
Con el fin de estandarizar las variables estudiadas se seleccionaron las cepas 25 y control
para llevar a cabo la prueba. Para su efecto se realizó un recuento de conidios en Cámara
de Neubauer hasta obtener un inóculo de 109 cel·mL-1. A un erlenmeyer con capacidad de
250 mL, se le adicionó 50 mL de medio mínimo líquido quitina coloidal 1% (p/v) (Anexo 2) y
500 µL del inóculo; por otro lado a 50 mL de medio mínimo líquido quitina en polvo 1.5 %
(p/v) (Anexo 2) se le adicionaron 500 µL del mismo inóculo. Cada erlenmeyer fue puesto en
agitación a 120 rpm a temperatura ambiente por 7 días. Al séptimo día de incubación se
realizó el muestreo del volumen total contenido en los erlenmeyers, ya que en los resultados
de la prueba en placa se obtuvo el aumento más significativo entre los días 5 y 7 para la
cepa evaluada (25). A continuación se realizó una doble centrifugación del volumen
muestreado a 7000 rpm en una centrifuga Einac 121010 durante 15 minutos para remover
las células y otras partículas interferentes. Dicho procedimiento fue realizado por triplicado
para cada una de las cepas. El sobrenadante obtenido fue almacenado a -20ºC.
El efecto de la precipitación sobre la actividad enzimática y la actividad enzimática específica
se determinó mediante el estudio de dos tratamientos: Uno que incluía un proceso de
precipitación (5x y 10x), y otro sin precipitación. Para llevar a cabo el tratamiento que incluía
precipitación, 45 mL del sobrenadante almacenado a -20ºC de cada una de las cepas fue
precipitado empleando acetona, para concentrar 5 veces la enzima se tomaron 15 mL del
sobrenadante y se mezclaron con 30 mL de acetona, adicionalmente para lograr una
concentración de 10 veces, 60 mL de acetona fueron adicionados a 30 mL del
sobrenadante. Las muestras tratadas fueron almacenadas a -20ºC por 24 horas.
Trascurridas las 24 horas las proteínas precipitadas fueron recuperadas por centrifugación a
13000 x g por 30 minutos a una temperatura de 4ºC, posteriormente el pellet obtenido fue
resuspendido en 3 mL de una solución tampón de fosfato de potasio (K2HPO4 0.1M, KH2PO4
0.1M, pH 6.0). Las muestras de cada tratamiento (5x y 10x) fueron almacenadas a -20ºC. El
montaje fue realizado por separado para cada una de las cepas evaluadas en los dos
medios de cultivo medio mínimo quitina coloidal y medio mínimo quitina en polvo.
36
Con el fin de determinar las condiciones óptimas para evaluar la actividad enzimática y la
actividad enzimática específica de las quitinasas, se estudió la influencia que tienen las
variables temperatura y proporción enzima/sustrato sobre las actividades mencionadas.
El procedimiento fue realizado tomando las muestras tratadas con acetona (5x-10x) y el
sobrenadante no tratado con este agente almacenados a -20ºC, correspondientes a cada
una de las cepas (25 y control) y sustratos evaluados. El volumen de sobrenadante (enzima)
tomado fue dependiente de cada una de las proporciones enzima/sustrato a estudiar: 1:1
(150 µL de enzima y 150 µL de sustrato); 1:2 (100 µL de enzima y 200 µL de sustrato) y 1:4
(50 µL de enzima y 200 µL de sustrato). Como sustrato se empleó la quitina coloidal al 0.5%
(p/v) dializada y almacenada a 4 ºC. Una vez conformadas las mezclas enzima/sustrato, se
incubaron en un baño termostatado durante 1 hora, evaluando dos temperaturas (40ºC y
50ºC) (Gupta et al., 1995; Gomes et al., 2000; Gomes et al., 2001).
A continuación se determinó la concentración de azúcares reductores por medio de la
reacción de Somogyi-Nelson, utilizando una curva patrón de N-acetilglucosamina (GlcNAc),
siguiendo el protocolo de Rodríguez (2001) (Anexo 3). La unidad de actividad enzimática fue
definida como la cantidad de enzima que genera la liberación de 1 µmol de GlcNAc en un
minuto (Gomes et al., 2000). Igualmente se determinó la concentración de proteína por el
método de Bradford (1976), las absorbancias leídas fueron convertidas a concentraciones de
miligramo de proteína por mililitro utilizando la curva de calibración de concentraciones
conocidas de BSA (Anexo 4).
Con el fin de evitar interferentes en los resultados, se realizó la cuantificación de proteínas
en medio mínimo líquido quitina en polvo 1.5 % (p/v) y en medio líquido quitina coloidal 0.5
% (p/v). Para su efecto, se realizó un montaje en erlenmeyers conteniendo 50 ml de medio
mínimo quitina en polvo y 50 mL de medio mínimo quitina coloidal, el montaje se realizó por
triplicado para cada uno de los tratamientos. Los erlenmeyers se incubaron en agitación a
120 rpm a temperatura ambiente durante 7 días. Posteriormente se realizó una doble
centrifugación del medio recuperado en cada erlenmeyer a 7000 rpm en una centrifuga
Einac 121010 durante 15 minutos. La concentración de azúcares reductores se determinó
por medio de la reacción de Somogyi-Nelson y la concentración de proteína mediante el
método de Bradford (1976).
37
5.4. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO
Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de actinomicetos se
realizó un enfrentamiento en cultivo dual, actinomiceto/hongo fitopatógeno siguiendo una
combinación de los protocolos de Crawford y colaboradores (1993) y Gravel y colaboradores
(2005). Los patógenos evaluados se seleccionaron por ser hongos asociados a
enfermedades del suelo presentes en trébol blanco: Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.,
proporcionados por el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia
y el Laboratorio de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana respectivamente.
Se realizó una siembra masiva ocupando un espacio de 3 cm de distancia a partir de uno de
los extremos de la caja de cada una de las cepas evaluadas en agar PDA (Anexo 2) pH 6.8
por triplicado, posteriormente éstas fueron puestas en incubación a 25ºC durante 10 días,
hasta observar la esporulación de las colonias. A continuación se inoculó un disco de agar
YGC de 0.5 cm (Anexo 2) donde previamente se encontraba crecido el hongo a evaluar
(Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.) a una distancia de 3 cm del extremo opuesto a la siembra
del actinomiceto. Por otro lado se evaluó la viabilidad del hongo fitopatógeno sin interactuar
con otro microorganismo, el cual fue inoculado por técnica de disco de agar en el centro de
una caja de petri con agar PDA (Figura 5.3); después de 8 días de incubación se realizó la
medición del crecimiento libre e influenciado del fitopatógeno con el fin de determinar el
porcentaje de inhibición de crecimiento radial del fitopatógeno (PICR) generado por el
actinomiceto, el cual fue calculado mediante la siguiente fórmula:
PICR: (Crecimiento libre - Crecimiento influenciado) X 100 Crecimiento libre
38
5.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos en la evaluación de actividad qutinolítica y en el ensayo de la
actividad antifúngica in vitro fueron sometidos a un análisis de varianza de clasificación
simple (ANOVA), siendo las medias con diferencias significativas comparadas según la
prueba de rangos múltiples de Duncan para P≤0.05, con el fin de determinar si las variables
en estudio cepa, días y réplicas y cepa y réplicas, respectivamente, presentaban variabilidad
en el modelo. Adicionalmente se realizó un análisis del comportamiento del diámetro de los
halos de cada una de las cepas evaluadas según el área bajo la curva para observar así la
tendencia general a través del tiempo, para ello se empleo la fórmula reportada por Istifadah.
Por otro lado se realizó una correlación de Pearson entre los valores de área bajo la curva
obtenidos en la determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica y los porcentajes
de inhibición de crecimiento radial (PICR), para identificar la relación líneal existente entre
estas dos variables cuantitativas.
Donde
Y: Diámetro del halo t: Día de medición.
Figura 5.3. Montaje enfrentamiento dual Actinomiceto/hongo. A. Actinomiceto, B. Hongo Fitopatógeno.
39
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 RECONSTITUCIÓN DE LAS CEPAS DE ACTINOMICETOS
Para la realización del estudio se seleccionaron 23 aislamientos de actinomicetos del banco
de cepas del grupo UNIDIA de la Pontificia Universidad Javeriana. Los viales con las cepas
de actinomicetos conservadas en glicerol, se reconstituyeron para contrarrestar el estrés
generado por la congelación que afecta la actividad metabólica del microorganismo,
garantizando la estabilización y recuperación total de los procesos moleculares (Sánchez y
Corrales, 2005). Se empleó medio avena líquido, que posiblemente favoreció el intercambio
molecular iónico y la recuperación de la actividad metabólica de la membrana celular
rápidamente (Sánchez y Corrales, 2005). Una vez finalizado el periodo de reconstitución,
cada una de las cepas fue sembrada masivamente en agar avena. Inicialmente se
observaron colonias ligeramente húmedas y algo brillantes, pero con el transcurrir del tiempo
se volvieron opacas y secas adquiriendo una textura pulverulenta (Figura 6.1); según León y
colaboradores (2007) este cambio en la morfología hace referencia a los estados de
conversión por los que pasan las hifas aéreas hasta llegar a la formación de esporas.
Figura 6.1. Aspecto macroscópico cepas 7, 8 y 3, crecidas en agar Avena.
El agar empleado para la siembra masiva, fue un medio altamente nutritivo cuyo
componente principal es la hojuela de avena procesada, la cual resulta ser uno de los
cereales más completos por sus cualidades energéticas y nutritivas, presentando en su
40
contenido proteínas, hidratos de carbono, lípidos, vitaminas y minerales como Sodio,
Potasio, Calcio, Fósforo, Magnesio, Hierro, Cobre y Zinc (Longevus, 2007). Este medio pudo
haber favorecido el crecimiento de los actinomicetos y el desarrollo de las características
propias de éstos, las cuales permitieron corroborar que las cepas trabajadas correspondían
a bacterias filamentosas.
Transcurrido el periodo de incubación, se realizó una confirmación de las características de
los actinomicetos a nivel microscópico y macroscópico. El reconocimiento macroscópico se
realizó teniendo en cuenta factores claves y propios de este tipo de microorganismos. Las
colonias crecidas presentaban bordes no regulares y se encontraban fuertemente adheridas
a la superficie del medio, mostrando una consistencia dura y compacta. Las características
de coloración del micelio sobre el sustrato también fueron utilizadas para facilitar el
reconocimiento de estos microorganismos. Las cepas evaluadas presentaban variedad de
colores de micelio, principalmente del micelio aéreo, mostrando pigmentaciones que variaron
en los tonos blanco, gris, azul, rosa, crema y amarillo principalmente. Estas coloraciones no
mostraron ser exclusivas del micelio, sino que se difundieron en el medio, alterando la
coloración del mismo. La variedad de colores refleja la presencia de diversas especies y
también la capacidad de estos microorganismos de producir pigmentos melanoides, tal como
lo reportó Fialho De Oliveira (2003), quien encontró comportamientos macroscópicos
similares. Adicionalmente se observó una apariencia pulverulenta como consecuencia de la
formación de largas cadenas de esporas altamente hidrofóbicas, las cuales se originan de la
subdivisión de la hifa aérea que surge a partir de la hifa del sustrato, característica puntual
del crecimiento de éste tipo de microorganismos sobre medio sólido (Hodgson, 1992). Otra
característica que permitió inferir que las cepas reconstituídas eran actinomicetos fue la
presencia de un fuerte olor a tierra húmeda generado por la capacidad de estas bacterias
filamentosas para producir terpenoides al final de la fase exponencial de crecimiento (Wu y
Chen, 1995; Fialho De Oliveira, 2003).
Por medio de la realización de una tinción de Gram, se confirmó microscópicamente que el
total de las cepas empleadas eran Gram positivas, presentando filamentos con
ramificaciones, observándose en algunos casos septos en el micelio (Serrano et al., 2003).
41
6.2. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA
6.2.1. Medio de cultivo
Para la realización de un ensayo in vitro de evaluación de actividad quitinolítica, la selección
de un medio de cultivo resulta ser un factor determinante para el crecimiento de los
microorganismos y la producción de metabolitos (Shanmugaiah et al., 2008). Se decidió
emplear el medio reportado por Hoster y colaboradores (2005), modificado por Franco-
Correa (2008), medio mínimo con adición de quitina coloidal como única fuente de carbono y
cloruro de amonio como fuente inorgánica de nitrógeno para evaluar la actividad quitinolítica
de los aislamientos de actinomicetos (Anexo 2). Se utilizó quitina coloidal debido a que
diversos autores han encontrado una producción notable de quitinasas cuando los distintos
medios la contienen (Wen et al., 2002; Sandhya et al., 2005; Ahmadi et al., 2008;
Shanmugaiah et al., 2008; Sharaf, 2005); adicionalmente, para la evaluación de la actividad
enzimática y actividad enzimática específica la quitina fue dializada con el fin de eliminar
sales y compuestos de bajo peso molecular que pudieran interferir en la reacción
enzima/sustrato. El medio contenía sales minerales, las cuales favorecieron el crecimiento
de los microorganismos; Hsu y Lockwood (1975) demostraron en su estudio un crecimiento
más efectivo de aislamientos de actinomicetos marinos cuando se empleó agar quitina
coloidal con sales minerales, en relación a lo obtenido en un medio ausente de éstas. Así
mismo, para la selección del medio, se tuvo en cuenta lo reportado por Safarida y
colaboradores (2006), quienes señalaron la importancia de los micronutrientes tales como
Potasio, Magnesio y Calcio en la conservación de la conformación estructural de las
enzimas. Lo anterior favorece el estudio en la medida en que un buen crecimiento inicial
puede permitir una mejor producción de quitinasas ya que la densidad del inóculo es un
factor que puede afectar la producción de enzimas (Nawani y Kapadnis, 2005).
6.2.2. Evaluación de la producción de quitinasas en placa
6.2.2.1. Selección de las cepas quitinolíticas
La evaluación se inició con 23 aislamientos de actinomicetos, de los cuales 19 fueron
capaces de utilizar la quitina coloidal como única fuente de carbono (Tabla 6.1.), mostrando
42
crecimiento y presentando una zona de hidrólisis alrededor de la colonia como se observa
en la Figura 6.2., indicando actividad quitinolítica (Kamil et al., 2007; Swiontek et al., 2007).
Se puede corroborar la habilidad de los microorganismos del suelo como los actinomicetos
para hidrolizar quitina, ya que un alto porcentaje (82,6%) de los aislamientos de
actinomicetos mostraron presentar actividad quitinolítica para esta prueba en placa, lo cual
coincide con lo reportado por Blaak y colaboradores (1993) y Mukherjee y Sen (2006),
quienes demostraron la capacidad de Streptomyces olivaceoviridis y Streptomyces
venezuelae P10, respectivamente, para hidrolizar quitina; de igual manera Taechowisan y
colaboradores (2003) demostaron en su estudio que la mayoría de los aislamientos
evaluados eran quitinolíticos. A su vez, Strzelcz y colaboradores (1990), Fermino y
colaboradores (2006) y Tahtamouni y colaboradores (2006) reportaron en su evaluación un
alto porcentaje de actinomicetos capaces de emplear la quitina como fuente de carbono
siendo del 100, 60 y 83%, respectivamente
En contraste, las cepas identificadas como 6, 9, 23 y 30 presentaron crecimiento pero no
halo de hidrólisis, por lo cual no fueron consideradas como cepas quitinolíticas y en
consecuencia fueron eliminadas del estudio; probablemente trazas de azúcar del medio
avena les permitió alcanzar un crecimiento muy leve sobre este medio de cultivo, teniendo
en cuenta que los actinomicetos son nutricionalmente versátiles, siendo capaces de crecer
en un medio con limitación de nutrientes (El-Nakeeb y Lechevalier, 1962; Thangapandian et
al., 2007).
43
Medio mínimo suplementado con quitina coloidal al 1%
Cepas Presencia de hidrólisis Cepas Presencia de
hidrólisis
Control + 14 + 1 + 16 + 2 + 18 + 4 + 19 + 5 + 21 + 6 - 22 + 7 + 23 - 8 + 24 + 9 - 25 +
10 + 26 + 11 + 27 + 12 + 30 -
Tabla 6.1. Detección de microorganismos quitinolíticos en medio mínimo suplementado con quitina coloidal al 1%.
Figura 6.2 Hidrólisis de quitina coloidal en placa.
6.2.2.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica
Para la determinación de la óptima concentración de quitina para la visualización de los
halos de hidrólisis se realizó un montaje tomando 3 cepas aleatoriamente (Cepas 4, 12 y
26), previamente seleccionadas como quitinolíticas en la evaluación en placa. Dichas cepas
fueron sembradas en medio mínimo utilizando tres concentraciones de quitina coloidal
reportadas en la literatura 0.5% (Shanmugaiah et al., 2008), 1% (Kamil et al., 2007) y 2%
(Ogawa et al., 2002; Salazar et al., 2006;). A la concentración de 0.5%, las zonas de
hidrólisis que rodeaban las colonias de las bacterias eran difíciles de visualizar, a las
concentraciones 1 y 2% se evidenció un aumento en la hidrólisis, generándose un
44
aumento en la claridad del medio como se observa en la Figura 6.3., por tal motivo se
decidió emplear la concentración de 1% (siendo la menor concentración de las dos que se
visualizaron) para la realización de la prueba semicuantitativa, teniendo en cuenta factores
económicos y el prolongado tiempo que toma la preparación de este sustrato. La razón por
la que las zonas de hidrólisis no fueron visualizadas al emplear una concentración de 0.5%,
puede deberse al hecho que la inducción de la producción de quitinasas se ve estimulada
por el incremento de la concentración de la quitina coloidal (Sharaf, 2005). Adicionalmente el
emplear una concentración más alta de quitina coloidal posiblemente genera una opacidad
visula del medio, lo que puede facilitar la observación de los halos de hidrólisis.
Figura 6.3. Evaluación de la concentración de quitina Cepa 4, 12 y 26. A, 0.5%. B, 1%. C. 2%.
6.2.2.3. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica
La actividad quitinasa puede ser evaluada cuantitativamente mediante la determinación del
desarrollo de zonas de aclaramiento alrededor de las colonias crecidas en el agar quitina
coloidal. El potencial de los aislamientos para la producción de quitinasas se determinó con
base en el radio de la zona de aclaramiento y el tamaño de la colonia (Gohel et al., 2006). La
actividad quitinolítica fue detectada semicuantitativamente para cada una de las cepas en
45
medio quitina coloidal al 1%, siguiendo la metodología de siembra en pozo. La cepa control
de Streptomyces sp, previamente había mostrado producir quitinasas según estudios
realizados por Sastoque (2006), motivo por el cual fue usada como cepa control para el
estudio.
El tamaño de las colonias y los halos fue medido. Las cepas 24 y 22 mostraron tener un
buen potencial quitinolítico evidente por su crecimiento e hidrólisis de quitina en placa,
presentando un halo de hidrólisis de 8.133 y 7.508 mm respectivamente, indicando una
mejor difusión de las enzimas quitinolíticas (Ahmadi et al., 2008) (Figura 6.4). Por el
contrario las cepas 1 y 19 no generaron halo de hidrólisis y en la cepa 11 el diámetro de
hidrólisis alcanzado (0.125 mm) después de los 9 días de evaluación fue muy pequeño en
comparación a las demás cepas en estudio. Estos resultados pueden ser explicados como
consecuencia de la concentración de inóculo empleada, ya que ésta pudo no haber sido
suficiente para lograr observar un efecto hidrolítico en el medio de cultivo, teniendo en
cuenta los estudios de Patidar y colaboradores (2005) quienes observaron un incremento
lineal en la producción de quitinasas cuando la concentración del inóculo aumentaba. Por
otro lado es posible que se haya presentado una pérdida de actividad por parte de estas
cepas debido a una unión inespecífica del centro activo de la enzima (quitinasas) con el
sustrato (quitina) (Álvarez y Del-Barrio, 2008), teniendo en cuenta que esta unión no se
efectúa por una simple adsorción inespecífica sino que tiene lugar a través de una
localización concreta de la enzima, llamada centro activo, en donde se establecen múltiples
interacciones no covalentes entre los aminoácidos que forman el centro activo y el sustrato,
pudiéndose, en consecuencia, no generar la hidrólisis enzimática de la quitina (Franco,
2007). De igual manera puede que estas cepas hayan perdido su actividad quitinolítica,
teniendo en cuenta lo encontrado previamente en donde se ha señalado que subcultivos
continuos pueden tener efectos negativos en la producción de metabolitos secundarios por
parte de los microorganismos, resaltando el caso de un Streptomyces ambofaciens el cual
perdió cerca del 20% de su capacidad para producir Espiramicina tras cuatro subcultivos, es
así, como puede suponerse que esto mismo haya ocurrido en estas cepas en relación a la
producción de quitinasas (Taddei et al., 1999).
46
Figura 6.4. Evaluación de la actividad quitinolítica semicuantitativa. A, cepa 26. B, cepa Control. C, cepa 22.
Se realizó un ANOVA analizando el área bajo la curva (teniendo en cuenta los cuatro
tiempos de evaluación), en donde la variable de interés fue el área del halo de hidrólisis
generado alrededor de las colonias crecidas en medio quitina coloidal al 1%. Es importante
tener en cuenta que el tratamiento control fue codificado como cepa 0. Este cálculo fue
realizado con el fin de determinar el comportamiento del diámetro de los halos de cada una
de las cepas evaluadas para observar de esta manera la tendencia general a través del
tiempo, siguiendo lo estudiado por Istifadah y colaboradores (2006). Los resultados del
análisis de varianza (Anexo 6) muestran un p - valor <0.0001 indicando que el modelo
general es estadísticamente significativo y permite identificar la variabilidad que existe en la
variable de interés. De igual manera se realizó la evaluación de las variables cepa y réplica
con el fin de determinar su aporte al estudio. El p – valor de la variable cepa fue <0.0001 por
lo cual se pudo inferir que la Cepa es una variable que explica el comportamiento del
crecimiento del área del halo, siendo un factor de interés y de comparación por lo que no
debe ser eliminada del modelo. Por su parte la variable réplica presentó un p – valor de
0.1971 indicando que no existe diferencia estadísticamente significativa, confirmando que a
nivel de réplica éstas se comportaron como tales en el estudio.
La comparación entre los promedios de áreas de halo de hidrólisis por cepas y por días fue
realizado por medio de la prueba del rango múltiple de Duncan para áreas bajo la curva, los
resultados demuestran que existen diferencias estadísticamente significativas entre éstos,
de manera tal que permitieron conformar seis grupos de acuerdo a la similitud de los valores
de sus medias con variaciones desde aproximadamente 49 hasta 0.5 (Tabla 6.2.).
47
Cepa Media Agrupamiento Duncan24 48,817 A 22 44,317 A 14 35,137 B 26 34,75 B 5 23,417 C
25 20,833 C D 2 20,333 C D 4 18,667 C D E 7 17263 D E
27 19,917 D E 0 16,25 D E
21 15,417 D E F 12 12,667 E F G 8 10 F G
18 9,117 G 10 8,733 G 16 7,375 G 11 0,5 H19 0 H1 0 H
Tabla 6.2. Agrupamiento de Duncan para áreas bajo la curva – Área de halo de hidrólisis para actividad
quitinolítica en placa.
Con el fin de comparar la medición (mm) de los halos formados a través de los días de
evaluación por cada una de las cepas, se tomaron los datos iniciales sin calcular el área total
de crecimiento del halo durante los 9 días de medición, calculando el promedio de los datos
de diámetro de los halos obtenidos en los cuatro tiempos de medición. De acuerdo al
análisis de varianza realizado, el modelo mostró ser adecuado ya que presentó un p – valor
para la variable cepa de <0.0001, lo que fue confirmado por el R cuadrado obtenido que
establece una variabilidad de los datos del 84%. Por otro lado se observó que las variables
cepa y día incluidas en el modelo resultaron ser válidas pues presentaron un p - valor de
<0.0001. Este resultado coincide con lo esperado, teniendo en cuenta que la medición del
diámetro del halo es diferente en los tiempos de evaluación. Por su parte, la variable réplica
presentó nuevamente un p - valor superior a 0.05 (0.2333), lo que confirmó que las réplicas
no presentaron diferencias significativas entre ellas (Anexo 6). La tabla 6.3 presenta las
comparaciones de los promedios de las mediciones de los halos a lo largo de 9 días de
evaluación entre las diferentes cepas, presentándose una vez más diferencias significativas
entre los resultados que conllevaron a la formación de 6 grupos, en donde se observa que
las cepas 24 y 22 permanecieron en una posición superior en relación a las demás cepas,
como consecuencia de haber presentado los mayores diámetros de halo. Los resultados
48
muestran que el ordenamiento de las cepas y los grupos conformados según el
agrupamiento de Duncan en función de los promedios de los diámetros de los halos, en los
cuatro tiempos de medición es el mismo que el obtenido con los datos para el área bajo la
curva, siendo así buenas aproximaciones para observar el comportamiento general de los
aislamientos en el transcurso del tiempo de evaluación.
Cepa Media Agrupamiento Duncan24 8,1333 A 22 7,5083 A 14 5,8108 B 26 5,75 B 5 3,8542 C
25 3,5833 C D 2 3,2917 C D 4 3,0833 C D E 7 2,8288 D E
27 2,625 D E 0 2,6042 D E
21 2,375 D E F 12 1,9167 E F G 8 1,6771 F G
18 1,5708 G 10 1,5333 G 16 1,3125 G 11 0,125 H19 0 H1 0 H
Figura 6.3. Agrupamiento de Duncan para medición de halo de hidrólisis durante 9 días de evaluación.
Para evaluar las diferencias del comportamiento de las mediciones de los halos del total de
las cepas por día, se realizó un agrupamiento de Duncan que mostró presentar diferencias
significativas entre cada uno de los días de medición. Según los resultados obtenidos, el
tamaño del halo aumentó en función del tiempo, conformándose así 4 grupos, en donde se
evidenció que la mayor variación se presentó entre los días 3 y 5 (Tabla 6.4.). Esto coincide
con lo señalado por Gadelhak y colaboradores (2005) y Tsay y colaboradores (2006),
quienes reportaron un periodo de 5 días para la producción de quitinasas en placa para
Streptomyces sp y actinomicetos en general respectivamente.
49
Día Media Agrupamiento 9 4.3822 A 7 3.4919 B 5 2.6844 C 3 1.4712 D
Tabla 6.4. Agrupamiento de Duncan para días de medición.
Con el fin de realizar la comparación de las cepas dentro de cada uno de los días de
medición, se decidió realizar un nuevo agrupamiento, para cada día de medición se ajustó
un modelo de análisis de varianza. Los p -valor obtenidos para el modelo fueron <0.0001
para todos los días de evaluación, indicándonos que el modelo es bueno y expresa
variabilidad. El mismo resultado fue obtenido para la variable cepa por lo que nuevamente se
infiere que valores de medición estadísticamente significativos fueron obtenidos
dependiendo de cada una de las cepas. En el caso de la variable réplica los valores
obtenidos fueron: 0.1844; 0.1384; 0.5460 y 0.3359, para los días 3, 5, 7 y 9 respectivamente.
Como se observa, se encontraron valores por encima de 0,05, explicando una vez más que
experimentalmente la variable réplica se comporta adecuadamente (Anexo 6).
Las medias de la variable de interés de las cepas fueron agrupadas y comparadas para cada
uno de los días; es así como se obtuvo la formación de distintos grupos dependiendo del día
de medición. En el día 3 se obtuvieron 4 grupos, en el día 5 se formaron 5 grupos y en los
días 7 y 9 se observó la conformación de 6 grupos (Tabla 6.5.).
Como se observa la máxima medición alcanzada al día 9, fue de aproximadamente 11.4
mm, diversos autores señalan que un tamaño de halo significativo debe encontrarse por
encima de los 5 mm (Taechowisan et al., 2003; Shanmugaiah et al., 2008), por lo tanto, bajo
esta condición, solo las cepas 2, 14, 22, 24, 25 y 26 superarían lo que la literatura presenta.
Sin embargo, para efectos del estudio, todas las cepas que presentaron hidrólisis enzimática
fueron seleccionadas para la prueba de antagonismo, teniendo en cuenta que los datos
preliminares no siempre coinciden con la información obtenida en un screening secundario,
que por lo general consiste en pruebas cuantitativas de la enzima secretada por las cepas
en medio líquido, a lo largo de diferentes tiempos de incubación (Gómez et al., 2004). Es
importante resaltar que de las 19 cepas en evaluación, aproximadamente el 53%
50
presentaron actividad quitinolítica en placa superiores a las obtenidas en la cepa control,
para las condiciones de evaluación.
Tabla 6.5. Agrupamiento Duncan para la comparación de halos de hidrólisis de quitina por día.
A pesar que, en los días definidos de medición se obtuvo la formación de diferente número
de grupos, y que estos pertenecían a diversas cepas, los máximos y los mínimos a partir del
día 5 siempre fueron conservados. Se encontraron cepas como las 2, 12, 21, 27 y control, en
las cuales no se evidenció la formación de un halo de hidrólisis al día 3 de medición, pero si
al día 5 de medición; teniendo en cuenta que se trabajaron cepas diferentes, el metabolismo
entre una y otra pudo haber variado generando la hidrólisis de la quitina en diferentes
tiempos; estudios previos con actinomicetos han señalado diferentes tiempos de incubación
para poder evidenciar el halo de hidrólisis, El Fiky y colaboradores (2003) estudiaron un
tiempo de incubación de 3 días para que las zonas de hidrólisis fueran evidenciadas, por el
contrario Ahmadi y colaboradores (2008) y Shamungaiah y colaboradores (2008)
evidenciaron los halos de hidrólisis a los 10 y 5 días de incubación respectivamente. Como
se mencionó anteriormente las variaciones más representativas en relación al tamaño del
halo se presentaron entre los días 3 y 5 de medición, en algunas cepas ésta variación se
51
hizo menos notoria a lo largo del tiempo de evaluación, esto pudo deberse a una
disminución en la producción de quitinasas por efecto de la represión por catabolitos.
Estudios previos realizados por Leisner y colaboradores (2008) demostraron que cuando
adicionaron glucosa a placas con agar quitina se generó una reducción en el tamaño de las
zonas de aclaramiento sugiriendo de esta manera que la actividad quitinasa esta sujeta a la
represión catabólica.
6.3. ESTANDARIZACIÓN DE LA PRUEBA PARA LA EVALUACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA
6.3.1. Determinación del agente precipitante de las proteínas
Con el fin de comparar y seleccionar el agente precipitante que permitiera una mayor
recuperación de proteínas a partir de las muestras de suero albúmina de bovino (acrónimo
del inglés BSA), se evaluaron dos agentes de precipitación: sulfato de amonio (80% de
saturación) y acetona fría. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 6.6.
Agente de precipitación
Concentración BSA mg/ml
Volumen: BSA (ml)
Cantidad BSA (mg) (pre-
tratamiento)
Concentración BSA (mg/ml)
(post-tratamiento)
Cantidad BSA (mg)
(post-tratamiento)
Porcentaje de
recuperación de BSA (%)
Acetona
0,4 1,5 0,6 6,469 6,469 1078,199 0,4 2 0,8 270,479 270,479 33809,819 0,4 3 1,2 323,865 323,865 26988,725 0,8 1,5 1,2 1487,019 1487,019 123918,210 0,8 2 1,6 1133,623 1133,623 70851,450 0,8 3 2,4 1667,105 1667,105 69462,689
Sulfato de amonio 80% saturación
0,4 1,5 0,6 33,455 33,455 5575,758 0,4 2 0,8 123,918 123,918 15489,693 0,4 3 1,2 409,415 409,415 34117,931 0,8 1,5 1,2 41,422 41,422 3451,816 0,8 2 1,6 395,019 395,019 24688,692 0,8 3 2,4 610,486 610,486 25436,921
Tabla 6.6. Evaluación agentes precipitantes de proteínas.
52
Los resultados muestran que tras el proceso de precipitación se recuperó mayor cantidad de
proteína en relación a la cantidad de la cual se partió, obteniéndose por ende porcentajes de
recuperación superiores al 100%. Posiblemente esto pudo haber sido ocasionado por la
acción de interferentes en la reacción de Bradford que pudieron aumentar la lectura de las
absorbancias. Frente a esto, diversas posibilidades han sido sugeridas, Nobel (2000)
encontró que ciertas interacciones proteína – químico y químico – colorante interfieren en el
ensayo; la interferencia de los componentes no protéicos ocurre debido a su habilidad de
generar cambios en los niveles de equilibrio del colorante, bien sea por unión directa o por
modificación del pH. Por otro lado, es posible que la acetona haya generado interferencia en
la reacción debido a que se empleó en una concentración final superior (66.3%)a la sugerida
para el proceso de precipitación (10%) (Nobel, 2000). De igual manera, Bradford (1976)
explica que la acetona genera un cambio de 0.069 en la absorbancia cuando es leída a 595
nm, lo cual equivale a 6.21 µg de albúmina sérica bovina, aumentando en consecuencia el
valor obtenido en la lectura. Otro factor que pudo generar estas alteraciones en los
resultados es el aumento de la temperatura del reactivo Azul de Coomassie Brillante G
cuando éste se encuentra a temperatura ambiente, lo cual puede afectar las medidas de
absorbancia a 595 nm generando un aumento de los valores, y así se aportan falsos
positivos en las lecturas realizadas (Pierce, 2004). En el caso de la precipitación con sulfato
de amonio la interferencia pudo ser ocasionada por la alta concentración de esta sal (4.84
M), ya que no se realizó un proceso de diálisis para eliminar los remanentes del sulfato de
amonio. Bradford (1976) muestra que no se evidencia interferencia cuando este agente
precipitante se encuentra en una concentración de 1M, sin embargo al encontrarse alrededor
de 4 veces más alta, pudo posiblemente generar alteraciones en la reacción. De igual
manera, cabe la posibilidad que al reutilizar celdas para realizar la lectura de las
absorbancias, en la limpieza de éstas puede que no se haya generado una completa
remoción de partículas presentes generando un aumento en los resultados obtenidos
(Pierce, 2004). Finalmente, es importante resaltar que la concentración del stock empleado
no fue confirmada a través de la cuantificación de proteínas por el método de Bradford, lo
cual, en el caso de que la concentración teórica inicial no fuera la real, podría haber
contribuido a la obtención de los elevados porcentajes de recuperación. Teniendo en cuenta
los resultados, es necesario realizar una repetición del ensayo, con el fin de determinar el
agente precipitante que permite obtener los mejores rendimientos. Sin embargo, se decidió
seleccionar la acetona para realizar el proceso de precipitación y así continuar con el
ensayo, debido a la dificultad que presentó la solubilización del sulfato de amonio en la
preparación de la solución saturada empleada para llevar a cabo el proceso de precipitación
y al hecho que la acetona evita tener que realizar un proceso de diálisis.
53
6.3.2. Estandarización de las variables fisicoquímicas para la evaluación de la actividad enzimática
Las quitinasas son normalmente producidas por un amplio rango de microorganismos, en
donde se pueden destacar las bacterias, que participan en el proceso de descomposición de
la quitina liberando como principal producto N-acetilglucosamina, monómero que también
resulta ser una fuente importante de carbono y nitrógeno para los microorganismos
(Donderski y Trzebiatowska, 1999).
Para la evaluación de la influencia que genera el tipo de sustrato sobre la actividad
enzimática y actividad enzimática específica se emplearon las cepas 25 y control. La cepa
25, fue seleccionada aleatoriamente ya que presentaba un diámetro de halo intermedio en
comparación a las demás cepas evaluadas.
Teniendo en cuenta que la actividad quitinolítica puede verse inducida por el uso de
sustratos como quitina coloidal o residuos industriales más complejos como el extracto de
camarón (Sastoque et al., 2007), se realizó un cultivo bajo las condiciones señaladas en la
metodología utilizando medio mínimo líquido suplementado con quitina coloidal al 0.5% (p/v)
y medio mínimo líquido suplementado con quitina en polvo al 1.5% (p/v), según reportes
previos de De la Cruz et al. (1992), el pH del medio fue ajustado a 6.8. El montaje realizado
se muestra en la Figura 6.5, cabe resaltar que se seleccionó un período de 7 días de
incubación, ya que fue el tiempo en el cual se observó la producción más significativa de
quitinasas según la prueba realizada en placa para la cepa 25. La quitina coloidal se utilizó
en una concentración de 0.5% (p/v) debido a que estudios previos han mostrado un nivel
máximo de inducción de la producción de quitinasas en microorganismos como Bacillus sp
NCTV2 (Wen et al., 2002), Alternaria alternata (Sharaf, 2005) y Trichoderma harzianum (El-
Katatny et al., 2000; Sandhya et al., 2005) cuando dicha concentración fue usada
(Shanmugaiah et al., 2008). En los resultados obtenidos, se encontró que una mayor
actividad enzimática fue alcanzada cuando se empleó el medio suplementado con quitina
coloidal como única fuente de carbono (Figura 6.6.) (Anexo 7). Esto es comparable con lo
reportado por Taechowisan y colaboradores (2003) quienes demostraron una alta
producción de quitinasas por S. aureofaciens CMUAc130, empleando quitina coloidal al 1%
(p/v) como sustrato en medio mínimo líquido pH 7, después de 7 días de incubación en
agitación a 30ºC, indicando así la alta especificidad por este sustrato en comparación a otros
54
como quitina cruda, quitina molida y pared celular de Schizosaccharomyces sp. De igual
manera Il’ina et al. (2004) estudiaron la hidrólisis de la quitina empleando una preparación
enzimática a partir de una cepa de Trichoderma reesei, en donde la mayor cantidad de
azúcares reductores se produjo al utilizar quitina tratada con ácido ortofosfórico (quitina
coloidal) como fuente de carbono en comparación a cuando se empleó quitina cristalina en
polvo de concha de cangrejo. La producción de enzimas extracelulares del tipo quitinasas en
un medio de cultivo como éste ocurre debido a la capacidad que tienen los actinomicetos
quitinolíticos para crecer empleando este sustrato como fuente de carbono y nitrógeno, en
donde la producción de estas enzimas puede verse altamente inducida por el polímero como
tal y/o por paredes celulares fúngicas (Trejo et al., 1998; Shanmugaiah et al., 2008).
Figura 6.5. Inducción de quitinasas Cepa 25 y Control, empleando medio quitina coloidal y medio quitina en polvo
La mayor producción de azúcares reductores liberados por acción de las quitinasas
inducidas en el medio quitina coloidal puede deberse a la fácil accesibilidad que presenta
este sustrato para los microorganismos en comparación a la estructura cristalina de la quitina
en polvo (Nawani y Kapadnis, 2005). Los materiales coloidales presentan moléculas que
resultan ser más accesibles para generar la hidrólisis enzimática en relación a sustratos
densos que muestran una organización molecular más cerrada generando una estructura
cristalina (Gómez et al, 2004); al presentar la quitina en polvo un ordenamiento
conformacional regular genera una matriz sólida cristalina, en donde las fuerzas
intermoleculares como lo son los puentes de hidrógeno que pueden formarse entre dos
grupos hidroxilo (HO——HO), el hidrógeno del grupo amida y los oxígenos de los grupos
hidroxilo (HO——HN) y entre los hidrógenos de los hidroxilo y el grupo carbonilo (C=O——
HO) generan una mayor estabilidad a esta estructura (González et al., 2002; Peniche, 2006).
55
Il’ina et al. (2004) establecieron que aparentemente el tratamiento de la quitina con ácido
ortofosfórico genera una pérdida de la disposición regular de las cadenas de N–
acetilglucosamina, aumentando así el número de regiones amorfas y por ende afectando la
estructura cristalina al no presentar un ordenamiento regular, dejando estos puntos más
accesibles a la acción de las hidrolasas. De igual manera, Gómez y colaboradores (2004),
determinaron que utilizando ácido clorhídrico las moléculas de polisacáridos eran inducidas
a su separación en la quitina coloidal, facilitando la accesibilidad a este sustrato por parte de
los microorganismos.
El oxígeno disuelto, favorecido por el volumen de medio de cultivo empleado en relación a la
capacidad del erlenmeyer utilizado para el cultivo, pudo haber influenciado la producción de
quitinasas, y por ende la liberación de N–acetilglucosamina por parte de los aislamientos
evaluados al afectar la fisiología y el metabolismo de los microorganismos aeróbicos,
teniendo en cuenta los reportes de Wang y colaboradores (2008), quienes señalaron que el
oxígeno disuelto incrementa con el decrecimiento del volumen del medio de cultivo a una
velocidad de agitación constante. Por otro lado, el pH y tiempo de incubación empleados en
el estudio pudieron también favorecer la producción de quitinasas en medio mínimo quitina
coloidal por las cepas de actinomicetos evaluadas, lo cual coincide con las condiciones
reportadas por Taechowisan y colaboradores (2003) y con lo señalado por Shanmugaiah y
colaboradores (2008), quienes muestran que la mayoría de bacterias tienen un nivel máximo
de inducción de quitinasas a pH neutro o ligeramente ácido.
Aunque se obtuvieron mejores resultados cuando la quitina coloidal fue empleada, los
valores obtenidos de los análisis realizados en el laboratorio fueron muy bajos o no fueron lo
suficientemente altos en comparación a otros estudios. González-Franco y colaboradores
(2003) presentaron actividades enzimáticas de 33850; 29660; 18590 y 29290 U g-1 en su
estudio con cepas de Streptomyces hygroscopicus y Streptomyces lydicus empleando
quitina coloidal como fuente carbono; por otro lado Hoster y colaboradores (2005) obtuvieron
una actividad enzimática de 250 U g-1 con la cepa MG3 de Streptomyces griseus en medio
mínimo enriquecido con quitina coloidal al 0.7%. Los bajos resultados obtenidos en este
estudio pueden estar asociados con la presencia de quitotriosas y quitobiosas que pudieron
interferir en la producción de quitinasas, haciéndolas indetectables. Otra posibilidad es que
en el medio de cultivo a causa del metabolismo de los actinomicetos se hayan presentado
inhibidores de quitinasas (Donderski y Trzebiatowska, 1999). Por otro lado, la N-
56
acetilglucosamina pudo posiblemente formar un inhibidor catabólico de la síntesis de
quitinasas, tal como ocurre en el caso de la glucosa en la degradación de la celulosa en
relación a la síntesis de celulasas (Donderski y Trzebiatowska, 1999); otros estudios han
mostrado que la producción de quitinasas en los microorganismos es controlada por un
sistema represor-inductor en donde la quitina o los productos de su degradación participan
como inductores o represores según sea el caso; Saito y colaboradores (1998) detectaron
que el gen glk A (gen que codifica para la glucosa kinasa) participa en la represión de la
producción de quitinasas; el estudio se realizó insertando un fragmento de DNA que
contenía este gen en una cepa mutante de Streptomyces lividans, defectuosa para la
represión por glucosa, a partir de esto se encontró que el microorganismo recuperó su
habilidad para emplear la glucosa y generar la represión por glucosa de la producción de
quitinasas (Gohel et al., 2006). De igual manera, Nguyen y colaboradores (1997) señalaron
que los genes que codifican enzimas como las quitinasas son generalmente inducidos por
sustratos poliméricos y por sus productos de degradación, y reprimidos por fuentes de
carbono fácilmente metabolizables tales como la glucosa. Otros autores han reportado este
mismo efecto de represión enzimática en la presencia de azúcares como glucosa, fructosa,
sucrosa, galactosa u otros, reiterando nuevamente la regulación de estas enzimas por un
sistema inductor–represor (Bruce et al., 1995; Sharaf, 2005).
Para cuantificar la cantidad de azúcares reductores y proteínas presentes en el extracto
enzimático tras el proceso de fermentación de cada una de las cepas (25 y control) en los
medios evaluados, se siguieron los métodos de Somogyi Nelson (Anexo 3) y de Bradford
(1976) (Anexo 4) respectivamente, modificados por Rodríguez (2001). Teniendo en cuenta
las interferencias que pueden sesgar los resultados del estudio, se decidió realizar una
cuantificación de azúcares reductores y proteínas en los medios quitina coloidal y quitina en
polvo, sin inocular, tratados bajo las mismas condiciones que los medios inoculados con los
aislamientos; la corrección se realizó restando a las cantidades medidas en la fermentación
con ambas cepas, en cada uno de los medios, los valores obtenidos en la determinación de
los medios sin inocular. En el medio quitina coloidal no se obtuvo una presencia detectable
de proteínas ni azúcares reductores, sin embrago en el medio con quitina en polvo fueron
detectados 1.4 mg mL-1 de proteínas y 0.077 mg mL-1 de azúcares reductores, esto puede
deberse a que posiblemente la quitina empleada puede contener restos protéicos en su
composición según lo estudiado por Peniche (2006), quien señaló que tras los procesos de
desproteinización para la obtención de quitina en polvo puede quedar del 1 al 7 % de
proteína residual.
57
Figura 6.6. Evaluación de la actividad enzimática y específica de las cepas Control (C) y 25.
58
Tras realizar la corrección en la medición, teniendo en cuenta la eliminación de la proteína
medida en el medio sin inocular, se obtuvo que en el medio quitina en polvo se observó una
mayor presencia de proteínas en relación al medio quitina coloidal, sin embargo, como se
mencionó anteriormente se observó mayor actividad enzimática, para los dos aislamientos,
en éste último tratamiento; resultados similares fueron obtenidos por Nawani y Kapadnis
(2005) en la evaluación con tres cepas de actinomicetos. Esto puede deberse a que en el
caso de la quitina coloidal para el tiempo de muestreo puede llegar a presentarse una rápida
producción y represión de quitinasas debido a la fácil accesibilidad que presenta este
sustrato con una mejor y más rápida generación de productos finales obteniéndose de esta
manera una posible moderación en la producción enzimática. El caso contrario puede ocurrir
con la quitina en polvo la cual al ser menos accesible para los microorganismos por su
estructura cristalina y fibrilar puede permitir la liberación inicial de unos bajos niveles de
oligómeros a partir de los cuales se puede generar un buen crecimiento y favorecer el
incremento en la producción de quitinasas y por ende en la degradación de la quitina; esto
puede estar seguido de un progreso en el crecimiento de los microorganismos
permaneciendo así hasta el momento en el que se alcanza una represión por producto final
o el sustrato escasea y se alcanza una fase estacionaria de crecimiento de los
microorganismos (Nawani y Kapadnis 2005).
Con el fin de determinar las condiciones que resultan óptimas para llevar a cabo un
procedimiento de evaluación de la actividad enzimática y la actividad enzimática específica
de quitinasas, se estudió la influencia que tienen las variables: temperatura y proporción
enzima sustrato sobre la evaluación de las actividades mencionadas. La máxima actividad
enzimática en la cepa Control (aproximadamente 0.0015 U) fue obtenida a 40ºC, en las
proporciones enzima-sustrato 1:2 y 1:4 cuando la muestra no fue precipitada y el
microorganismo se incubó en medio suplementado con quitina coloidal, las mismas
condiciones permitieron alcanzar el máximo de actividad enzimática específica para la
misma cepa (60.22 U/g de proteína para la proporción 1:2 y 59.98 U/g de proteína para la
proporción 1:4). En el caso de la cepa 25, la actividad enzimática más alta (0.00175 U) y la
máxima actividad enzimática específica (67.944 U/g proteína), fueron obtenidas cuando se
incubó en medio quitina coloidal, el extracto crudo no se precipitó con acetona, y el montaje
de ensayo de actividad se hizo con una proporción enzima-sustrato 1:1 y la reacción se llevó
a cabo a una temperatura de 50ºC. Los valores de actividad enzimática y actividad
enzimática específica obtenidos para la cepa 25 resultan ser mayores a los presentados con
la cepa control, pudiéndose así relacionar con los resultados obtenidos en la prueba en
59
placa en donde la cepa 25 presentó un diámetro de halo mayor en relación a la cepa
Control. De acuerdo a los resultados obtenidos para los dos aislamientos, no se
evidenciaron diferencias representativas para la actividad enzimática entre las temperaturas
evaluadas (40° y 50ºC). El hecho de detectar actividad enzimática en ambas temperaturas
coincide con lo expuesto en la literatura que señala que las quitinasas son activas a
temperaturas en el rango de los 20° a los 50ºC (Swiontek et al., 2007). De igual manera,
Gomes y colaboradores (2000) mostraron una óptima temperatura entre 40° y 50°C para la
mayor actividad enzimática de quitinasas de Streptomyces sp.
El grado de hidrólisis final está determinado por las condiciones utilizadas en el ensayo de
actividad enzimática, siendo éstas, la concentración de sustrato, la relación enzima/sustrato,
el tiempo de incubación y las condiciones fisicoquímicas tales como el pH y la temperatura
(Benítez et al., 2008). Las proporciones evaluadas (1:1,1:2 y 1:4) no mostraron diferencias
significativas a nivel de actividad (Anexo 7), demostrando de ésta manera que la velocidad
de hidrólisis del sustrato no se alteró por la proporción enzima/sustrato evaluada (García,
2002). Por otro lado se empleó un pH de 6 para la reacción enzima/sustrato, esto es
comparable con lo presentado por Gupta y colaboradores (1995) quienes obtuvieron la
máxima actividad quitinolítica para la quitinasa producida por Streptomyces viridificans a pH
6. Por otro lado Hoster y colaboradores (2005) demostraron en su estudio una óptima
actividad quitinolítica empleando un rango de pH de 5 a 7 al evaluar un extracto de
quitinasas de la cepa MG3 de Streptomyces sp aislada del suelo de Gottingen. Resultados
similares fueron señalados por Boer y colaboradores (1998) quienes observaron una buena
actividad quitinolítica del extracto crudo de una cepa de Streptomyces sp. aislada del suelo
de Midsland, empleando un pH de 6.5 en la reacción enzima/sustrato. Así mismo,
numerosos estudios han mostrado que las quitinasas se caracterizan por presentar una alta
actividad quitinolítica en un rango de pH de 4.5 a 8. Las quitinasas de bacterias han
mostrado presentar una alta actividad a pH 8, en comparación a las secretadas por los
hongos que se ven favorecidas por un pH de 5, estas diferencias están dadas por el
ambiente en el que se desarrollan los microorganismos. Es posible que el pH empleado en
la reacción enzima/sustrato haya favorecido la actividad de las quitinasas debido a que al ser
secretadas por bacterias del suelo presentan preferencia por un pH cercano a la neutralidad
(Swiontek et al., 2007).
60
Con el fin de determinar la influencia del grado de concentración de las proteínas sobre la
actividad enzimática y la actividad enzimática específica se evaluaron tres grados de
concentración de la enzima: 1x, 5x y 10x, bajo un tratamiento de precipitación del extracto
crudo con acetona para el caso de las dos últimas (Anexo 7). Teniendo en cuenta que tras la
evaluación de los agentes precipitantes acetona y sulfato de amonio (numeral 6.3.1.) no se
obtuvieron resultados válidos que permitieran realizar una selección de alguno de estos dos,
se decidió llevar a cabo el proceso de precipitación con acetona teniendo en cuenta la
necesidad de obtener extractos proteicos que conservaran buena actividad enzimática.
Estudios previos realizados por Noval y colaboradores (2004) demostraron que tras la
realización de una precipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4 se produjo una disminución
del 50 % de la actividad específica cuando se trabajo con enzimas β-1,3-glucanasas, en
relación con la obtenida cuando la precipitación fue realizada con acetona, indicando que
esta última resultó ser la más adecuada para conservar la actividad de las enzimas en
evaluación. De igual manera, al determinar la concentración de azúcares reductores en los
extractos obtenidos por ambos métodos de precipitación, encontraron que no se presentaron
diferencias significativas. A pesar que estas enzimas no corresponden a las evaluadas en
este estudio, el mismo efecto de la acetona sobre las quitinasas podría ocurrir.
Adicionalmente, Michail y colaboradores (2006) encontraron una buena recuperación de
proteínas cuando la muestra fue tratada con acetona en relación a cuando fue tratada con
sulfato de amonio. De igual manera, Popova y Pishtiyski (2001) en su estudio encontraron
que tras el tratamiento de una muestra con acetona al 60% se observó una actividad
enzimática de 84.88%, siendo esta superior a la alcanzada con otros agentes de
precipitación; así mismo la mayor actividad específica fue obtenida con la precipitación con
acetona a esta misma concentración. Siguiendo estos estudios y teniendo en cuenta que la
precipitación con acetona presenta la ventaja de disminuir el tiempo de experimentación al
no necesitar el paso de diálisis, pudiendo aumentar la posibilidad de obtener extractos
enzimáticos con mayor actividad, se decidió seleccionar éste agente precipitante para llevar
a cabo el ensayo (Guadarrama y Rivas, 1995).
Los resultados obtenidos para la actividad enzimática tras la precipitación en el medio quitina
coloidal muestran que las cepas en estudio no presentaron diferencias representativas entre
los tratamientos con precipitación y los que no incluían este proceso, sin embargo diversos
efectos de la precipitación sobre la actividad enzimática fueron observados (Anexo 7). Para
las cepas Control a 40 ºC y 25 a 50ºC se presentó una pérdida de la actividad enzimática en
las muestras que fueron tratadas con acetona. Por el contrario, la cepa Control a 50ºC,
61
mostró un aumento en la actividad enzimática poco representativo cuando la muestra fue
precipitada, finalmente en la cepa 25 a 40ºC, no se presentó una tendencia clara de la
relación existente entre el grado de precipitación y la actividad enzimática (Figura 6.6). La
pérdida de actividad enzimática evidenciada, pudo deberse a que se haya generado una
denaturación de las proteínas ocasionada por la acetona, en donde pudo haber interferido
con las interacciones hidrofóbicas presentes en el interior de las proteínas generando la
desestabilización de la estructura proteica (Guadarrama y Rivas, 1995). A pesar que autores
como los mencionados anteriormente, señalan que la acetona resulta ser un buen agente de
precipitación, otros autores han expuesto resultados negativos tras la utilización de éste
agente. Anson y Mirsky (1931), señalaron que la acetona es en general un agente
denaturante efectivo. De igual manera United Nations Environment Programme (2005) han
mostrado pérdidas del 14 % de dicha actividad cuando las soluciones enzimáticas son
tratadas con acetona.
Con el fin de determinar la concentración de proteína presente en el extracto crudo de cada
una de las cepas evaluadas se realizó una cuantificación como se señala en la metodología.
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 6.7. La cepa control presentó una
tendencia acorde con el grado de concentración de proteínas, encontrándose valores
inferiores cuando la muestra fue concentrada 5 veces que cuando fue concentrada 10 veces.
En la cepa 25 igualmente se encontró una tendencia coherente con el grado de
precipitación, sin embargo ésta no fue proporcional a las veces de concentración. La
concentración de proteína obtenida en la cepa Control cuando se empleó medio con quitina
coloidal en el caso en el que no se llevó a cabo un proceso de precipitación, fue de 1.27
mg/mL, al concentrar la enzima cinco veces se habría esperado obtener una concentración
aproximadamente cinco veces mayor a la ya mencionada, sin embargo el aumento de la
concentración de proteína fue mínimo (1.31 mg/mL). El mismo caso se presentó cuando la
enzima fue concentrada diez veces en donde una ligera variación, poco representativa fue
obtenida (1.43 mg/mL). Un comportamiento similar fue observado en la cepa 25, para el
mismo medio de cultivo, resaltando que las concentraciones obtenidas fueron mayores para
ésta última, siendo éstas de 1.29, 1.78 y 2.58 mg/mL para los grados de concentración 1x,
5x y 10x, respectivamente. En el caso de la quitina en polvo para la cepa Control no se
evidenció una concentración de las proteínas tras el tratamiento de precipitación. Para la
muestra no precipitada con acetona, se obtuvo la mayor concentración de proteína, siendo
ésta de 4.63 mg/mL; tras concentrar la enzima cinco veces se observó un descenso no
esperado en la concentración de proteína de 1.36 mg/mL, obteniéndose así una
62
concentración de 3.27 mg/mL. Para el grado de concentración 10x, se obtuvo un aumento
de 0.12 mg/mL en comparación al tratamiento que fue concentrado cinco veces, pero este
valor de concentración no superó el obtenido en el tratamiento sin precipitación. Por el
contario, para la cepa 25 si se obtuvo un efecto de precipitación en las muestras tratadas
con acetona, en la medida en que la concentración más baja fue obtenida para el
tratamiento no precipitado (6.1 mg/mL) pudiéndose así observar el efecto del agente
precipitante sobre las proteínas del extracto crudo, sin embargo no se presentó un
comportamiento proporcional al grado de concentración, obteniéndose así una mayor
concentración de proteínas (49.33 mg/mL) para la muestra concentrada cinco veces, que
para la que fue concentrada diez veces (24.37 mg/mL). Estos bajos resultados obtenidos en
las muestras precipitadas pudieron estar relacionados con la baja actividad enzimática
obtenida, en la medida en que el método no resultó favorable para alcanzar la concentración
esperada de proteína.
CEPA CONTROL
Grado de concentración
Quitina coloidal Quitina en polvo Concentración de proteína (mg/ml) SD Concentración de
proteína (mg/ml) SD
1x 1,27 0,14 4,63 1,47 5x 1,31 0,01 3,27 0,91
10x 1,43 0,13 3,56 3,52
63
CEPA 25
Grado de concentración
Quitina coloidal Quitina en polvo
Concentración de proteína (mg/ml) SD Concentración de
proteína (mg/ml) SD
1x 1,29 0,13 6,1 N.D. 5x 1,78 0,2 49,33 10,3
10x 2,58 0,43 24,37 14
Tabla 6.7. Concentración de proteína extracto crudo, Cepa 25 y Cepa Control. N.D. No determinado.
Por otro lado, la actividad enzimática específica fue determinada (Anexo 7). Los resultados
muestran que la cepa Control a 40ºC no presentó una tendencia acorde con el grado de
concentración de proteínas, encontrándose valores inferiores cuando la muestra fue
concentrada 5 veces en comparación a los obtenidos cuando fue concentrada 10 veces. En
la cepa 25 por el contrario, si se encontró una tendencia coherente con el grado de
precipitación, sin embargo ésta no fue proporcional a las veces de concentración (Figura
6.6). Cuando la reacción enzima/sustrato se llevó acabo a 50ºC la variación obtenida para la
cepa Control no fue apreciable en los tres grados de concentración evaluados. En la cepa 25
por el contrario si se encontró una tendencia coherente en cuanto a la precipitación
realizada, pero ésta no fue proporcional a las veces de concentración (Figura 6.6). Los
resultados confirman nuevamente que la precipitación no resultó ser favorable en el estudio.
En la Figura 6.6 se observa el comportamiento de las barras de error, en donde se observa
el solapamiento de éstas, confirmando que no existe una variabilidad representativa entre
los grados de concentración evaluados, adicionalmente se puede evidenciar que se
64
presentaron diferencias apreciables entre algunas de las réplicas de cada tratamiento para
las cepas evaluadas.
6.4. ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO
Diversas fuentes han señalado a Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. como patógenos asociados
con daños radiculares y aéreos de plantas en diferentes cultivos como pimiento (Ezziyyani et
al., 2004), pepino (Singh et al., 1999) y algodón (Yuan y Crawford, 1995), entre otros,
generando un serio problema en la agricultura al ocasionar grandes pérdidas en cultivos de
gran importancia económica (Zakalyukina y Zenova, 2007). Frente a esta problemática, las
bacterias quitinolíticas cobran importancia por producir un efecto antifúngico sobre el
crecimiento de hongos fitopatógenos, por la acción combinada de quitinasas y otras enzimas
líticas como por ejemplo glucanasas y proteasas (De Boer et al., 1998). Los actinomicetos
son conocidos como fuente de metabolitos secundarios, antibióticos y enzimas líticas, razón
por la cual han sido estudiados como agentes potenciales de control biológico contra hongos
fitopatógenos como Fusarium sp. (Getha et al., 2005). En base a esto se decidió evaluar el
efecto inhibitorio que ejercen cepas quitinolíticas de actinomicetos sobre el crecimiento de
agentes fitopatógenos como Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. por medio de un enfrentamiento
dual entre actinomiceto/hongo. Para su efecto se seleccionaron 14 aislamientos incluyendo
la cepa Control, sin embargo no se evaluaron las mismas cepas para cada uno de los
hongos. El porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) generado por cada una de
las cepas evaluadas con sus respectivas réplicas sobre cada agente fitopatógenos se
muestra en el Anexo 8.
El ensayo de antagonismo in vitro mostró que el 100% de los aislamientos evaluados
presentaron antagonismo en mayor o menor grado frente a los hongos fitopatógenos
Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. en placas de PDA tras 8 días de incubación, para las
condiciones evaluadas. Este valor resulta ser alto en comparación con los resultados
obtenidos por Iznaga y colaboradores (2003), quienes encontraron que de 563 actinomicetos
aislados de suelos cubanos, 286 mostraron producir componentes con actividad antifúngica,
y Valois (1996) quien reportó una inhibición de Phytophthora sp. por el 72% de las cepas de
actinomicetos estudiadas. Duque y Quintana (2008) trabajaron previamente con las cepas
10, 16, 24 y 26 incluidas en este estudio, en donde evaluaron el efecto antagónico de estos
microorganismos sobre Fusarium oxysporum, empleando al igual que en la presente
65
evaluación la técnica de enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo
fitopatógeno, utilizando agar avena e incubando los cultivos a 28 ºC por 5 días. El porcentaje
de inhibición micelial lo determinaron por medio de la comparación de los resultados de
crecimiento radial con los controles del hongo sembrados por punción en el mismo agar bajo
las mismas condiciones de incubación, sin embargo estos autores encontraron un porcentaje
de inhibición micelial de cero. Como se observa, aunque los antagonistas y la técnica
empleada fueron los mismos, es importante tener en cuenta que las condiciones y las cepas
de los agentes fitopatógenos trabajados difirieron; pudo haber ocurrido que el medio
empleado en el presente estudio hubiese favorecido la producción de metabolitos. Whipps
(1987) encontró que el medio de crecimiento empleado genera efectos significativos en la
morfología y en el desarrollo de los patógenos, así mismo en la producción de antibióticos
volátiles y no volátiles producidos por los agentes antagonistas y en las respuestas de los
agentes patógenos a estos antibióticos. De igual manera estudió que el medio afecta la
competencia y las interacciones miceliales entre los patógenos y los antagonistas. Ezziyyani
y colaboradores (2004) también demostraron que el grado de inhibición puede variar por
factores como la temperatura, el pH y el medio de cultivo empleado, demostrando que el
medio PDA intensifica la inhibición. También se ha encontrado que el modo de acción de los
antagonistas varía de acuerdo al tipo de fitopatógeno enfrentado; De Boer y colaboradores
(1998) en su estudio demostraron que el 12% de las bacterias quitinolíticas antagonistas
generaron inhibición de Fusarium oxysporum, mientras que el 56% inhibió el crecimiento
micelial de Fusarium culmorum. Por su lado Gomes y colaboradores (2000), en su ensayo
de inhibición de crecimiento micelial de agentes fitopatógenos por cepas de actinomicetos,
encontraron la inhibición total del crecimiento de Fusarium solani, Fusarium graminearum y
Fusarium oxysporum, mientras que para Fusarium sp. no se observó inhibición alguna.
Se realizó un análisis de varianza con el fin de evaluar el modelo en general para cada uno
de los fitopatógenos evaluados. En el caso de Rhizoctonia sp. se presentó un p-valor
<0.0001 indicando que el modelo es estadísticamente significativo. Adicionalmente, para la
variable cepa se obtuvo un p – valor <0.0001 mostrando que hay variabilidad entre las cepas
evaluadas. Por otro lado se encontró que las réplicas no presentaron entre sí diferencias
significativas arrojando un p – valor de 0.2232 confirmando que actuaron como tales en el
estudio (Anexo 9).
La tabla 6.8 muestra la comparación de las medias de los porcentajes de inhibición entre las
cepas, a través de un agrupamiento de Duncan en donde se observa la formación de cuatro
grupos; el mayor porcentaje promedio de inhibición se presentó en las cepas 11, 7 y 4
66
(Figura 6.7), presentando valores de 84.44; 74.07 y 68.89% respectivamente; por el contrario
las cepas 24, 18, 26 y 2 (Figura 6.8.) mostraron los PICR más bajos con resultados de 35.56;
30.00; 25.56 y 20.00 respectivamente. La figura 6.9 muestra el crecimiento de Rhizoctonia
sp. sin mostrar influencia de ningún agente antagónico.
Cepa Media Agrupamiento 11 84,440 A 7 74,074 A B 4 68,889 A B
22 67,778 B 0 67,407 B
12 64,444 B C 16 58,889 B C D 10 48,889 C D E 1 44,433 D E F
25 43,703 D E F 24 35,556 E F G18 30,000 F G26 25,556 G2 20,000 G
Tabla 6.8. Agrupamiento de Duncan de los promedios de los porcentajes de inhibición de crecimiento radial, para Rhizoctonia sp. enfrentado a los aislamientos de actinomicetos.
Figura 6.7. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para cepas de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición.
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F
A
e
0
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P
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Figura 6.8. Técnporcentajes de in
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Las
ara
12
68
y 11 (Figura 6.10) con los siguientes valores: 86.67; 84.17; 82.50; 80.83 y 80.00%
respectivamente y los más bajos para la cepa 18 (Figura 6.11) con un porcentaje de 35.83.
La figura 6.12 muestra el crecimiento libre de Fusarium sp.
Cepa Media Agrupamiento
7 86,667 A
8 84,167 A B
16 82,500 A B
12 80,833 A B
11 80,000 A B
5 78,333 B
25 66,667 C
0 64,167 C D
22 57,500 D
4 56,667 D
2 48,333 E
24 45,833 E
26 41,667 E F
18 35,833 F Tabla 6.9. Agrupamiento de Duncan de los promedios de los porcentajes de inhibición de crecimiento radial, para Fusarium sp. enfrentado a los aislamientos de actinomicetos.
Figura 6.10. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición micelial.
69
Figura 6.11. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas de actinomicetos con el más bajo porcentaje de inhibición.
Figura 6.12. Crecimiento libre de Fusarium sp. en medio YGC.
De las 13 cepas evaluadas en el enfrentamiento dual contra los hongos fitopatógenos, el
30.77% presentaron inhibiciones miceliales contra Rhizoctonia sp. superiores a las
evidenciadas con la cepa Control, y el 53.85% superaron esta última en el enfrentamiento
contra Fusarium sp. (Figura 6.13).
Figura 6.13. Técnica de enfrentamiento dual actinomiceto/hongo para la cepa control, A. 67.41% de inhibición micelial de Rhizoctonia sp. B. 64.17% de inhibición micelial de Fusarium sp.
Se determinó la correlación entre las variables porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp.,
porcentaje de inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de
70
quitinasas evaluadas en el numeral 6.2.2.3. Los valores obtenidos se muestran en la Tabla
6.10.
Correlación de Pearson PICR Rhizoctonia
sp. PICR
Fusarium sp. ABC Producción de
Quitinasas PICR Rhizoctonia sp. 1 1
PICR Fusarium sp. 0,76946435 1 ABC Producción de Quitinasas -0,26455377 -0,50516172 1
Tabla 6.10. Correlación Pearson para porcentaje de inhibición de crecimiento radial para Rhizoctonia sp. y Fusarium
sp. y área bajo la curva de producción de quitinasas en ensayo en placa.
Los resultados muestran que la correlación más baja se presentó entre las variables área
bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp.,
ya que el valor fue cercano a cero, adicionalmente se observa que la correlación presenta un
valor negativo lo que indica una relación inversamente proporcional entre las dos variables.
Por su parte una correlación media fue establecida para las variables porcentaje de
inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de quitinasas, de igual
manera en este caso la correlación indicó una relación inversamente proporcional. La
correlación más alta se encontró entre las variables PICR para Rhizoctonia sp. y PICR para
Fusarium sp., indicando una relación directamente proporcional. Los resultados muestran
que no existe una correlación significativa entre la producción de quitinasas evaluadas en la
prueba semicuantitativa y la inhibición de crecimiento radial generada sobre los agentes
fitopatógenos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. Es probable que la inhibición del crecimiento
de los fitopatógenos esté dada por acción de otros compuestos antifúngicos y no
propiamente por enzimas hidrolíticas de tipo quitinasas (Prapagdee et al., 2008). Es
importante mencionar que en el momento en el que se inoculó el agente fitopatógeno, el
microorganismo antagonista ya se encontraba esporulado al llevar 11 días de incubación
previa, esto con el fin de seguir lo reportado por Duque y Quintana (2008) quienes
recomiendan dar una ventaja al antagonista para la colonización del medio, con el fin de
esperar la generación y difusión de metabolitos con actividad antifúngica en el medio
(amensalismo). De igual manera, De Boer y colaboradores (1998) mostraron que se
presentaba una mejor inhibición del agente fitopatógeno cuanto éste se inoculó una semana
después de que el microorganismo antagonista había sido sembrado. El hecho de haber
observado la esporulación de los microorganismos, permite intuir que éstos se encontraban
en la fase estacionaria de su crecimiento. Augustine y colaboradores (2005) encontraron que
la producción de antibióticos usualmente ocurre en la fase estacionaria pudiéndose así
71
suponer que la inhibición de los agentes fitopatógenos pudo estar relacionada con éstos
metabolitos secundarios, sumado al hecho de que la producción de antibióticos forma parte
de la transición de las células vegetativas a propágulos en actinomicetos como
Streptomyces sp. (Duque y Quintana, 2008).
Todos los actinomicetos evaluados que mostraron presentar inhibición micelial de los
agentes fitopatógenos exceptuando las cepas 11 y 1 presentaron actividad quitinolítica para
el ensayo en placa. De acuerdo al análisis de correlación realizado entre el área bajo la
curva calculado para las quitinasas en la prueba semicuantitativa y el PICR para los agentes
fitopatógenos evaluados, se observa que en general las cepas que presentaron una mayor
actividad quitinolítica en placa mostraron la menor inhibición micelial de los hongos Fusarium
sp. y Rhizoctonia sp. De Boer y colaboradores (1998) señalaron que a pesar de evidenciar la
producción de enzimas del tipo quitinasas, en algunos casos el hongo a controlar no resulta
ser afectado, indicando de esta manera que la producción de estas enzimas no genera
siempre a un efecto antifúngico. Por otro lado, el caso contrario fue observado; cepas como
la 11, 7 y 16 que presentaron halos de hidrólisis de quitina con diámetro inferiores en
comparación a las otras cepas evaluadas, mostraron un alto porcentaje de inhibición en la
prueba del enfrentamiento dual, observándose de ésta manera un comportamiento inverso al
esperado. En aquellos casos en los que la inhibición del crecimiento micelial no estuvo
relacionada con la producción de quitinasas, pudieron haberse presentado mecanismos
alternos, tales como la producción de antibióticos y productos tóxicos para los hongos, los
cuales se difunden en el medio generando una pigmentación del mismo (Valois 1996), tal
como se observa en la figura 6.14. En los resultados obtenidos se observó que el
crecimiento hifal, en muchos de los casos, fue reducido lejos de donde se encontraba el
actinomiceto crecido, este efecto pudo ser evidenciado de manera más notoria en la
inhibición del crecimiento radial de Rhizoctonia sp. con las cepas 11, 4 y 7, y en las cepas
11, 12, 16 y 8 en el enfrentamiento contra Fusarium sp. De Boer y colaboradores (1998)
encontraron la producción de componentes antifúngicos como antibióticos por parte de
bacterias, los cuales se difunden en el medio y generan este efecto. Otra posibilidad pudo
haber sido la competencia por hierro a través de la producción de sideróforos y la
competencia por colonización de espacio y nutrientes principalmente (Gomes et al., 2000;
Whipps, 2001); sin embargo, no es muy probable que una competencia por nutrientes se
haya presentado, ya que coincidiendo con lo que reportan De Boer y colaboradores (1998) el
hongo pudo haber obtenido todos sus requerimientos nutricionales a partir del disco de agar
en donde se encontraba previamente sembrado. Resultados similares fueron obtenidos por
72
estos últimos autores mencionados, quienes en su ensayo con bacterias quitinolíticas y su
efecto antagónico sobre Phoma exigua por medio de la técnica de la doble capa de agar,
demostraron que el efecto inhibitorio no siempre estaba acompañado por la actividad de las
quitinasas, encontrando cepas que produjeron estas enzimas sin generar un efecto negativo
sobre la formación del micelio fúngico. Por otro lado, Saito y colaboradores (1998) en su
estudio con Streptomyces lividans mostraron que la presencia de glucosa puede generar la
inhibición de la producción de quitinasas. De igual manera Tweddell y colaboradores (1994),
en la evaluación con Stachybotrys elegans, evidenciaron una producción de quitinasas
significativamente baja cuando el medio fue suplementado con glucosa, sucrosa y N-
acetilglucosamina, en ausencia de quitina; esto pudo haber afectado el presente estudio, ya
que al haber empleado un medio de cultivo con alto contenido de glucosa como el PDA se
pudo haber generado la represión de la producción de estas enzimas. Resulta importante
señalar que el medio empleado no presentaba ningún sustrato inductor para la producción
de quitinasas excepto el micelio fúngico, el cual no necesariamente promueve la secreción
de estas enzimas por parte del antagonista. De Boer y colaboradores (1998) evaluaron si la
producción de quitinasas se veía inducida por la presencia del agente fitopatógeno Phoma
exigua el cual es altamente sensible al ataque de éstas enzimas, encontrando que ninguna
de las bacterias evaluadas fue capaz de lisar la hifa madura del hongo en agar agua.
Figura 6.14. Difusión de metabolitos secundarios en agar PDA, cepa 4.
Para poder determinar si existe una correlación entre la producción de quitinasas y el efecto
antagónico, sería conveniente proporcionar las condiciones necesarias para que el
actinomiceto secretara las quitinasas y posteriormente éstas generaran un efecto inhibitorio
sobre el crecimiento de los hongos fitopatógenos. Para esto podría emplearse la técnica de
la doble capa de agar, utilizando una capa de base de medio mínimo suplementado con
73
quitina coloidal, de manera tal que las quitinasas se vieran inducidas, y que al adicionar la
segunda capa éstas se difundieran en el medio de cultivo, ésta segunda capa podría ser de
agar PDA ya que éste mostró ser un medio óptimo para el crecimiento de los hongos
fitopatógenos evaluados. De esta manera, posterior a la inoculación se podría realizar un
seguimiento del crecimiento radial empleando como control la misma técnica pero
reemplazando el medio base por uno con otra fuente de carbono como por ejemplo glucosa.
Otra posibilidad, sería emplear extracto enzimático obtenido de una inducción previa con
quitina coloidal tal como lo reportan Prapagdee y colaboradores (2008), difundiéndolo sobre
un medio favorable para el desarrollo del agente fitopatógeno e inoculando posteriormente
un disco de agar con el hongo previamente crecido y observar de ésta manera la inhibición
del crecimiento radial de éste. El hecho de emplear un extracto enzimático que se encuentra
libre de células limitaría los mecanismos de antagonismo basados en producción de
metabolitos secundarios. Por otro lado, con el fin de obtener resultados más certeros se
podría realizar la purificación total o parcial de las enzimas quitinolíticas, para así poder
determinar si realmente la inhibición del crecimiento de los agentes fitopatógenos es
generada por la acción de estas enzimas hidrolíticas, tal como lo han realizado diversos
autores (Gupta et al., 1995; Mukherjee y Sen, 2006).
Las cepas de actinomicetos evaluados mostraron inhibir a los dos hongos fitopatógenos
evaluados, indicando que el mecanismo de acción de estos microorganismos puede
corresponder a actividades antifúngicas de amplio espectro y no específicas para un solo
tipo de microorganismo. Sin embargo, los PICR de Fusarium sp. resultaron ser mayores en
relación a los PICR obtenidos cundo se enfrentó el actinomiceto con Rhizoctonia sp. La
mayor susceptibilidad de Fusarium sp. pudo deberse a su lento crecimiento, lo que permite
que haya una mayor acumulación de metabolitos secundarios generados por la cepa
bacteriana en el medio de cultivo de enfrentamiento. De igual manera podría suponerse
nuevamente que el mecanismo de acción de los antagonistas fue mediado por la acción de
antibióticos, ya que se ha reportado que la producción de estos metabolitos secundarios
puede variar entre especies e incluso entre cepas bacterianas (De Boer et al., 1998).
Es importante tener presente que no puede excluirse que las quitinasas hayan contribuido a
la actividad antifúngica evidenciada en este estudio en aquellas cepas en las que por medio
de la prueba semicuantitativa se observó la producción de estas enzimas. Es posible que se
haya generado una sinergismo durante la interacción en el proceso de inhibición de los
74
crecimientos miceliales de los hongos fitopatógenos entre las enzimas del tipo quitinasas y
los metabolitos antifúngicos, y/o entre diversas enzimas hidrolíticas tales como proteasas y/o
β-1,3-glucanasas (De Boer et al., 1998), teniendo en cuenta que la correlación entre los
porcentajes de inhibición de crecimiento radial y los valores de área bajo la curva para
producción de quitinasas no fue significativa. De igual manera, Valois (1996) postuló una
posibilidad con respecto a este mecanismo de sinergia, en donde sugiere que posiblemente
los metabolitos antifúngicos podrían evitar el crecimiento de Phytophtora sp. perjudicando su
mecanismo de defensa, mientras las enzimas hidrolíticas, por degradación de la pared
celular podrían contribuir a la lisis celular del patógeno y adicionalmente proveer nutrientes
adicionales a la población antagonista. Por el tipo de investigación desarrollada, dichas
sustancias no fueron identificadas por lo que no se llegó a dilucidar la razón por la que
dichos resultados fueron obtenidos.
75
7. CONCLUSIONES
• El 83% (19 de 23) de los aislamientos de los actinomicetos evaluados mostraron
halo de hidrólisis en el medio quitina coloidal durante el screening inicial.
• La quitina coloidal al 1% resultó ser la concentración más baja que permitió la mejor
visualización de la hidrólisis enzimática en la prueba semicuantitativa en placa.
• El 53% de las cepas evaluadas en la prueba semicuantitativa presentaron
actividades quitinolíticas superiores a las obtenidas con la cepa control, por lo que
pueden ser tenidas en cuenta para estudios posteriores.
• Las cepas 22 y 24 mostraron la mayor hidrólisis de la quitina coloidal en el ensayo
semicuantitativo en placa, con promedios de diámetros de halos de hidrólisis de 8.13
y 7.50 mm respectivamente, presumiendo la posibilidad de ser cepas con alta
actividad quitinolítica.
• Factores como la temperatura y la proporción enzima/sustrato en la prueba
cuantitativa de actividad quitinolítica no mostraron un efecto notorio sobre la
actividad enzimática y actividad enzimática específica evaluadas para la cepa 25 y
control, de igual manera la precipitación con acetona de los extractos enzimáticos de
cada una de las cepas evaluadas mostró no concentrar las proteínas en la medida
esperada.
• En el medio mínimo líquido suplementado con quitina coloidal se obtuvieron
mayores valores de actividad enzimática y actividad enzimática específica en
comparación al medio mínimo líquido suplementado con quitina en polvo, por esta
razón resulta ser apropiado para la evaluación de la actividad quitinolítica en cepas
de actinomicetos a las condiciones evaluadas en este estudio.
76
• El ensayo de antagonismo in vitro permitió evidenciar la capacidad de las cepas
evaluadas para inhibir el crecimiento de Rhizoctonia sp y Fusarium sp con
promedios de porcentajes de inhibición desde 20 hasta 84.4% y desde 35.83 hasta
86.67%, respectivamente.
• La cepa 11 presentó el máximo porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR)
contra Rhizoctonia sp siendo éste de 84,44%, por su lado el PICR más alto (86,67%)
en el antagonismo contra Fusarium sp fue obtenido con la cepa 7.
• Las cepas en general presentaron una actividad antifúngica no específica por
especie de patógenos ya que la correlación de la inhibición entre los dos agentes
fitopatógenos fue representativa. Sin embargo, no se encontraron valores
significativos de correlación entre la actividad quitinolítica y la actividad antagónica
de los actinomicetos evaluados.
77
8. RECOMENDACIONES
• Evaluar el efecto de diversas fuentes de nitrógeno orgánicas como la Peptona, la
caseína hidrolizada y el extracto de levadura e inorgánicas como el nitrato de
amonio o el sulfato de amonio, con el fin de determinar si pueden generar un efecto
de estimulación en la inducción de quitinasas.
• Repetir el ensayo de concentración de proteínas por el método de precipitación
empleando sulfato de amonio y acetona, y si es el caso evaluar otros posibles
agentes precipitantes, tales como ácido tricloroacético (TCA), cloroformo, metanol,
etanol o propanol, determinando de esta manera el agente precipitante que permite
la más alta recuperación de proteínas y la mayor conservación de la actividad
enzimática.
• Teniendo en cuenta que las muestras empleadas para realizar un análisis de
proteínas resultan ser un factor determinante, sería importante incluir un paso de
diálisis tras el proceso de precipitación de proteínas con sulfato de amonio, con el fin
de eliminar restos de esta sal del precipitado, de manera tal que al llevar a cabo la
reacción enzima sustrato se evite la presencia de interferencias como las señaladas
en este estudio en los valores de las mediciones y, en caso tal, en los procesos de
purificación subsiguientes.
• Realizar la purificación de las quitinasas por medio de técnicas cromatográficas,
llevando a cabo un seguimiento de su estado de pureza por medio de una
electroforesis y teniendo en cuenta la conservación de su actividad a lo largo de las
etapas, con el fin de poder observar el efecto directo de estas sobre el crecimiento
fúngico de manera tal que se logre dilucidar el grado de participación de estas
enzimas en los resultados obtenidos en este estudio tras el ensayo de antagonismo
in vitro.
• Repetir el ensayo de la estandarización de las variables físico/químicas para la
evaluación de la actividad enzimática, considerando las temperaturas citadas en
este estudio e incluyendo la evaluación a 37ºC con diferentes tiempos de incubación
(30, 60 y 120 minutos). Adicionalmente emplear valores de pH en una rango de 5 a
78
7, lo cual ha sido reportado por otros autores para determinar la influencia que
presentan éstos en la actividad enzimática.
• Realizar una curva de actividad de quitinolítca (cuantitativa) en función del tiempo (0
a 15 días) para las cepas utilizadas en la estadarización del ensayo de actividad
cuantitativa, para establecer los días óptimos de muestreo para la evaluación de las
cepas en estudio.
79
9. BIBLIOGRAFÍA
• Aizawa, S., Seto, H., Otaka N. 1982. Capsimycin, an antibiotic active against
phytopathogenic fungi. Kyoto: First International Congress of Pesticide Chemistry
(IUPAC).
• Aceves, M., Otero-Sánchez, M.A., Rebolledo-Domínguez, O., Lezama-Gutiérrez, R., Ochoa-Moreno, M.E. 2005. Producción y efecto antagónico de quitinasas y
glucanasas por Trichoderma spp., en la inhibición de Fusarium subglutinans y
Fusarium Oxysporum in vitro. Revista Chapingo 11: 273-278.
• Ahmadi, K., Yazdi, T., Najafi, M., Shahverdi, A.R., Faramarzi, M.A., Zarnini, G., Behravan, J. 2008. Optimization of Medium and Cultivation Conditions for Chitinase
Production by the Newly Isolated: Aeromonas sp. Biotechnology. 7: 266-272.
• Aloise, P., Lumme, M., Haynes, C. 1996. N-acetyl D-glucosamine production from
chitin waste using chitinase from Serratia marcescens. Muzzarelli RAA (ed) Chitin
enzymology. 2: 581–594.
• Álvarez-Solis, J., Anzuelo-Martínez, M. 2004. Actividad microbiana del suelo bajo
diferentes sistemas de producción de maíz en los altos de Chiapas, México. Ensayo
de Agrociencia, 38: 13-22.
• Álvarez, A., Del Barrio, G. 2008. Propiedades antivirales de plantas del género
Phyllanthus. Universidad de La Habana. Facultad de Biología.
[Online].http://www.bvs.sld.cu/revistas/far/vol42_1_08/far11108.htm. Acceso 20 de
Enero de 2009.
80
• Ames, R.N. 1989. Mycorrhiza development in onion in response to inoculation with
chitin-decomposing actinomycetes. New Phytologist-Journal Information. 112: 423-
427.
• Anderson, A., Wellington E. 2001. The taxonomy of Streptomyces and related
genera. International Journal of systematic and evolutionary. Microbiology. 51: 797-
814.
• Antoun, H., Prevost, D. 2005. Ecology of plant growth promoting rhizobacteria. En:
Siddiqui, Z.A. (ed) PGPR: Biocontrol and Fertilization. Springer. Canada.Págs. 1-38.
• Anson, L., Mirsky, A.E. 1931. Protein Coagulation and Its Reversal Serum Albumin.
The Journal of General Physiology. 13: 469-476.
• Atlas, R. 2002. Ecología microbiana y microbiología ambiental. Cuarta Edición.
Madrid, España. pp. 677.
• Augustine, S., Bhavsar, S., Kapadnis, B. 2005. Production of a growth dependent
metabolite active against dermatophytes by Streptomyces rochei AK 39. Indian
Journal of Medical Research. 121: 164-170.
• Bárta, J., Manova, V., Divis, J. 2007. Effect of low-molecular additives on
precipitation of potato fruit juice proteins under different temperatura regimes. Journal
of Food Process Engineering. 31: 533–547.
• Beaulieu, C. 1996. Glucanolytic Actinomycetes Antagonistic to Phytophthora
fragariae var. Rubi, the Causal Agent of Raspberry Root Rot. Applied and
Environmental Microbiology. 62: 1630-1635.
• Benítez, T., Rincón, A., Limón, M., Codón, A. 2004. Biocontrol mechanisms of
Trichoderma strains. International Microbiology. 7:249-260.
81
• Benítez, R., Ibarz, A., Pagan, J. 2008. Hidrolizados de proteína: procesos y
aplicaciones. Acta Bioquímica Clínica. Latinoamericana. [Online].
http://www.scielo.org.ar/scielo. Acceso 16 de Enero de 2009.
• Benson, D.R., Silvester, W.B. 1993. Biology of Frankia strains, actinomycete
symbionts of actinorhizal plants. Microbiology Reviews. 57:293-319.
• Berg, G., Fritze, A., Roskot, N., Smalla, K. 2001. Evaluation of potential biocontrol
rhizobacteria from different host plants of Verticillium dahliae Kleb. Journal of Applied
Microbiology. 91: 963-971.
• Bhattacharya, D., Nagpure, A., Gupta, R. 2007. Bacterial Chitinases: Properties
and Potential. Critical Reviews in Biotechonology. 27: 21-28.
• Bhushan, B., Hoondal, G. 1998. Isolation, purification and properties of a
termostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp. BG-11. Biotechnology letters.
20: 157-159.
• Blaak, H., Schnellmann, J., Walter, S., Henrissat, B., Schrempf, H. 1993. Characteristics of an exochitinase from Streptomyces olivaceoviridis, its
corresponding gene, putative protein domains and relationship to other chitinases.
European Journal of Biochemistry. 214: 659-669.
• Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry. 72: 248-258.
• Brissio, P. 2005. Evaluación preliminar del estado de contaminación en suelos de la
provincia del Neuquén donde se efectúan actividades de explotación
hidrocarburífera. Tesis Saneamiento y Protección Ambiental. Universidad Nacional
82
del Comahue, Argentina. [Online.] http: //www.tesis.bioetica.org/pab7.htm. Acceso 10
de Enero del 2009.
• Bruce, A., Srinivasan, U., Staines, H., Highley, T. 1995. Chitinase and
Laminarinase Production in Liquid Culture by Trichoderma spp. and their Role in
Biocontrol of Wood Decay Fungi. International Biodeterioration & Biodegradation.
Págs: 337-353.
• Cavaletti, L., Monciardini, P., Bamonte, R., Schumann, P., Rohde, M., Sosio, M., Donadio, S. 2006. New Lineage of Filamentous, Spore-Forming, Gram-Positive
Bacteria from Soil. Applied and Environmental Microbiology. 72: 4360-4369.
• Chen, J., Lee, M. 1995. Enhanced production of Serratia marcescens chitinase in
PEG/ dextran aqueous two phase systems. Enzyme and microbial Technology. 17:
1021-1027.
• Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clément, C., Barka, E. 2005. Use of Plant
Growth-promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms
of Action, and Future Prospects. Applied and Environmental Microbiology. 71: 4951-
4959.
• Crawford, D., Lynch, J., Whipps, J., Ousley, M. 1993. Isolation and
Characterization of Actinomycete Antagonists of a Fungal Root Pathogent. Applied
and Environmental Microbiology. 59: 3899-3905.
• Dahiya, N., Tewari, R., Tiwari, R., Hoondal, G., 2005. Chitinase Production in Solid-
State Fermentation by Enterobacter sp.NRG4 Using Statistical Experimental Design.
Current Microbiology. 51: 222-228.
• Dahiya, N., Tewari, R., Hoondal, G. 2006. Biotechnological aspects of chitinolytic
enzymes: A review. Applied Microbiology and Biotechnology. 71: 773-782.
83
• De Boer, B., Gunnewiek, K., Lafeber, P., Janse, J., Spit, B., Woldendorp, J. 1998. Antifungal properties of chitinolytic dune soil bacteria. Soil Biology and
Biochemistry 30:193-203.
• De la Cruz, J., Hidalgo-Lora, J., Benitez, T., Pintor, J., Llobell, A. 1992. Isolation
and characterization of three chitinases from Trichoderma havzianum. European
Journal of Biochemistry. 206: 859-867.
• Di Pietro, A., Lorito, M., Hayes, C.K., Broadway, R.M., Harman, G.E. 1993. Endochitinase from Gliocladium virens: Isolation, Characterization, and Synergistic
Antifungal Activity in Combination with Gliotoxin. Phytopathology. 83: 308-313.
• Donderski, W., Trzebiatowska, M. 1999. Chitinase Activity Production by
Planktonic, Benthic and Epiphytic Bacteria Inhabiting the Moty Bay of the Jeziorak
Lake (Poland). Polish Journal of Environmental Studies. 8: 215-220.
• Duñabeitia, M., Iturritxa, E., Gonzalez, C., Lasuen, U., Zabala, J., Urkiri, K., Guijo, J. 2007. Control biológico de los patógenos Fusarium circinatum y
Sphaeropsis sapinea mediante la utilización de especies fúngicas antagonistas.
Universidad del país Vasco. pp 21
• Duque, C.; Quintana, M. 2008. Determinación Preliminar de la Actividad Promotora
de Crecimiento Vegetal de Actinomycetes Aislados de Suelo. Trabajo de grado.
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá. Director. Marcela Franco Correa. Co
director. María Ximena Rodríguez. pp.. 126.
• El-Fiky, Z., Mansour, S., El-Zawhary, Y., Ismail, S. 2003. DNA-fingerprints and
phylogenetic studies of some chitinolytic actinomycete isolates. Biotechnology. 2:
131-140.
84
• El-Katatny, M.H., Somitsch, E., Robra, K., El-Katatny, M.S., Gübitz, G. 2000. Production of Chitinase and β-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for Control
of the Phytopathogenic Fungus Sclerotium rolfsii. Food Technology and
Biotechnology. 38: 173–180.
• El-Nakeeb, M., Lechevalier, H. 1962. Selective Isolation of Aerobic Actinomycetes.
Applied Environmental Microbiology. 11: 75-77.
• Ezziyyani, M., Pérez, C., Requena, M., Ahmed, A., Candela, M. 2004. Evaluación
del biocontrol de Phytophthora capsici en pimiento (Capsicum annuum L.) por
tratamiento con Burkholderia cepacia. Anales de Biología. 26: 61-68.
• Ezziyyani, M., Pérez, C., Requena, M., Rubio, L., Candela, M. 2004. Biocontrol por
Streptomyces rochei –Ziyani-, de la podredumbre del pimiento (Capsicum annuum
L.) causada por Phytophthora capsici. Anales de Biología. 26: 69-78.
• Fermino, A., Silva, C., Silva, M., Perez, J., Almeida, N. 2006. Soil Streptomycetes
with in vitro activity against the Yam pathogens Curvularia eragrostides and
Colletotrichum gloeosporioides. Brazilian Journal of Microbiology. 37: 456-461.
• Fialho de Oliveira, M. 2003. Identificação e caracterização de actinomicetos
isolados de processo de compostagem. Tesis de maestría, Universida de Federal do
Rio Grande do Sul, Porto Alegre. Director: Sueli T. Van Der Sand. Coodirector: José
Carlos Germani.
• Franco-Correa, M. 1999. Aislamiento, Caracterización y Evaluación de
Actinomycetes inhibidores de algunos hongos fitopatógenos. Tesis de Maestría en
Microbiología, Departamento de química, Instituto de Biotecnología, Universidad
Nacional de Colombia. Director: Hernando Valencia. pp.86.
85
• Franco, L. 2007. Enzimas: Qué Son y Para Que Sirven Revista Real Academia de
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, Universidad de Valencia. 101: 399-417.
• Franco-Correa, M. 2008. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias.
Departamento de Microbiología Industrial. Comunicación personal.
• Fray, R. 2002. Altering plant-microbe interaction through artificially manipulating
bacterial quorum sensing. Annals of Botany 89: 245–253.
• Gadelhak, G, El-Tarabily, K., Al-Kaabi, K. 2005. Insect Control Using Chitinolytic
Soil Actinomycetes as Biocontrol Agents. International Journal of Agriculture and
Biology.7: 627-633.
• García, A., Balbín, M., Cabrera, J., Castelvi, A. 2002. Actividad
Endopoligalacturonasa de un preparado de la levadura Kluyveromices marxianus
Aislada de la Pulpa del Café. Cultivos Tropicales. 23: 67-72.
• Garcés De Granada, E., Orozco De Amézquita, M., Bautista, G., Valencia, H. 2001. Fusarium Oxysporum: El Hongo Que Nos Falta Conocer. Acta Biológica
Colombiana. 6: 1-2.
• Getha, K., Vikineswary, S., Wong, W.H., Seki, T., Ward, A., Goodfellow, M. 2005. Evaluation of Streptomyces sp. Strain g10 for suppression of Fusarium wilt and
rhizosphere colonization in pot-grown banana plantlets. Journal of Industrial
Microbiology Biotechnology. 32: 24-32.
• Ghanem, N., B., Sabry, S.A., El-sherif, Z, M., Abu El-Ela, G.A. 2000. Isolation and
Enumeration of marine Actinomycetes from seawater and sediments in Alexandria.
Applied and Environmental Microbiology. 46: 105-111.
86
• Gohel, V., Singh, A., Vimal, M., Ashwini, P., Chhatpar, H.S. 2006. Bioprospecting
and antifungal potential of chitinolytic microorganisms. African Journal of
Biotechnology. 5: 54-72.
• Gomes, R., Semeado, S., Linhares, A., Guimara, A., Alviano, C., Linhares, L., Coelho, R. 1999. Efficiency of the dispersion and differential centrifugation technique
in the isolation of chitinolytic actinomycetes from soil. World Journal of Microbiology
and Biotechnology 15: 47-50.
• Gomes, R., Semedo, L., Soares, R., Alviano, C., Linhares L., Coelho, R. 2000. Chitinolytic activity of Actinomycetes from a cerrado soil and their potential in
biocontrol. Letters in Applied Microbiology. 30: 146-150.
• Gomes, R., Semedo, L., Soares, R., Linhares L., Ulhoa, C., Alviano, C., Coelho, R. 2001. Purification of a thermostable endochitinase from Streptomyces RC1071
isolated from a cerrado soil and its antagonism against phytopathogenic fungi.
Journal of Applied Microbiology. 90: 653-661.
• Gómez, M., Rojas, L., Rojas, N., Cruz, R. 2004. Colloidal chitin stained with
Remazol Brilliant Blue RR, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms
and to evaluate chitinases. Journal of Microbiological Methods. 56: 213– 219.
• González-Franco, A., Deobald, L., Spivak, A., Crawford, D. 2003. Actinobacterial
chitinase-like enzymes: profiles of rhizosphere versus non-rhizosphere isolates.
Canadian Journal of Microbiology. 49: 683-698.
• González, V., Guerrero, C., Ortiz, U. 2002. Estructura química y compatibilidad de
poliamidas con quitina y quitosano. Ciencia UANL. 5: 39-47.
• Goodfellow, M., Williams, S. 1983. Ecology of Actinomycetes. Annual Reviews
Microbiology. 37: 189-216.
87
• Goriely, A., Tabor, M. 2002. Biomechanical models of hyphal growth in
actinomycetes. Journal of Theoretical Biology. 222: 211-218.
• Gravel, V., Martinez, C., Antoun, H., Tweddell, R. 2005. Antagonist
microorganisms with the ability to control Pythium damping-off of tomato seeds in
rockwool. BioControl. 50: 771-786.
• Gregory, P. 2006. Roots, rhizosphere and soil: the route to a better understanding of
soil science?. European Journal of Soil Science. 57: 2-12.
• Guadarrama, A., Rivas, N. 1995. Purificación y caracterización cinética de la
enzima polifenol oxidasa del ocumo (Xanthosoma sagittifolium). Revista de la
Facultad de Agronomía. 16: 65-86.
• Guo, S., Chen, J., Lee, W. 2004. Purification and characterization of extracellular
chitinase from Aeromonas schubertii. Enzyme and Microbial Technology 35: 550-
556.
• Gupta, R., Saxena, R., Chaturvedi, P., Virdi, J. 1994. Chitinase production by
Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis. Journal of Applied
Bacteriology. 78: 370-383.
• Gupta, R., Saxena, R.K., Chaturvedi, P., Virdi, J.S. 1995. Chitinase production by
Streptomyces viridificans: Its potential in fungal cell wall lysis. Journal of Applied
Bacteriology. 87: 378-383.
• Han, Y., Li, Z.,Y., Miao, X., Zhang, F. 2008. Statistical optimization of medium
components to improve the chitinase activity of Streptomyces sp. Da11 associated
with the South China Sea sponge Craniella australiensis. Process Biochemistry. 43:
1088-1093.
88
• Hidrin, N., Goodfellow, M., Boiron, P., Moreno, M., Serrano, J.A. 2001. Los Estreptomices. Revista de la sociedad Venezolana de Microbiología. 21: 36-38.
• Hodgson, D. 1992 Differentiation in Actinomycetes in Prokaryote Structure and
Function: a New Perspective. Society for General Microbiology Symposium. 47: 408-
440.
• Hong, T., Cheng, C., Huang, J., Meng, M. 2002. Isolation and biochemical
characterization of an endo-1,3-β-glucanase from Streptomyces sioyaensis
containing a C-terminal family 6 carbohydrate-binding module that binds to1,3-β-
glucan. Microbiology. 148: 1151-1159.
• Hoster, F., Schmitz, J.E., Daniel, R. 2005. Enrichment of chitinolytic
microorganisms: isolation and characterization of a chitinase exhibiting antifungal
activity against phytopathogenic fungi from a novel Streptomyces strain. Applied
Microbial and Cell Physiology. 66: 434-442.
• Hsu, S., Lockwood, L. 1975. Powdered Chitin Agar as a Selective Medium for
Enumeration of Actinomycetes in Water and Soil. Applied Microbiology. 29: 422-426.
• Hwang, B.K., Lee, J.Y., Kim, S., Moon, S.S. 2001. Isolation and in vivo and in vitro
Antifungal activity of Phenylacetic Acid and Sodium Phenylacetate from
Streptomyces Humidus. Applied and Environmental Microbiology. 67: 3739-3745.
• Il’ina, A., Zueva, O., Lopatin, S., Varlamov, V. 2004. Enzymatic Hydrolysis of α-
Chitin. Applied Biochemistry and Microbiology. 40: 35–38.
• Ikeda, S., Tow, N., Ezura, H., Minamisawa, K., Fujimura, T. 2006. Soil microbial
community analysis in the environmental risk assessment of transgenic plants. Plant
Biotechnology. 23: 137-151.
89
• Istifadah N., Saleeba, J.A., McGee, P.A. 2006. Isolates of endophytic Chaetomium
spp. inhibit the fungal pathogen, Pyrenophora triticirepentis, in vitro. Canadian
Journal of Botany. 84:1148-1155.
• Itoh, Y., Takahashi, K., Takizawa, H., Nikaidou, N., Tanaka, H., Nishihashi, H., Watanabe T., Nishizawa, Y. 2003. Family 19 Chitinases of Streptomyces griseus
HUT6037 Increases Plant Resistance to the Fungal Disease. Bioscience.
Biotechnology and Biochemistry. 67: 847-855.
• Iznaga, Y., Lemus, M., González, L., Garmendía, L., Nadal, L., Vallín, C. 2003. Antifungal activity of actinomycetes from cuban soils. Phytotherapy research. 18:494-
496.
• Ji, C., Kuc, J. 1996. Antifungal activity of cucumber β-1,3-glucanase and Chitinase.
Physiological and Molecular Plant Pathology. 49: 257-265.
• Johansson, J.F., Paul, L.R., Finlay, R.D. 2004. Microbial interactions in the
mycorrhizosphere and their significance for sustainable agriculture. Elsevier. 48:1-13.
• Kamil, Z., Rizk, M., Saleh, M., Moustafa, S. 2007. Isolation and Identification of
Rhizosphere Soil Chitinolytic Bacteria and their Potential in Antifungal Biocontrol.
Global Journal of Molecular Sciences. 2: 57-66.
• Kim, B.S., Moon, S.S., Hwang B.K. 1999. Isolation, antifungal activity, and structure
elucidation of theglutarimide, streptimidone, produced by Micromonospora coerulea.
Journal Agricultural Food Chemistry 47: 3372-3380.
• Kishore, K., Pande, S., Podile, A.R. 2005. Biological control of late leaf spot of
peanut (Arachis hypogaea) with chitinolytic bacteria. American Phytopathological
Society. 95: 1157-1165.
90
• Lahdenpera, M.-L., Simon, E., Uoti, J. 1991. Mycostop—a novel biofungicide based
on Streptomyces bacteria. Elsevier. Págs. 258-263.
• Larkin, R.P., Fravel, D.R. 1999. Mechanisms of Action and Dose-Response
Relationships Governing Biological Control of Fusarium Wilt of Tomato by
Nonpathogenic Fusarium spp. Phytopathology. 89: 1152-1161.
Leisner, J., Larsen, M., Jørgensen, R., Brøndsted, L., Thomsen, L., Ingmer, H. 2008. Chitin hydrolysis by Listeria spp. including 1 L. monocytogenes. Applied
Environmental Microbiology. pp. 25.
• Leiva, S., Yáñez, M., Zaror, L., Rodríguez, H., García, H. 2004. Actividad
Antimicrobiana de actinomycetes aislados desde ambientes acuáticos del sur de
Chile. Revista médica de Chile.132: 151-159.
• León, J., Liza, L., Soto, I., Cuadra, D.L., Patiño, L., Zerpa, R. 2007. Actinomycetes
Bioactivos de Sedimento Marino de la Costa Central del Perú. Revista Peruana de
Biología. 14: 259-270.
• Leveau, J.Y., Bouix, M. 2000. Microbiología industrial: los microorganismos de
interés industrial. Acribia. Zaragoza, España.
• Lynch, J., Brown, K. 2001. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to
low phosphorus availability. Plant Soil. 237: 225–23.
• Locci, R. 1994. Actinomycetes as plant pathogens. European Journal of Plant
Pathology. 100: 179–200.
• Longevus. 2007. La Avena. [Online] http://www.zonadiet.com/alimentacion/l-
avena.htm. Acceso 01 de Febrero de 2009.
91
• Metcalfe, A., Williamson, N., Krsek, M., Wellington, E. 2002. Molecular Diversity
within Chitinolytic Actinomycetes Determined by In Situ Analysis. Actinomycetol. 17:
18–22.
• Michail, M., Vasiliadou, M., Zotos, A. 2006. Partial purification and comparison of
precipitation techniques of proteolytic enzymes from trout (Salmo gairdnerii) heads.
Food Chemistry. 97: 50-55.
• Mitsutomi, M., Hata, T., Kuwahara, T. 1995. Purification and Characterization of
Novel Chitinases from Streptomyces griseus HUT 6037. Journalo of Fermentatioann
and Bioengineering. 80: 153-158.
• Miyashita, K., Fujii, T., Sawada, Y. 1991. Molecular cloning and characterization of
chitinase genes from Streptomyces lividans 66. Journal of General Microbiology.
137: 2065-2072.
• Mukherjee, G., Sen, S. 2006. Purification, Characterization and Antifungal Activity of
Chitinase from Streptomyces venezuelae P10. Current Microbiology. 53: 265–269.
• Murao, S., Kawada, T., Itoh, H., Oyama, H., Shin, T. 1992. Purification and
characterization of a novel type of chitinasefrom Vibrio alginolyticus TK-22.
Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 56: 368-369.
• Nawani, N., Kapadnis, B. 2005. Optimization of chitinase production using statistics
based experimental designs. Process Biochemistry. 40: 651-660.
• Neiendam, M., Sørensen, J., Fels, J. and Pedersen, H. 1998. Secondary
Metabolite- and Endochitinase-Dependent Antagonism toward Plant-Pathogenic
Microfungi of Pseudomonas fluorescens Isolates from Sugar Beet Rhizosphere.
Applied and Environmental Microbiology. 64: 3563-3569.
92
• Nguyen, J., Francou, F.,Virolle, M., Rineau , M. 1997. Amylase and Chitinase
Genes in Streptomyces lividans Are Regulated by reg1, a Pleiotropic Regulatory
Gene. Journal of Bacteriology. 179: 6383-6390.
• Nobel, A. 2000. Quick Start Bradford Proteins Assay. Instruction Manual. Bio-Rad
Laboratories Inc. 1-34.
• Nogales, B. 2005. La microbiología del suelo en la era de la biología molecular:
Descubriendo la punta del Iceberg. Ecosistemas. Págs. 1-10.
• Nuero, O.M. 1995. Estudio Bioquímico de β-1,3-Glucanasas de Aspergillus nidulans
para el control biológico de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici raza 2. Tesis
Doctoral. Universidad Complutense de Madrid, Madrid. Director: Fuensanta Reyes.
pp. 142.
• Ogawa, K., Yoshida, N., Kariya, K., Ohnishi, C., Ikeda, R. 2002. Purification and
characterization of a novel chitinase from Burkholderia cepacia strain KH2 isolated
from the bed log of Lentinus edodes, Shiitake mushroom. The Journal of General
and Applied Microbiology. 48: 25-33.
• Park, J.O., El-Tarabily, K.A., Ghisalberti, E.L., Sivasithamparam, K. 2002.
Pathogenesis of Streptoverticillium albireticuli on Caenorhabditis elegans and its
antagonism to soil-borne fungal pathogens. Applied Microbiology. 35: 361-365.
• Patidar, P., Agrawal, D., Banerjee, T., Patil, S. 2005. Chitinase production by
Beauveria felina RD 101: optimization of parameters under solid substrate
fermentation conditions. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21: 93-95.
• Pierce. 2004. Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit. Pierce Biotechnology.
Págs.1-7.
93
• Peniche, C. 2006. Estudios sobre Quitina y Quitosana. Tesis de doctorado en
Ciencias. Universidad de La Habana, La Habana. pp. 95.
• Popova, V., Pishtiyski, I. 2001. Isolation of cyclodextrin glucanotransferase
preparations of different purities. Eur Food Res Technol. 213: 67-71.
• Prapagdee, B., Kuekulvong, C., Mongkolsuk, S. 2008. Antifungal Potential of
Extracellular Metabolites Produced by Streptomyces hygroscopicus against
Phytopathogenic Fungi. International Journal of Biological Sciences. 4: 330-337.
• Pridham, T., Lindenfelser, L., Shotwell, O., Stodola, S., Benedict, R., Foley, C., Jackson, R., Zaumeyer, W., Preston, W., Mitchell, J. 1956. Antibiotics against
plant disease. II. Effective agents produced by Streptomyces cinnamoneus for
Azacoluta f. nov. Phytopathology. 46:575-581.
• Ramos, B. 1999. Estudio de la capacidad de dos cepas bacterianas del género
Bacillus para promover el crecimiento vegetal. Tesis de Doctorado. Universidad de
San Pablo-CEU, Madrid. Director. F.J. Gutiérrez Mañero. pp. 241.
• Reddi, G., Rao, A. 1971. Antagonism of soil actinomycetes to some soil-borne plant
pathogenic fungi. Indian Phytopathology. 24: 649-657.
• Remsing, L., González, A.M., Nur-e-Alam, M., Fernández-Lozano, M.J., Braña, A.F., Rix, U. Oliveira, M.A., Méndez, C., Salas, J.A., Rohr, J. 2003. Mithramycin
SK, a novel antitumor drug with improved therapeutic index generated by
combinatorial biosynthesis in the mithramycin producer Streptomyces argillaceus.
Journal American Chemistry Society. 125: 5745-5753.
• Rodríguez, L., Aguirrezabalaga, I., Allende, N., Braña, A.F., Méndez, C., Salas, J.A. 2002. Engineering deoxysugar biosynthetic pathways from antibiotic-producing
94
microorganisms: A tool to produce novel glycosylated bioactive compounds.
Chemistry and Biology. 9: 721–729.
• Rodríguez, M.X. 2001. Towards identifying markers for post-harvest physiological
deterioration in cassava (Manihot esculenta Crantz). Tesis de Doctorado.University
of Bath, Inglaterra.
• Sabry, S.A. 1992. Microbial degradation of shrimp shell waste. Journal of Basic
Microbiology. 32: 378-383.
• Safarida, A., Salleh, M., Illias, R. 2006. Production and characterization of crude
chitinase from Trichoderma virens. Petroleum and Natural Resources Process. Págs.
625-630.
• Saito, A., Fujii, T., Yoneyama, T., Miyashita, K. 1998. GlkA Is Involved in Glucose
Repression of Chitinase Production in Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology.
180: 2911-2914.
• Salazar, L., Patiño, L., Bustamante, E. 2006. Sustratos Foliares para el Incremento
de Bacterias Quitinolíticas y Glucanolíticas en la Filosfera de Banano. Revista
Facultad Nacional de Agronomía. 59: 3449-3465.
• Salazar, R., Guevara, J, M., Béjar, V., Godoy, A. 1997. Bacteriemia por
Actinomyces. Anales de la Facultad de Medicina. 58.
• Sánchez, L., Corrales, L. 2005. Evaluación de la congelación para conservación de
especies autóctonas bacterianas. Nova – Publicación Científica. 3: 21:29
• Sandhya, C., Binod, P., Nampoothiri, KM., Szakacs, G., Pandey, A. 2005.
Microbial synthesis of chitinase in solid cultures and its potential as a biocontrol
95
agent against phytopathogenic fungus Colletotrichum gloeosporioides. Applied
Biochemistry and Biotechnology. 127: 1-15.
• Sastoque, L. 2006. Aislamiento y selección de microorganismos productores de
Quitinasas a partir de residuos de concha de camarón con potencial biocontrolador.
Trabajo de Grado. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá. Director: Aura Marina
Pedroza. Coodirector: Balkys Quevedo. pp 134.
• Sastoque, L., Mercado, M., Martínez, M.M., Quevedo, B., Pedroza, A.M. 2007. Producción de Quitinasas extracelulares con una cepa alcalófila halotolerante de
Sterptomyces sp. aislada de residuos de camarón. Revista Mexicana de Ingeniería
Química. 6: 137-146.
• Sastoque-Cala, L., Mercado-Reyes, M., Martínez-Salgado, M.M., Quevedo-Hidalgo, B., Singh, P.P., Shing, Y.C., Park, C.S., Chung, Y.R. 1999. Biological
Control of Fusarium Wilt of Cucumber by Chitinolytic Bacteria. Phytopathology. 89:
92-99.
• Sembiring, L., Ward, A., Goodfellow, M. 2000. Selective isolation and
characterisation of members of the Streptomyces violaceusniger clade associated
with the roots of Paraserianthes falcataria. University of Newcastle. 78: 353-366.
• Serrano, J., Sandoval, A., Ramírez, N., Ventosa, A. 2003. Método simplificado
para el estudio Morfológico por Microscopía Óptica y Microscopía Electrónica de
Barrido de Actinomicetos Halófilos. Revista de la Sociedad Venezolana de
Microbiología. 23:42-46.
• Serrano, J., Sandoval, A. 2008. Identificación y diagnóstico de Actinomicetales
Patógenos.Universidad de los Andes. Mérida, Venezuela. 6: 158-160.
96
• Shanmugaiah, V., Mathivanan, N., Balasubramanian, N., Manoharan, P. 2008. Optimization of cultural conditions for production of chitinase by Bacillus
laterosporous MML2270 isolated from rice rhizosphere soil. African Journal of
Biotechnology. 7: 2562-2568.
• Sharaf, E. 2005. A potent Chitinolytic Activity of Alternaria alternate Isolated from
Egyptian Black Sand. Polish. Journal of Microbiology. 54: 145-151.
• Siddiqui, Z.A. 2005. PGPR: Prospective biocontrol agents of plant pathogens. En:
Siddiqui, Z.A. (ed) PGPR: Biocontrol and Fertilization. Págs. 111-142.
• Singh, P., Shin, Y., Park,C., Chung, Y. 1999. Biological Control of Fusarium Wilt of
Cucumber by Chitinolytic Bacteria. Phytopathology. 89: 92-99.
• Skujins, J., Potgieter, H., Alexander, M. 1965. Dissolution of fungal cell walls by a
Streptomycete chitinase and β (1,3) glucacase. Archives of Biochemistry and
Biophysics. 111: 358-64.
• Strzelc, Z., Gorlach, K., Rózycki, H. 1990. Chitinolytic and Proteolytic activity of
Streptomycetes isolated from root – free soil, rhizosphere and mycorhizosphere pine
(Pinus sylvestris L.). Biology and Fertility of soils. 9:268-272.
• Sullivan, T. 2004. Interactions between Soil Microbial Communities and Plant Roots.
A Minireview. Soil and Crop Sciences. Colorado State University. [Online]
http://www.colostate.edu/Depts/Entomology/courses/en570/papers_2004/sullivan.pdf
. Acceso 19 de Enero de 2009.
• Swiontek, M., Porczyk, E., Donderski, W. 2007. Chitinolytic activity of bacteria and
fungi isolated from shrimp exoskeletons. Institute of Oceanography. 36: 101-111.
97
• Taddei, A., Tremarias, M., Hartung, C. 1999. Viability studies on actinomycetes.
Mycopathologia. 143: 161-164.
• Taechowisan, T., Peberdy, J., Lumyong, S. 2003. Chitinase production by
endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and its antagonism against
phytopathogenic fungi. Annals of Microbiology. 53: 447-461.
• Tahtamouni, M., Hameed, K., Saadoun, M. 2006. Biological Control of Sclerotinia
sclerotiorum Using Indigenous Chitinolytic Actinomycetes in Jordan. The Plant
Pathology Journal. 22: 107-114.
• Tanabe, T., Kawase, T., Watanabe, T., Uchida, Y., Mitsutomi, M. 2000. Purification
y Characterization of 49-KDa chitinase from Streptomyces griseus HUT 6037.
Journal of Bioscience and Bioengineering. 89: 27-32.
• Tanaka, Y., Omura, S. 1993. Agroactive compounds of microbial origin. Annual Reviews of Microbiology. 47: 57–87.
• Thangapandian, V., Ponmurugan, P., Ponmurugan, K. 2007. Actinomycetes
Diversity in the Rhizosphere Soils of Different Medicinal Plants in Kolly Hills-
Tamilnadu, India, for secondary metabolite production. Asian Journal of Plant
Sciences. 6: 66-70.
• Titus, A., Pereira, G.N. 1999-2007. The role of Actinomycetes in coffee plantation
ecology. [Online] http://www.ineedcoffee.com/05/actinomycetes/print.asp. Acceso 21
de Enero de 2008.
• Tovar, J. 2008. Evaluación de la Capacidad antagonista in vivo de aislamientos de
Trichoderma spp frente al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani. Trabajo de Grado.
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá,
98
• Trejo, S., Paszczynski, A., Crawford, D. 1998. Antibiotics and enzymes produced
by the biocontrol agent Streptomyces violaceusniger YCED-9. Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology. 21: 81-90.
• Tsay, T., Chen, P., Wu, W. 2006. A New Method for Isolating and Selecting Agents
with High Antagonistic Ability Against Plant Parasitic Nematodes. Plant Pathology
Bulletin. 15: 9-16.
• Tweddell, R., Jabaji-Hare, S., Charest, P. 1994. Production of Chitinases and β-
1,3-Glucanases by Stachybotrys elegans, a Mycoparasite of Rhizoctonia solani.
Applied and Environmental Microbiology. 60: 489-495.
• United Nations Environment Programme. 2005. Single-Cell-Protein and Ethanol
production. Solid Waste Management. 1: 237-252.
• Valois, D., Fayad, K., Barasubiye, T., Garon, M., Déry, C., Brzezinski, R., Singh, P.P., Shin, Y.C., Park, C.S., Chung, Y.R. 1996. Biological Control of Fusarium Wilt
of Cucumber by Chitinolytic Bacteria. Phytopathology. 89: 92-99.
• Vázquez, S., Leal-Morales, C., Herrera-Estrella, A. 1998. Analysis of the β-1,3-
Glucanolytic System of the Biocontrol Agent Trichoderma harzianum. Applied and
Environmental Microbiology. 64: 1442-1446.
• Walker, T., Bais, P., Grotewold, E., Vivanco, J. 2003. Root Exudation and
Rhizosphere Biology. Plant Physiology. 132: 44-51.
• Wang, S.L., Chang, W.T. 1997. Purification and characterization of two bifunctional
chitinases/lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in
a shrimp and crab shell powder medium. Applied and Environmental Microbiology.
63: 380-386.
99
• Wang, S., Yen, Y., Tsiao, W., Chang, W., Wang, C. 2002. Production of
antimicrobial compounds by Monascus purpureus CCRC31499 using shrimp and
crab shell powder as a carbon source. Enzyme and Microbial Technology. 31: 337-
344.
• Wang, S., Chao, C., Liang, T., Chen, C. 2008. Purification and Characterization of
Protease and Chitinase from Bacillus cereus TKU006 and Conversion of Marine
Wastes by These Enzymes. Mar biotechnology. pp. 11.
• Weller, D.M. 1988. Biological control of soilborne pathogens in the rhizosphere with
bacteria. Annual Review of Phytopathology. 26: 379-407.
• Wen, C., Tseng, C., Cheng, C., Li, Y. 2002. Purification, characterization and
cloning of a chitinase from Bacillus sp. NCTU2. Biotechnology and Applied
Biochemistry. 35: 213–219.
• Whipps, J. 1987. Effects of Media on Growth and Interactions Between a Range of
Soil-Borne Glasshouse pathogens and Antagonistic Fungi. New Phytologist. 107:
127-142.
• Whipps, J. 2001. Microbila Interactions and biocontrol in the rhizosphere. Journal of
Experimental Botany. 52: 487-511.
• Wright, S.F. 2004. Glomalin purification precipitation and dialysis. [Online].
http://www.ba.ars.usda.gov/sasl/research/glomalin/precip.pdf. Acceso 22 de
Noviembre de 2008.
• Wu, R., Chen, M. 1995. Identification of the Streptomyces strain KS3. Institute of
Botany, Academia Sinica. 36: 201-205.
100
• Yu, C., Lee, A., Bassler, B., R Oseman, S. 1991. Chitin Utilization by Marine
Bacteria.1991. The Journal Of Biologica Clhemistry. 266: 24260-24267.
• Yuan, W., Crawford, D. 1995. Characterization of Streptomyces lydicus WYEC108
as a Potential Biocontrol Agent against Fungal Root and Seed Rots. Applied and
Environmental Microbiology. 61: 3119-3128.
• Zakalyukina, Y., Zenova, G. 2007. Antagonistic activity of soil acidophilic
actinomycetes. Biology Bulletin. 34: 323-332.
101
10. ANEXOS
Anexo1. Aislamiento e identificación microscópica y macroscópica de cepas de
actinomicetos.
Para la toma de muestras de suelo, se realizó la georeferenciación por GPS (Global
Positioning System) de los diferentes puntos de muestreo en la rizósfera de trébol blanco
localizado en la Sabana de Bogotá - Zona Cundíboyacense. A partir de las muestras de
suelo recolectadas en los distintos puntos de muestreo demarcados por el sistema de
georeferenciación; se hicieron siembras en agar avena aislando en su totalidad 30 cepas
(Duque y Quintana, 2008).
CEPA
1
2
4
CARACTMACRO
Colonia seca,producción difusibles, revnaranja claro, claro.
Colonia seca,pigmentos dvioleta, anversesporulación b
Colonia secreverso ca
pigmentos dianverso co
militar, a metiempo de inc
café c
TERISTICAS OSCOPICAS
, pulverulenta, de pigment
verso de coloanverso color ca
, pulverulenta, ifusibles, rever
so color inicial cablanca.
ca pulverulenta, afé oscuro, sin fusibles al medio
olor inicial verde edida que pasa ecubación se torncon blanco
.
CARACTEMICROS
sin tos nia afé
Micelio ramificadofragmentacadenas dsencillos, espirales.
Actinomi
sin rso afé,
Micelio vefragmentaaéreo frpresentandcadenas dsencillos e
Actinomic
o,
el a
Micelio vefragmentaaéreo fracadenas conidios o
Actinomi
ERISTICAS COPICAS
IDM
vegetativo o no do, aéreo, de conidios
formando
ceto 100x
egetativo no do, micelio ragmentado do de conidios en espiral.
ceto 100x.
egetativo no do, micelio agmentado, largas de valados.
ceto 100x
DENTIFICACIONMICROSCÓPICA
Streptomyces
Streptomyces
N.I
N A
IDENTIFICARDR
Streptom
Saccharopo
Thermob
1
ACION RA
IDENN B
myces
olyspora
bifida
102
NTIFICACIOIOQUIMICA
N.R
N.R
N.R
CEPA
5
6
7
CARACTMACRO
Colonia secreverso naranjcremoso, coloque a medidtiempo se tornpigmento.
Colonia seca pigmento difusanverso colonbordes blancque pasa el blanca (puntoreverso verde
Colonia seca pigmento difusAnverso colopálido y se medida que paa geosmina.
TERISTICAS OSCOPICAS
ca pulverulenja, anverso al ini
or inicial rojo fucda que pasa
na blanco a gris
pulverulenta, sible en el mednia color plateadcos que a med
tiempo se toros blancos) cmilitar.
pulverulenta, sible en el med
onia color rosatorna blanco
asa el tiempo. O
CARACTEMICROS
nta, cio
csia el
sin
Conidios dobles, filamentosramificado
Actinomi
sin dio, do, ida rna con
Micelio vefragmentade conidiaaéreo tortu
Actinomi
sin dio. ado
a Olor
Micelio vefragmentalarga de cespirales.
Actinomi
ERISTICAS COPICAS
IDM
sencillos y pocos
s no os.
ceto 100x
egetativo no do, cadena as, micelio uoso.
ceto 100x
getativo sin r, cadena
conidios sin
ceto 100x
DENTIFICACIONMICROSCÓPICA
N.I
Streptomyces
N.I
N A
IDENTIFICARDR
Streptom
Streptom
Thermomon
1
ACION RA
IDENN B
myces
myces
nospora
103
NTIFICACIOIOQUIMICA
N.R
N.R
N.R
CEPA
8
9
10
CARACTMACRO
Colonia secarosado tenupigmentación, difusible en el
Colonia secanverso grispigmento difuscolonia pequeñ
Colonia seca,pigmento difusreverso verdeblanco gris qutiempo se torexudados de c
TERISTICAS OSCOPICAS
a, anverso coue, reverso
sin pigmenmedio.
ca pulverulens plateado sible en el medña.
, pulverulenta, sible en el mede, anverso coue con el paso rna café, presencolor verde.
CARACTEMICROS
olor sin nto
Micelio fragmentatortuoso, espirales. conidias. género: Streptomy
Actinomi
nta, sin
dio,
Cantidad conidias. fragmentatortuoso y
Actinomi
sin dio, olor del nta
Micelio fragmentatortuoso de ePocas con
Actinomi
ERISTICAS COPICAS
IDM
no do,
y con Pocas
Posible
yces sp.
ceto 100x
alta de Micelio no do, en espiral.
ceto 100x
no do,
formación entramadas. nidias.
ceto 100x
DENTIFICACIONMICROSCÓPICA
N.I
Streptomyces
N.I
N A
IDENTIFICARDR
Thermob
Streptom
Streptom
1
ACION RA
IDENN B
bifida
myces Str
myces N
104
NTIFICACIOIOQUIMICA
N.R
reptomyces
Nocardia
CEPA
11
12
14
CARACTMACRO
Colonia seca pigmento difussin pigmentaanverso colooscuro, bordecrema con punel micelio.
Colonia seca,con bordespigmentación e
Colonia seca pigmento difusreverso cafécolonias grisepuntos negros
TERISTICAS OSCOPICAS
pulverulenta, sible en el medción en rever
or inicial marres de blanco ntos blancos sob
anverso grisác blancos. Sen reverso.
pulverulenta, sible en el med
é claro, anveres borde blan sobre la colonia
CARACTEMICROS
sin dio, so, rón
a bre
Micelio vefragmentaaéreo frcon tortuoso.
Actinomi
ceo Sin
Filamentosmicelio fragmentaconidias.
Actinomic
sin dio, rso co;
a.
Micelio fragmentatortuoso eForma Pocas con
Actinomi
ERISTICAS COPICAS
IDM
egetativo no do, micelio ragmentado
espirales,
ceto 100x
s largos, no
do, pocas
ceto. 100x
no do, en espiral. entramada.
nidias.
ceto 100x
DENTIFICACIONMICROSCÓPICA
Streptomyces
N.I
N.I
N A
IDENTIFICARDR
Streptom
Streptom
Streptom
1
ACION RA
IDENN B
myces
myces
myces Str
105
NTIFICACIOIOQUIMICA
N.R
N.R
reptomyces
CEPA
16
18
19
CARACTMACRO
Colonia secanverso café,en reverso, difusible en el
Colonia seca pigmento en recolor gris plattiempo de incblanco.
Colonia seca pigmento difureverso nacolonias sobrea grises con micelio.
TERISTICAS OSCOPICAS
ca pulverulen sin pigmentac
sin pigmenmedio.
pulverulenta, everso, anverso teado y pasado cubación se tor
pulverulenta, usible al medaranja, anveresalientes blanc "agujeros" sob
CARACTEMICROS
nta, ión nto
Micelio nofragmentatortuoso, fode entramconidias. Pgénero: Streptomy
Actinomic
sin de el rna
Micelio vefragmentaaéreo fraSe observsueltos coco bacila
Actinomi
sin dio, rso cas bre
Micelio ramificadofragmentaaéreo cadenas den espiral.
Actinomi
ERISTICAS COPICAS
IDM
do, no ormación ada. Pocas Posible
yces sp.
ceto. 100x
getativo sin r. Micelio agmentado.
van conidios en forma ar.
ceto 100x
vegetativo o, no do. Micelio
formando de conidios .
ceto 100x
DENTIFICACIONMICROSCÓPICA
N.I
Streptomyces
Streptomyces
N A
IDENTIFICARDR
Streptom
Streptom
Streptom
1
ACION RA
IDENN B
myces N
myces
myces
106
NTIFICACIOIOQUIMICA
Nocardia
N.R
N.R
CEPA
21
22
23
CARACTMACRO
Colonia pequesin color en eblancos en (esporulación)
Colonias peqanverso las cde gris a blanen reverso, ni
Colonia peblanco, con grises. Revernaranja.
TERISTICAS OSCOPICAS
eña, anverso cael reverso. Punt
la superfi.
ueñas, secas, colonias se tornncas, sin pigmendifusible al medi
queña, anverpuntos negros
rso con pigmen
CARACTEMICROS
afé, tos cie
Micelio fragmentavegetativofragmentaconidios een espiral.
Actinomi
en nan nto o.
Micelio vefragmentaaéreo fren conidiobacilar.
Actinomi
rso s y nto
Micelio vefragmentaaéreo fren conidiococo bacila
Actinomi
ERISTICAS COPICAS
IDM
aéreo do, micelio
o con ción, pocos
en cadena o .
ceto 100x
getativo sin r, micelio ragmentado os de forma
ceto 100x
getativo sin r, micelio ragmentado os de forma ar.
ceto 100x
DENTIFICACIONMICROSCÓPICA
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces
N A
IDENTIFICARDR
Streptom
Thermob
Streptom
1
ACION RA
IDENN B
myces Str
bifida
myces
107
NTIFICACIOIOQUIMICA
reptomyces
N.R
N.R
CEPA
24
25
26
CARACTMACRO
Colonia secanverso gris, en reverso, difusible en el
Colonia seca, pigmento anmedio, anvertornándose cocon borde blan
Colonia ppulverulenta, difusible en el color gris a mo
TERISTICAS OSCOPICAS
ca, pulverulensin pigmentac
sin pigmenmedio.
pulverulenta, dunaranjado en rso inicio blanon el tiempo a gnco.
equeña, sesin pigmen
medio, anverso orado.
CARACTEMICROS
nta, ión nto
Filamentosramificadoconidios s
Actinomi
ura, el
nco gris
Micelio filamentosfragmentatortuoso, cadenas d
Actinom
ca, nto de
Filamentostortuosos, fragmentaespiral.
Actinomic
ERISTICAS COPICAS
IDM
s os, pocos imples.
ceto 100x
aéreo, s dos,
con de conidios.
iceto 100x
s,
dos, sin
ceto. 100x
DENTIFICACIONMICROSCÓPICA
N.I
N.I
N.I
N A
IDENTIFICARDR
Thermob
Saccharopo
Streptom
1
ACION RA
IDENN B
bifida Str
olyspora
myces Str
108
NTIFICACIOIOQUIMICA
reptomyces
N.R
reptomyces
109
CEPA CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS
CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS
IDENTIFICACION MICROSCÓPICA
IDENTIFICACION ARDRA
IDENTIFICACION BIOQUIMICA
27
Colonia puntiforme, seca, pulverulenta, anverso color verde, halo delgado color verde claro sin pigmento.
Micelio aéreo no fragmentado; micelio vegetativo no fragmentado No tortuoso, sin espiral.
Actinomiceto 100x
N.I
Streptomyces
Streptomyces
30
Colonia grande, seca, pulverulenta, anverso blanco inicialmente tornándose con el tiempo de color gris. Reverso con pigmento verde militar.
Micelio aéreo tortuoso, cadenas de conidios, con espirales.
Actinomiceto. 100x
N.I
Streptomyces
Streptomyces
110
Anexo 2. Medios de cultivo.
• AGAR AVENA (30 g/L)
COMPONENTES g/L
Avena comercial en polvo 30.0 Sacarosa 5.0 Agar-Agar 15
Preparación del medio:
Agregar los componentes al agua destilada, calentar a fuego durante 5 minutos, ajustar el
pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC). Servir en cajas de Petri estériles.
Nota: Cuando se utilice nistatina (1%) se debe agregar antes de la esterilización del medio
de cultivo.
• AGAR QUITINA COLOIDAL (1% p/v)
COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)
10ml
Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)
10mL
Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)
10mL
NH4Cl2 1g Quitina coloidal 1% (p/v) Agar-agar purificado (Merck) 15g
Preparación del medio:
Mezclar los componentes y llevar a volumen con agua destilada, calentar al fuego durante 5
minutos para disolver las sales, ajustar el pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC). Servir en
cajas de Petri estériles.
• MEDIO MÍNIMO SUPLEMENTADO CON GLUCOSA (1% p/v)
111
COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)
10ml
Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)
10ml
Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)
10mL
NH4Cl2 1g Glucosa 10 g Agar-agar purificado (Merck) 15.0g
Preparación del medio:
Mezclar los componentes y llevar a volumen con agua destilada, calentar al fuego durante 5
minutos para disolver las sales, ajustar el pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC). Servir en
cajas de Petri estériles.
• AGAR AGUA
COMPONENTES g/LAgar-agar purificado (Merck) 15.0
Preparación del medio:
Adicionar el agar al agua destilada, calentar durante 5 minutos. Autoclavar (15 lb y 121 ºC).
• AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)
COMPONENTES g/LAgar PDA 39.0
Preparación del medio:
Preparar según instrucciones de la casa comercial.
• AGAR YGC
COMPONENTES g/LAgar YGC 38.1
Preparación del medio:
Preparar según instrucciones de la casa comercial.
• MEDIO LÍQUIDO AVENA (30g/L)
112
COMPONENTES g/LAvena comercial en hojuelas 30.0 Sacarosa 5.0
Preparación del medio:
Agregar los componentes al agua destilada, ajustar el pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC.
MEDIO LÍQUIDO QUITINA COLOIDAL (0.5% p/v)
COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)
10ml
Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)
10mL
Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)
10mL
NH4Cl2 1g Quitina coloidal 0.5% (p/v)
Preparación del medio:
Agregar los componentes al agua destilada, ajustar el pH a 6.8. Servir en erlenmeyer.
Autoclavar (15 lb y 121 ºC).
• MEDIO LÍQUIDO QUITINA EN POLVO (1.5% p/v)
COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)
10ml
Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)
10mL
Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)
10mL
NH4Cl2 1g Quitina en polvo 15 g/L
Preparación del medio:
Agregar los componentes al agua destilada, Ajustar el pH a 6.8. Servir en erlenmeyer.
Autoclavar (15 lb y 121 ºC).
113
Anexo 3. Curva Patrón para la cuantificación de azúcares reductores en términos de N-
acetilglucosamina.
Preparación de Reactivos:
* Somogyi I g/L
Carbonato de Sodio anhidro (Na2CO3): 24g Sal de Rochelle: 12g Bicarbonato se Sodio (NaHCO3): 16g Sulfato de Sodio (Na2SO4): 144g Agua destilada: Aforar a 1000 mL
Depositar en un beaker de 1000 mL 500 mL de agua destilada y disolver en agitación
constante cada uno de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar
con agua destilada hasta un volumen de 1000 mL. En caso de precipitarse calentar antes de
usar.
* Somogyi II g/200 mL
Sulfato cúprico pentahidratado (CuSO4.5 H20): 4g Sulfato de Sodio (Na2SO4): 36g Agua destilada: Aforar a 200 mL
Depositar en un beaker de 500 mL 100 mL de agua destilada y disolver en agitación
constante cada uno de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar
con agua destilada hasta un volumen de 200 mL.
* Nelson g/500 mL
Ácido Sulfúrico (H2SO4): 21.2 mL Arsenato de Sodio heptahidratado(Na2HAsO4. 7H2O): 3.02g Amonio Molibdato ((NH4)6Mo7O24.4H2O): 25.2g Agua destilada: 478.8 mL
Depositar en un beaker de 1000 mL 453.6 mL de agua destilada y disolver en agitación
constante el molibdato de amonio, posteriormente adicionar lentamente el ácido sulfúrico
hasta obtener una mezcla homogénea. Por otro lado disolver el arsenato de sodio
heptahidratado en 25.2 mL de agua destilada. Mezclar las dos soluciones e incubar por 48
horas a 37ºC. Almacenar en recipiente ámbar.
Datos curva patrón:
114
Cantidad N - Acetilglucosamina
(µg)
Concentración N - Acetilglucosamina
(µg/µl)
Promedio Absorbancias 595
nm Desviación estándar
0 0 0,000 20 0,08 0,028 0,005 25 0,1 0,162 0,040 30 0,12 0,222 0,044 35 0,14 0,273 0,043 40 0,16 0,440 0,023 45 0,18 0,497 0,010 50 0,2 0,567 0,024 55 0,22 0,654 0,033 60 0,24 0,766 0,009 70 0,28 0,984 0,055 80 0,32 1,159 0,027 90 0,36 1,306 0,026
Cuantificación de azúcares reductores por Somogyi–Nelson modificado por Rodríguez (2001).
1. Mezcla de reacción a utilizar:
X muestra: 50 µL Sustrato (quitina coloidal): 200 µL
Somogyi I: 200 µL Somogyi II: 50 µL
2. Calentar 30 minutos hasta ebullición.
3. Enfriar a temperatura ambiente.
4. Adicionar 250 µL del reactivo de Nelson.
5. Adicionar 700 µL de agua destilada.
6. Leer a una longitud de onda de 595 nm después de 24 horas.
Curva Patrón N-Acetilglucosamina
y = 4,5887x - 0,3295R2 = 0,9963
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
Concentracion N- Acetilglucosamina µg/µl
Abs
orba
ncia
595
nm
115
Anexo 4. Curva Patrón para la cuantificación de proteínas, empleando Suero albúmina de
bovino (BSA) como proteína standard.
Preparación de Reactivos:
*Bradford g/L
Azul de Coomasie Brillante G: 0.1g Ácido ortofosfórico concentrado 85% (H3PO4): 100 mL Etanol 95% (CH3-CH2-OH): 50 mL Agua destilada: 850 mL
Depositar en un beaker de 1000 mL el azul de Coomassie brillante G y disolver en 100 mL
de ácido ortofosfórico concentrado 85% y 50 mL de etanol al 95%, dejar en agitación durante
48 horas a temperatura ambiente. Completar con agua destilada hasta un volumen de 1000
mL. Dejar precipitar toda la noche a 4ºC y posteriormente centrifugar a 4 ºC a 11000 x g.
Datos Curva Patrón:
Cantidad proteína
(µg)
Logaritmo cantidad
proteína (µg)
Promedio Absorbancias
595 nm
Logaritmo promedio
absorbancias Desviación
estándar 0 0,000 0,000 1 0,000 0,123 -0,911 0,004 2 0,301 0,187 -0,727 0,023 4 0,602 0,363 -0,440 0,028 6 0,778 0,439 -0,358 0,014
10 1,000 0,593 -0,227 0,038 12 1,079 0,628 -0,202 0,007 16 1,204 0,791 -0,102 0,010 20 1,301 0,920 -0,036 0,024 24 1,380 1,048 0,020 0,021 28 1,447 1,138 0,056 0,001
116
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford (1976), modificado por Rodríguez (2001).
1. Mezcla de reacción a utilizar:
X muestra: 20 µL NaOH 1.5M: 50 µL
Reactivo de Bradford: 1000 µL
2. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Leer a una longitud de onda de 595 nm.
Curva patrón determinación de proteína
y = 0,6647x - 0,8971R2 = 0,9941
-1,000
-0,800
-0,600
-0,400
-0,200
0,000
0,200
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000
Cantidad BSA (log µg)
log
Abs
595
nm
117
Anexo 5. Valores de medición en milímetros del diámetro de halos de hidrólisis en agar
quitina coloidal al 1%.
Nº Cepa
Medición en mm (10 días) Día 3 Día 5 Día 7 Día 9
R1 R2 R3 PROMEDIO R1 R2 R3 PROMEDIO R1 R2 R3 PROMEDIO R1 R2 R3 PROMEDIO1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 1,75 2,25 2,00 4,00 6,50 5,00 5,17 6,00 7,00 5,00 6,00 4 4,00 2,00 2,00 2,67 4,00 2,75 2,25 3,00 4,00 2,75 3,25 3,33 4,00 2,75 3,25 3,33 5 3,00 2,50 3,75 3,08 4,00 2,75 4,25 3,67 2,75 4,75 N.D 3,75 4,25 2,75 4,75 3,92 7 2,00 2,00 1,00 1,67 3,00 3,25 1,88 2,71 3,22 4,50 2,00 3,24 3,25 4,60 3,25 3,70 8 1,00 1,00 1,00 1,00 1,25 1,50 1,38 1,38 1,75 1,75 2,25 1,92 2,50 1,88 1,88 2,08
10 1,00 1,00 1,00 1,00 1,50 1,00 0,88 1,13 1,50 1,50 1,30 1,43 2,50 2,60 2,50 2,53 11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,50 0,50 0,50 12 0,00 0,00 0,00 0,00 1,75 2,25 3,00 2,33 2,50 2,50 3,00 2,67 2,50 2,50 3,00 2,67 14 2,80 3,25 2,75 2,93 4,33 5,00 5,10 4,81 6,25 6,25 8,75 7,08 6,25 9,50 9,50 8,42 16 1,00 1,00 N.D 1,00 1,00 1,00 N.D 1,00 1,25 1,00 N.D 1,13 2,25 2,00 N.D 2,13 18 1,00 0,88 0,88 0,92 1,25 1,00 1,00 1,08 2,00 1,75 1,50 1,75 2,60 2,00 3,00 2,53 19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 21 0,00 0,00 0,00 0,00 2,50 3,00 2,25 2,58 3,50 4,00 2,50 3,33 4,00 4,25 2,50 3,58 22 5,00 3,75 4,25 4,33 6,60 6,00 4,25 5,62 9,25 8,00 8,75 8,67 11,00 13,50 9,75 11,42 24 4,75 6,25 4,25 5,08 8,60 7,00 7,75 7,78 9,00 8,50 8,00 8,50 10,00 12,00 11,50 11,17 25 3,00 2,50 3,00 2,83 4,00 2,50 3,00 3,17 4,00 3,00 3,00 3,33 6,00 5,00 4,00 5,00 26 3,75 2,50 2,00 2,75 7,00 5,50 4,25 5,58 7,50 6,00 5,00 6,17 9,00 9,50 7,00 8,50 27 0,00 0,00 0,00 0,00 3,25 3,00 2,00 2,75 4,00 3,25 3,75 3,67 4,50 3,50 4,25 4,08 C 0,00 0,00 0,00 0,00 1,75 3,25 2,50 2,50 3,25 4,00 2,75 3,33 3,75 5,25 4,75 4,58
N.D. No determinado.
118
Anexo 6. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica. Análisis de varianaza (ANOVA).
• Anova para el área total del halo de hidrólisis a través de los días de medición
• Anova para el área total del halo de hidrólisis durante el total de días de medición (Área bajo la curva)
119
• Anova para la comparación de las cepas en el día 3 de medición
• Anova para la comparación de las cepas en el día 5 de medición
120
• Anova para la comparación de las cepas en el día 7 de medición
• Anova para la comparación de las cepas en el día 9 de medición
121
Anexo 7. Estandarización de prueba para la evaluación cuantitativa de la Actividad
Quitinolítica.
*Actividad enzimática y actividad enzimática específica de cepa Control:
Cepa Control a 40 °C
Grado de concentración Proporción
Quitina coloidal Quitina en polvo U (µmol
/min) SD U/g
proteína SD U (µmol
/min) SD U/g
proteína SD
1X
1:1 0,00148 5,8E-05 58,28778 2,288436 0,00047 0,00066 5,05841 7,116591:2 0,00153 6,3E-05 60,22891 2,464603 0,00043 0,00048 4,66647 5,230281:4 0,0015 6,7E-05 58,98875 2,653758 0,00005 4,6E-05 0,54 0,49872
5X
1:1 0,00069 0,00069 26,14998 26,26322 0 5,5E-05 0 0,846511:2 0,00116 0,00052 44,31513 19,83871 9E-06 7,3E-05 0,13634 1,117971:4 0,00131 4,7E-05 50,16719 1,786939 0 3,6E-05 0 0,54849
10X
1:1 0,00128 8E-06 44,84637 0,295197 0 0,00012 0 1,7137 1:2 0,00134 1,5E-05 46,85764 0,528932 0 5,9E-05 0 0,828031:4 0,00133 4,9E-05 46,57031 1,709245 0 6,8E-05 0 0,96024
Cepa Control a 50 °C
Grado de concentración Proporción
Quitina coloidal Quitina en polvo
U (µmol /min) SD
U/g proteína SD
U (µmol /min) SD
U/g proteína SD
1X
1:1 0,001289 0,000049 50,73895 1,94879 0 5,9E-05 0 0,636839 1:2 0,001246 0,000059 49,06203 2,324857 0 0,00012 0 1,241167 1:4 0,001386 0,000282 54,567287 11,114668 0 2,5E-05 0 0,274018
5X
1:1 0,001378 0,000013 52,587467 0,499345 0 2,6E-05 0 0,400635 1:2 0,001389 0,000033 53,005658 1,269996 0 0,00003 0 0,455467 1:4 0,001358 0,000015 51,829497 0,569761 0 2,8E-05 0 0,424162
10X
1:1 0,001398 0,00003 48,868897 1,057863 0 3,9E-05 0 0,549899 1:2 0,001372 0,000002 47,95904 0,067723 0 3,4E-05 0 0,481274 1:4 0,001391 0,000055 48,629461 1,938101 0 0,00011 0 1,491007
122
*Actividad enzimática y Actividad enzimática específica de cepa 25:
Cepa 25 a 40 °C
Grado de concentración Proporción
Quitina coloidal Quitina en polvo U (µmol
/min) SD U/g
proteína SD U (µmol
/min) SD U/g
proteína SD
1X
01:01 0,001639 0,000013 63,53905 0,489854 0,000082 0,000241 0,673677 1,97607401:02 0,00164 0,000005 63,57954 0,212763 0,000244 0,00014 2,00396 1,14895401:04 0,001654 0,000018 64,100122 0,689102 0 0,000095 0 0,781338
5X
01:01 0,001504 0,00016 42,241361 4,503964 0,000548 0,000178 0,555423 0,18063501:02 0,00152 0,000078 42,708894 2,18477 0,000423 0,000128 0,428961 0,13013501:04 0,001515 0,000073 42,568366 2,044772 0,000056 0,000091 0,05693 0,092491
10X
01:01 0,001739 0,000336 33,708512 6,510632 0,000503 0,000367 1,032689 0,75252401:02 0,001588 0,000144 30,775606 2,798276 0,000223 0,000107 0,458052 0,21963101:04 0,001483 0,000082 28,731862 1,588985 0,000076 0,000085 0,155982 0,174783
Cepa 25 a 50 °C
Grado de concentración Proporción
Quitina coloidal Quitina en polvo U (µmol
/min) SD U/g
proteína SD U (µmol
/min) SD U/g
proteína SD
1X
01:01 0,001759 0,000241 67,944869 9,304028 0,000014 0,000058 0,11793 0,47907401:02 0,001667 0,000126 64,425918 4,868612 0,000147 0,000258 1,20631 2,1151 01:04 0,001538 0,000126 59,425303 4,874431 0,000068 0,00005 0,561136 0,413065
5X
01:01 0,001364 0,00001 38,404697 0,289192 0,000294 0,000225 0,298461 0,22826601:02 0,00139 0,000024 39,137317 0,66925 0,000129 0,000093 0,130498 0,09384201:04 0,001452 0,000163 40,872469 4,577848 0,000249 0,00026 0,251958 0,263835
10X
01:01 0,001447 0,000114 28,019688 2,198065 0,000766 0,000186 1,570899 0,38190301:02 0,001385 0,000027 26,820928 0,529203 0,000287 0,000259 0,589878 0,53044501:04 0,001374 0,000023 26,614063 0,44773 0,000663 0,001347 1,360419 2,764267
123
Anexo 8. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR). Enfrentamiento en cultivo dual actinomiceto.hongo fitopatógeno.
PICR: (Crecimiento libre - Crecimiento influenciado) X 100
Crecimiento libre
Evaluación de Antagonismo contra Rhizoctonia sp. en agar PDA
Cepa Réplica % de Inhibición
crecimiento radial 1 1 37,778 1 2 53,333 1 3 42,222 2 1 10,000 2 2 33,333 2 3 16,667 4 1 66,667 4 2 71,111 4 3 68,889 7 1 77,778 7 2 80,000 7 3 64,444
10 1 44,444 10 2 55,556 10 3 46,667 11 1 91,111 11 2 80,000 11 3 82,222 12 1 75,556 12 2 64,444 12 3 53,333 16 1 50,000 16 2 73,333 16 3 53,333 18 1 26,667 18 2 23,333 18 3 40,000 22 1 56,667 22 2 70,000 22 3 76,667 24 1 17,778 24 2 40,000 24 3 48,889 25 1 44,444 25 2 44,444 25 3 42,222 26 1 26,667 26 2 23,333 26 3 26,667 C 1 62,222 C 2 60,000 C 3 80,000
Evaluación de Antagonismo contra Fusarium sp. en agar PDA
Cepa Réplica % de Inhibición
crecimiento radial 2 1 50,000 2 2 50,000 2 3 45,000 4 1 57,500 4 2 57,500 4 3 55,000 5 1 82,500 5 2 75,000 5 3 77,500 7 1 85,000 7 2 87,500 7 3 87,500 8 1 80,000 8 2 85,000 8 3 87,500
11 1 80,000 11 2 80,000 11 3 80,000 12 1 82,500 12 2 82,500 12 3 77,500 16 1 80,000 16 2 82,500 16 3 85,000 18 1 32,500 18 2 37,500 18 3 37,500 22 1 60,000 22 2 52,500 22 3 60,000 24 1 37,500 24 2 50,000 24 3 50,000 25 1 62,500 25 2 67,500 25 3 70,000 26 1 45,000 26 2 30,000 26 3 50,000 C 1 60,000 C 2 65,000 C 3 67,500
124
Anexo 9. Porcentaje de inhibición de crecimiento radia. Análisis de varianza (ANOVA)
• Anova para el ajuste del modelo general para Rhizoctonia sp.
• Anova para el ajuste del modelo general para Fusarium sp.
125
Determinación de la actividad quitinolitica de cepas nativas de actinomicetos y su efecto antagónico sobre microorganismos fitopatógenos
Farfán‐Ayala, D. M., Franco‐Correa, M., Gutiérrez‐Triviño, C., Rodríguez‐Bocanegra, M.X.
RESUMEN: El papel ecológico de los actinomicetos en la rizosfera como microorganismos antagonistas ha generado gran interés en los últimos años. En el presente estudio se evaluó la producción de enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas por parte de cepas nativas de actinomicetos y su posible efecto antagónico sobre microorganismos fitopatógenos, Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. Se realizó un screening con 23 cepas de actinomicetos para determinar cuales presentaban actividad quitinolítica, se empleó medio mínimo suplementado con quitina coloidal 1% pH 6.8; 19 de las 23 cepas de actinomicetos evaluadas mostraron zona de hidrólisis después de 5 días de incubación a 25ºC. Por otro lado, para determinar la concentración más baja de quitina que permitía una mejor visualización de la hidrólisis enzimática, las cepas 4, 12 y 26 seleccionadas aleatoriamente fueron sembradas en medio mínimo suplementado con quitina coloidal al 0.5, 1 y 2%, la concentración de 1% fue la seleccionada para continuar con el ensayo en placa. Para evaluar la actividad quitinolítica de las 19 cepas, se realizó una prueba semicuantitativa en placa; por la técnica de pozos en medio mínimo quitina coloidal al 1%, inoculando 5 µL de una suspensión celular (107 cel·mL-1); tras un periodo de incubación de 9 días a 25ºC, las cepas 24 y 22 presentaron los promedios de diámetros de halos de hidrólisis más significativos 8,13 y 7,50 mm respectivamente, en comparación a las demás cepas en estudio; por el contario las cepas 11, 19 y 1 presentaron los promedios de diámetros de halo de hidrólisis más bajos o no evidenciables. Finalmente se evaluó el efecto antagónico de 13 cepas de actinomicetos sobre Rhizoctonia sp y Fusarium sp, para ello se realizó un enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo fitopatógeno. Las cepas 11, 7 y 4 presentaron los porcentajes de inhibición de crecimiento radial más altos para Rhizoctonia sp. con valores de 84.44, 74.07 y 68.89% respectivamente; para el caso de Fusarium sp, las cepas 7, 8, 16,12 y 11 generaron la mayor inhibición sobre su crecimiento radial, en donde los PICR obtenidos fueron 86,67, 84,17, 82, 50, 80,83 y 80% respectivamente. Tras el análisis de correlación, no se evidencio una variación representativa entre el área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Fusarium sp., indicando que posiblemente en el efecto antagónico generado también estuvieron involucrados otros mecanismos adicionales a la acción de las quitinasas.
Palabras claves: actinomicetos, quitinasas, quitina coloidal, antagonismo, fitopatógenos, Rhizoctonia sp., Fusarium sp.
ABSTRACT: Actinomycetes ecological roll, at rhizosphere, as antagonistic microorganisms has developed a huge interest in the last years. This study evaluated the production of hydrolytic enzymes, chitinases, by native actinomycetes strains and their possible antagonist effect against phytopathogens (Rhizoctonia sp. and Fusarium sp.). The first step was a screening of the actinomycetal strain, in order to determine chitinolytic activity. The strains were inoculated by streaking in a minimal medium supplemented with 1% colloidal chitin (pH 6.8); 19 of 23 evaluated strains showed a hydrolysis area after 5 incubation days at 25ºC. In order to determine the lower chitin concentration which allow the better enzymatic hydrolysis observation, strains 4, 12 and 26, randomly selected, were inoculated in minimal media supplemented with 0.5, 1 y 2% colloidal chitin, concentration of 1% was selected for plate enzymatic assay. A semi quantitative plate assay was performed to test the chitinolytic activity of the 19 selected strains; to develop this 4 wells were done on a 1% colloidal chitin minimal medium plate and then inoculated with 5 µL of a cells suspension (107 cell·mL-1). The plates were incubated at 25 ºC for 9 days. Strains 24 and 22 showed the most significant hydrolysis halos (8.13 and 7.50 mm, respectively); contrarily strains 11, 19 and 1 did not show or showed the smaller hydrolysis halos. Finally, the antagonist effect of 13 actinomycetal strains towards Rhizoctonia sp and Fusarium sp. was evaluated by dual cultures actinomycete/fungal phytopathogen. The highest radial growth inhibition percentages for Rhizoctonia sp., 84.44, 74.07 and 68.89% corresponded to strains 11, 7 and 4, respectively. In the case of Fusarium sp, strains 7, 8, 16, 12 and 11 showed the maximum inhibition percentages, 86.67, 84.17, 82.50, 80.83 and 80% respectively. A correlation test between the area under the curve values, obtained for semi quantitative chitinolytic activity, and radial growth inhibition percentages were performed in order to identify the correlation between this two variables. The results showed a correlation value of -0.264 between chitinolytic activity and Rhizoctonia sp.
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inhibition, and -0.505 between chitinolytic activity and Fusarium sp. inhibition, suggesting that the antagonist effect involves additional mechanism rather than chitinases activity.
Key words: actinomycetes, chitinases, colloidal chitin, antagonisms, phytopathogens, Rhizoctonia sp., Fusarium sp.
INTRODUCCION
La quitina es un homopolímero formado por residuos de N-acetil-D-Glucosamina con enlaces β-1,4. Se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza como un componente estructural de hongos (22% - 44%), insectos y crustáceos (25% - 58%) y protozoos (Hoster et al; 2005, Mukherjee y Sen, 2006; Bhattacharya et al., 2007). La quitina es hidrolizada por un complejo quitinasa que comprende tres enzimas: exoquitinasa, endoquitinasa y β-N-acetilglucosaminidasa. La primera hidroliza el extremo no reductor de la cadena de quitina; la segunda cliva los enlaces internos β- 1,4 glicosídicos de N-acetilglucosamina y la última hidroliza unidades secuenciales de N-acetilglucosamina en el extremo no reductor del sustrato. El clivaje enzimático que realizan las quitinasas se lleva a cabo aleatoriamente en la naturaleza en toda la estructura del polímero, esto genera la liberación de compuestos solubles de bajo peso molecular de N-acetilglucosamina como quitotetraosa, quitotriosa, quitobiosa y pequeños oligosacáridos los cuales resultan ser los más predominantes y pueden ser utilizados como sustrato por la β-N-acetilglucosaminidasa (Sastoque, 2006; Bhattacharya et al., 2007). Las quitinasas son glicosil hidrolasas y se encuentran presentes en una gran variedad de organismos tales como bacterias, hongos, insectos, plantas y animales (Hoster et al., 2005). Las bacterias producen quitinasas principalmente para degradar quitina y usarla como fuente de energía. Adicionalmente, algunas quitinasas de bacterias quitinolíticas son agentes potenciales para el control biológico de enfermedades de plantas causadas por
diversos hongos fitopatógenos, pues hidrolizan la quitina presente en la pared celular del hongo (De la Cruz et al., 1992).
Los actinomicetos son bacilos Gram positivos que se caracterizan por formar filamentos ramificados (Ezziyyani et al., 2004). Su pared celular está compuesta por peptidoglucano presentan resistencia a los antifúngicos y la disposición de su material genético es típicamente procariótica (Salazar et al., 1997), aunque se caracterizan por presentar un alto contenido de guanina y citosina en su ADN, siendo éste superior al 55%. Estas bacterias son aerobias y anaerobias, pudiéndose
encontrar en animales o en el hombre; son heterótrofas, por lo cual pueden utilizar fuentes de carbono simples, complejas y compuestos moleculares orgánicos tales como ácidos, azúcares, polisacáridos, lípidos, proteínas e hidrocarburos alifáticos. Utilizan como fuentes de nitrógeno amonio, nitratos, aminoácidos, peptonas y un gran número de proteínas (Leveau y Bouix, 2000).
Los actinomicetos se consideran los organismos dominantes involucrados en la descomposición de quitina en el suelo (Ames, 1989), de igual manera, han sido mencionados como agentes antagonistas prometedores para el biocontrol debido a la reacción de hidrólisis sobre el micelio de los hongos en suelos ácidos y hojarascas que catalizan estas enzimas (Gomes et al., 2001).
Teniendo en cuenta esto, el papel de las quitinasas de los actinomicetos en la actividad fúngica podría ser estudiada, ya que estos microorganismos pueden contribuir a su planta hospedera con alguna protección natural contra infecciones, participando en técnicas de control biológico llegando a ser una aproximación importante para facilitar la agricultura sostenible (Wang et al., 2002; Taechowisan et al., 2003).
Esta investigación busca determinar la capacidad de cepas nativas de actinomicetos para producir enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas. Adicionalmente pretende evaluar el efecto antagónico de estos microorganismos sobre algunos hongos fitopatógenos, de tal manera que en un futuro pueda ser establecida la relación existente entre las enzimas producidas y el antagonismo generado por aquellas cepas en las cuales así sea evidenciado.
METODOLOGÍA
RECONSTITUCIÓN DE CEPAS DE ACTINOMICETOS
Se realizó la reconstitución de 23 aislamientos de actinomicetos, tomados del banco de cepas del laboratorio UNIDIA de la Pontificia Universidad Javeriana y de la cepa de Streptomyces sp. proporcionada por el Laboratorio de Biotecnología, estudiada como cepa
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quitinolítica por Sastoque (2006), la cual fue empleada como cepa Control.
Se tomaron 40mL de medio avena líquido ((Avena en hojuelas 3% y azúcar 20% (p/v)), y se inocularon con 100 µL de cada uno de los aislamientos crioconservados. Cada medio inoculado se incubó en agitación a 120 rpm durante 5 días a 20ºC. A continuación se sembraron placas de agar avena suplementado con nistatina 0.1% (v/v) y se incubaron a 25ºC durante 10 días, obteniéndose así el banco de trabajo constituido por 24 aislamientos, el cual se mantuvo viable por pases sucesivos en agar avena.
EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA
Preparación de quitina coloidal
La quitina coloidal fue preparada siguiendo el protocolo de Skujins y colaboradores (1965) modificado por Rodríguez (2001) con una variación en el volumen a utilizar de H3PO4. Para su efecto se tomaron 10 g de quitina comercial (SIGMA) y se disolvieron en 150 mL de H3PO4 concentrado (85%), la mezcla fue dejada en agitación durante 48 h a 4ºC. La solución resultante fue filtrada empleando fibra de vidrio, posteriormente se adicionó etanol acuoso al 50% alcanzando un volumen final de 300 ml. A continuación la mezcla se colocó en agitación hasta que se observó una solución homogénea y de aspecto coloidal. Se realizaron 15 lavados con agua destilada mediante centrifugación a 4500 x g a una temperatura de 10ºC con el fin de alcanzar un pH cercano a la neutralidad, la concentración final de la quitina coloidal fue estimada de acuerdo al volumen final obtenido. La quitina coloidal empleada para el ensayo de actividad enzimática fue dializada contra agua destilada durante 48 h.
Evaluación de producción de quitinasas en placa
Selección de cepas quitinolíticas
Se realizó un screening a partir del banco de trabajo con el fin de seleccionar las cepas de actinomicetos que presentaban actividad quitinolítica. Las cepas de actinomicetos fueron sembradas por método de estría en medio mínimo, preparado a partir de soluciones stock de K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v), MgSO4.7H2O 1.5 % (p/v), CaCl2, FeCl3 y NaCl a una concentración de 0.5%, 0.06% y 0.5% (p/v) respectivamente, utilizando NH4Cl. 0.1% como fuente de nitrógeno (Hoster et al., 2005; Franco, 2008). El medio fue suplementado con quitina coloidal al 1% (p/v) como única fuente de carbono. Para determinar la viabilidad de las cepas, se empleó medio mínimo suplementado con glucosa 1% (p/v) como única fuente de carbono, el pH de los medios de cultivo fue
ajustado a 6.8. Después de 5 días de incubación a 25ºC las cepas que presentaron zonas de hidrólisis en el medio con quitina coloidal 1% (p/v), fueron consideradas como posibles cepas productoras de quitinasas; se seleccionaron 19 cepas del banco para continuar con el estudio.
Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica
La concentración óptima de quitina coloidal para el estudio se determinó empleando las cepas 4, 12, 26 (seleccionadas al azar) y Control, previamente seleccionadas como cepas quitinolíticas en la evaluación en placa; éstas fueron sembradas en medio mínimo con 3 concentraciones de quitina coloidal: 0,5, 1 y 2% (p/v) (Taechowisan et al., 2003) para determinar la concentración más baja que permitía una mejor visualización de la hidrólisis enzimática; dichas concentraciones fueron evaluadas por triplicado para cada una de las cepas ya mencionadas.
Determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica
A partir de cada una de las cepas de actinomicetos seleccionadas para el estudio se realizó un recuento de conidios en Cámara de Neubauer hasta obtener un inóculo de 107 cél.mL-1. A cada caja de petri estéril se le adicionaron 30 mL de medio mínimo con quitina coloidal 1% (p/v) pH 6.8, para formar una capa de espesor grueso, posteriormente se realizaron cuatro pozos con capacidad de 30 µL a una distancia equidistante, a continuación se agregaron 20 µl de agar agua con el fin de conformar una capa sellante, y sobre esta capa se adicionaron 5 µL del inóculo. Este procedimiento se realizó en los cuatro pozos formados. Los volúmenes empleados se seleccionaron de acuerdo a la estandarización realizada. El montaje fue llevado a cabo por triplicado para cada una de las cepas evaluadas. Las placas de petri se llevaron a incubar a una temperatura de 25ºC por un período de 9 días, y se realizaron mediciones del diámetro de los halos de hidrólisis que se iban formando en el medio los días 3, 5, 7 y 9.
ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO
Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de actinomicetos se realizó un enfrentamiento en cultivo dual, actinomiceto/hongo fitopatógeno siguiendo una combinación de los protocolos de Crawford y colaboradores (1993) y Gravel y colaboradores (2005). Los patógenos evaluados se seleccionaron por ser hongos asociados a
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enfermedades del suelo presentes en trébol blanco: Rhizoctonia sp. y Fusarium sp., proporcionados por el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia y el Laboratorio de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana respectivamente.
Se realizó una siembra masiva ocupando un espacio de 3 cm de distancia a partir de uno de los extremos de la caja de cada una de las cepas evaluadas en agar PDA pH 6.8 por triplicado, posteriormente éstas fueron puestas en incubación a 25ºC durante 10 días, hasta observar la esporulación de las colonias. A continuación se inóculo un disco de agar YGC de 0.5 cm donde previamente se encontraba crecido el hongo a evaluar (Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.) a una distancia de 3 cm del extremo opuesto a la siembra del actinomiceto. Por otro lado se evaluó la viabilidad del hongo fitopatógeno sin interactuar con otro microorganismo, el cual fue inoculado por técnica de disco de agar en el centro de una caja de petri con agar PDA; después de 8 días de incubación se realizó la medición del crecimiento libre e influenciado del fitopatógeno con el fin de determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento radial del fitopatógeno (PICR) generado por el actinomiceto, el cual fue calculado mediante la siguiente fórmula:
PICR: (Crecimiento libre - Crecimiento influenciado) X
100 Crecimiento libre
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos en la evaluación de actividad qutinolítica y en el ensayo de la actividad antifúngica in vitro fueron sometidos a un análisis de varianza de clasificación simple (ANOVA), siendo las medias con diferencias significativas comparadas según la prueba de rangos múltiples de Duncan para P≤0.05, con el fin de determinar si las variables en estudio cepa, días y réplicas y cepa y réplicas, respectivamente, presentaban variabilidad en el modelo. Adicionalmente se realizó un análisis del comportamiento del diámetro de los halos de cada una de las cepas evaluadas según el área bajo la curva para observar así la tendencia general a través del tiempo, para ello se empleó la fórmula reportada por Istifadah y colaboradores (2006), en donde Y correspondia al diámetro del halo y t al día de medición.
Por otro lado se realizó una correlación de Pearson entre los valores de área bajo la curva obtenidos en la determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica y los porcentajes de inhibición de
crecimiento radial (PICR), para identificar la relación líneal existente entre estas dos variables cuantitativas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
RECONSTITUCIÓN DE LAS CEPAS DE ACTINOMICETOS
Para la realización del estudio se seleccionaron 23 aislamientos de actinomicetos del banco de cepas del grupo UNIDIA de la Pontificia Universidad Javeriana. Los viales con las cepas de actinomicetos conservadas en glicerol, se reconstituyeron para contrarrestar el estrés generado por la congelación que afecta la actividad metabólica del microorganismo, garantizando la estabilización y recuperación total de los procesos moleculares (Sánchez y Corrales, 2005). Se empleó medio avena líquido, que posiblemente favoreció el intercambio molecular iónico y la recuperación de la actividad metabólica de la membrana celular rápidamente (Sánchez y Corrales, 2005).
Evaluación de la producción de quitinasas en placa
Selección de las cepas quitinolíticas
De los 23 aislamientos de actinomicetos evaluados, 19 fueron capaces de utilizar la quitina coloidal como única fuente de carbono, mostrando crecimiento y presentando una zona de hidrólisis alrededor de la colonia, indicando actividad quitinolítica (Kamil et al., 2007; Swiontek et al., 2007). En contraste, las cepas identificadas como 6, 9, 23 y 30 presentaron crecimiento pero no halo de hidrólisis, por lo cual no fueron consideradas como cepas quitinolíticas y en consecuencia fueron eliminadas del estudio; probablemente trazas de azúcar del medio avena les permitió alcanzar un crecimiento muy leve sobre este medio de cultivo, teniendo en cuenta que los actinomicetos son nutricionalmente versátiles, siendo capaces de crecer en un medio con limitación de nutrientes (El-Nakeeb y Lechevalier, 1962; Thangapandian et al., 2007).
Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica
Se realizó un montaje tomando 3 cepas aleatoriamente (Cepas 4, 12 y 26), previamente seleccionadas como quitinolíticas en la evaluación en placa. Dichas cepas fueron sembradas en medio mínimo utilizando tres concentraciones de quitina coloidal reportadas en la
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literatura 0.5% (Shanmugaiah et al., 2008), 1% (Kamil et al., 2007) y 2% (Ogawa et al., 2002; Salazar et al., 2006;). A la concentración de 0.5%, las zonas de hidrólisis que rodeaban las colonias de las bacterias eran difíciles de visualizar, a las concentraciones 1 y 2% se evidenció un aumento en la hidrólisis, generándose un aumento en la claridad del medio, por tal motivo se decidió emplear la concentración de 1% (siendo la menor concentración de las dos que se visualizaron) para la realización de la prueba semicuantitativa, teniendo en cuenta factores económicos y el prolongado tiempo que toma la preparación de este sustrato. La razón por la que las zonas de hidrólisis no fueron visualizadas al emplear una concentración de 0.5%, puede deberse al hecho que la inducción de la producción de quitinasas se ve estimulada por el incremento de la concentración de la quitina coloidal (Sharaf, 2005). Adicionalmente el emplear una concentración más alta de quitina coloidal posiblemente genera una opacidad visual del medio, lo que puede facilitar la observación de los halos de hidrólisis.
Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica
La actividad quitinolítica fue detectada semicuantitativamente para cada una de las cepas en medio quitina coloidal al 1%, siguiendo la metodología de siembra en pozo. La cepa control de Streptomyces sp, previamente había mostrado producir quitinasas según estudios realizados por Sastoque (2006), motivo por el cual fue usada como cepa control para el estudio. El tamaño de las colonias y los halos fue medido. Las cepas 24 y 22 mostraron tener un buen potencial quitinolítico evidente por su crecimiento e hidrólisis de quitina en placa, presentando un halo de hidrólisis de 8.133 y 7.508 mm respectivamente, indicando una mejor difusión de las enzimas quitinolíticas (Ahmadi et al., 2008). Por el contrario las cepas 1 y 19 no generaron halo de hidrólisis y en la cepa 11 el diámetro de hidrólisis alcanzado (0.125 mm) después de los 9 días de evaluación fue muy pequeño en comparación a las demás cepas en estudio. Estos resultados pueden ser explicados como consecuencia de la concentración de inóculo empleada, ya que ésta pudo no haber sido suficiente para lograr observar un efecto hidrolítico en el medio de cultivo, teniendo en cuenta los estudios de Patidar y colaboradores (2005) quienes observaron un incremento lineal en la producción de quitinasas cuando la concentración del inóculo aumentaba. Por otro lado es posible que se haya presentado una pérdida de actividad por parte de estas cepas debido a una unión inespecífica del centro activo de la enzima (quitinasas) con el sustrato (quitina) (Álvarez y Del-Barrio, 2008). De igual manera puede que estas cepas hayan perdido su actividad quitinolítica, teniendo en cuenta lo encontrado previamente en donde se ha señalado que subcultivos continuos pueden tener efectos negativos en la
producción de metabolitos secundarios por parte de los microorganismos (Taddei et al., 1999).
Se realizó un ANOVA analizando el área bajo la curva (teniendo en cuenta los cuatro tiempos de evaluación), en donde la variable de interés fue el área del halo de hidrólisis generado alrededor de las colonias crecidas en medio quitina coloidal al 1%. Los resultados mostraron que el modelo general es estadísticamente significativo y permite identificar la variabilidad que existe en la variable de interés. De igual manera la variable cepa mostró explicar el comportamiento del crecimiento del área del halo, y la variable réplica se comportó como tal.
La comparación entre los promedios de áreas de halo de hidrólisis por cepas y por días fue realizado por medio de la prueba del rango múltiple de Duncan para áreas bajo la curva, los resultados demuestran que existen diferencias estadísticamente significativas entre éstos, de manera tal que permitieron conformar seis grupos de acuerdo a la similitud de los valores de sus medias con variaciones desde aproximadamente 49 hasta 0.5, en donde el primer grupo estuvo conformado por las cepas 22 y 24 con valores de 48.817 y 44.317 respectivamente, por el contrario en el último grupo se presentaron valores de 0.5, 0 y 0 para las cepas 11, 19 y 1 respectivamente.
Por otro lado, con el fin de comparar la medición (mm) de los halos formados a través de los días de evaluación por cada una de las cepas, se tomaron los datos iniciales sin calcular el área total de crecimiento del halo durante los 9 días de medición, calculando el promedio de los datos de diámetro de los halos obtenidos en los cuatro tiempos de medición. De acuerdo al análisis de varianza realizado, el modelo mostró ser adecuado, de igual manera las variables cepa y día incluidas en el modelo resultaron ser válidas pues presentaron un p- valor de <0.0001. Este resultado coincide con lo esperado, teniendo en cuenta que la medición del diámetro del halo es diferente en los tiempos de evaluación. Por su parte, la variable réplica presentó nuevamente un p - valor superior a 0.05 (0.2333), lo que confirmó que las réplicas no presentaron diferencias significativas entre ellas. Se obtuvieron nuevamente resultados significativos entre los resultados que conllevaron a la formación de 6 grupos, en donde se observa que las cepas 24 y 22 permanecieron en una posición superior en relación a las demás cepas, como consecuencia de haber presentado los mayores diámetros de halo (8.1333 y 7.5083). Los resultados muestran que el ordenamiento de las cepas y los grupos conformados según el agrupamiento de Duncan en función de los promedios de los diámetros de los halos, en los cuatro tiempos de medición es el mismo que el obtenido con los datos para el área bajo la curva, siendo así buenas aproximaciones para observar el comportamiento general de los aislamientos en el transcurso del tiempo de evaluación.
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Para evaluar las diferencias del comportamiento de las mediciones de los halos del total de las cepas por día, se realizó un agrupamiento de Duncan que mostró presentar diferencias significativas entre cada uno de los días de medición. Según los resultados obtenidos, el tamaño del halo aumentó en función del tiempo, conformándose así 4 grupos, en donde se evidenció que la mayor variación se presentó entre los días 3 y 5. Esto coincide con lo señalado por Gadelhak y colaboradores (2005) y Tsay y colaboradores (2006), quienes reportaron un periodo de 5 días para la producción de quitinasas en placa para Streptomyces sp y actinomicetos en general respectivamente.
Con el fin de realizar la comparación de las cepas dentro de cada uno de los días de medición, se decidió realizar un nuevo agrupamiento, para cada día de medición se ajustó un modelo de análisis de varianza. Los p -valor obtenidos para el modelo fueron <0.0001 para todos los días de evaluación, indicándonos que el modelo es bueno y expresa variabilidad. El mismo resultado fue obtenido para la variable cepa por lo que nuevamente se infiere que valores de medición estadísticamente significativos fueron obtenidos dependiendo de cada una de las cepas. En el caso de la variable réplica los valores obtenidos fueron: 0.1844; 0.1384; 0.5460 y 0.3359, para los días 3, 5, 7 y 9 respectivamente. Como se observa, se encontraron valores por encima de 0,05, explicando una vez más que experimentalmente la variable réplica se comporta adecuadamente. De esto se obtuvo la formación de distintos grupos dependiendo del día de medición. En el día 3 se obtuvieron 4 grupos, en el día 5 se formaron 5 grupos y en los días 7 y 9 se observó la conformación de 6 grupos.
La máxima medición alcanzada se observó al día 9 (11.4 mm), diversos autores señalan que un tamaño de halo significativo debe encontrarse por encima de los 5 mm (Taechowisan et al., 2003; Shanmugaiah et al., 2008), por lo tanto, bajo esta condición, solo las cepas 2, 14, 22, 24, 25 y 26 superarían lo que la literatura presenta. Sin embargo, para efectos del estudio, todas las cepas que presentaron hidrólisis enzimática fueron seleccionadas para la prueba de antagonismo, teniendo en cuenta que los datos preliminares no siempre coinciden con la información obtenida en un screening secundario, que por lo general consiste en pruebas cuantitativas de la enzima secretada por las cepas en medio líquido, a lo largo de diferentes tiempos de incubación (Gómez et al., 2004). Es importante resaltar que de las 19 cepas en evaluación, aproximadamente el 53% presentaron actividad quitinolítica en placa superiores a las obtenidas en la cepa control, para las condiciones de evaluación.
A pesar que, en los días definidos de medición se obtuvo la formación de diferente número de grupos, y que estos pertenecían a diversas cepas, los máximos y los mínimos a partir del día 5 siempre fueron conservados. Se encontraron cepas como las 2, 12, 21, 27 y control,
en las cuales no se evidenció la formación de un halo de hidrólisis al día 3 de medición, pero si al día 5 de medición; teniendo en cuenta que se trabajaron cepas diferentes, el metabolismo entre una y otra pudo haber variado generando la hidrólisis de la quitina en diferentes tiempos; estudios previos con actinomicetos han señalado diferentes tiempos de incubación para poder evidenciar el halo de hidrólisis, El Fiky y colaboradores (2003) estudiaron un tiempo de incubación de 3 días para que las zonas de hidrólisis fueran evidenciadas, por el contrario Ahmadi y colaboradores (2008) y Shamungaiah y colaboradores (2008) evidenciaron los halos de hidrólisis a los 10 y 5 días de incubación respectivamente. Como se mencionó anteriormente las variaciones más representativas en relación al tamaño del halo se presentaron entre los días 3 y 5 de medición, en algunas cepas ésta variación se hizo menos notoria a lo largo del tiempo de evaluación, esto pudo deberse a una disminución en la producción de quitinasas por efecto de la represión por catabolitos. Estudios previos realizados por Leisner y colaboradores (2008) demostraron que cuando adicionaron glucosa a placas con agar quitina se generó una reducción en el tamaño de las zonas de aclaramiento sugiriendo de esta manera que la actividad quitinasa está sujeta a la represión catabólica.
ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO
El ensayo de antagonismo in vitro mostró que el 100% de los aislamientos evaluados presentaron antagonismo en mayor o menor grado frente a los hongos fitopatógenos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. en placas de PDA tras 8 días de incubación, para las condiciones evaluadas. Este valor resulta ser alto en comparación con los resultados obtenidos por Iznaga y colaboradores (2003), quienes encontraron que de 563 actinomicetos aislados de suelos cubanos, 286 mostraron producir componentes con actividad antifúngica, y Valois (1996) quien reportó una inhibición de Phytophthora sp. por el 72% de las cepas de actinomicetos estudiadas.
Duque y Quintana (2008) trabajaron previamente con las cepas 10, 16, 24 y 26 incluidas en este estudio, en donde evaluaron el efecto antagónico de estos microorganismos sobre Fusarium oxysporum, empleando al igual que en la presente evaluación la técnica de enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo fitopatógeno, utilizando agar avena e incubando los cultivos a 28 ºC por 5 días, después de los cuales determinaron el porcentaje de inhibición micelial obteniendo un valor de cero; pudo haber ocurrido que el medio empleado en el presente estudio hubiese favorecido la producción de metabolitos. Whipps (1987) encontró que el medio de crecimiento empleado genera efectos significativos en la morfología y en el desarrollo de los patógenos, así mismo en la producción de antibióticos volátiles y no volátiles producidos por los
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agentes antagonistas y en las respuestas de los agentes patógenos a estos antibióticos. De igual manera estudió que el medio afecta la competencia y las interacciones miceliales entre los patógenos y los antagonistas. Ezziyyani y colaboradores (2004) también demostraron que el grado de inhibición puede variar por factores como la temperatura, el pH y el medio de cultivo empleado, demostrando que el medio PDA intensifica la inhibición. También se ha encontrado que el modo de acción de los antagonistas varía de acuerdo al tipo de fitopatógeno enfrentado; De Boer y colaboradores (1998) en su estudio demostraron que el 12% de las bacterias quitinolíticas antagonistas generaron inhibición de Fusarium oxysporum, mientras que el 56% inhibió el crecimiento micelial de Fusarium culmorum.
Se realizó un análisis de varianza con el fin de evaluar el modelo en general para cada uno de los fitopatógenos evaluados. En el caso de Rhizoctonia sp. se presentó un p-valor <0.0001 indicando que el modelo es estadísticamente significativo. Adicionalmente, para la variable cepa se obtuvo un p – valor <0.0001 mostrando que hay variabilidad entre las cepas evaluadas. Por otro lado se encontró que las réplicas no presentaron entre sí diferencias significativas arrojando un p – valor de 0.2232 confirmando que actuaron como tales en el estudio. Por otro lado se realizó un agrupamiento de Duncan en donde se observa la formación de cuatro grupos; el mayor porcentaje promedio de inhibición se presentó en las cepas 11, 7 y 4, presentando valores de 84.44; 74.07 y 68.89% respectivamente; por el contrario las cepas 24, 18, 26 y 2 mostraron los PICR más bajos con resultados de 35.56; 30.00; 25.56 y 20.00 respectivamente.
Al igual que en el modelo general de análisis de varianza de Rhizoctonia sp., el modelo establecido para Fusarium sp. mostró ser adecuado, pues presentó un p – valor inferior a 0.0001. De igual manera se observó que existen diferencias estadísticamente significativas entre los PICR de las cepas evaluadas y que la variable réplica al presentar un p – valor de 0.2982 no presentó diferencias significativas confirmando su validez en el estudio. Por otro lado, se realizó un agrupamiento de Duncan y se obtuvo la formación de 6 grupos, las comparaciones de media de porcentaje de inhibición entre las cepas evaluadas para Fusarium sp. mostraron que los datos más altos fueron obtenidos para las cepas 7, 8, 16, 12 y 11 con los siguientes valores: 86.67; 84.17; 82.50; 80.83 y 80.00% respectivamente y los más bajos para la cepa 18 con un porcentaje de 35.83. De las 13 cepas evaluadas en el enfrentamiento dual contra los hongos fitopatógenos, el 30.77% presentaron inhibiciones miceliales contra Rhizoctonia sp. superiores a las evidenciadas con la cepa Control, y el 53.85% superaron esta última en el enfrentamiento contra Fusarium sp.
Se determinó la correlación entre las variables porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp., porcentaje
de inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de quitinasas evaluadas. Los resultados muestran que la correlación más baja se presentó entre las variables área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp., ya que el valor fue cercano a cero, adicionalmente se observa que la correlación presenta un valor negativo lo que indica una relación inversamente proporcional entre las dos variables. Por su parte una correlación media fue establecida para las variables porcentaje de inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de quitinasas, de igual manera en este caso la correlación indicó una relación inversamente proporcional. La correlación más alta se encontró entre las variables PICR para Rhizoctonia sp. y PICR para Fusarium sp., indicando una relación directamente proporcional. Los resultados muestran que no existe una correlación significativa entre la producción de quitinasas evaluadas en la prueba semicuantitativa y la inhibición de crecimiento radial generada sobre los agentes fitopatógenos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. Es probable que la inhibición del crecimiento de los fitopatógenos esté dada por acción de otros compuestos antifúngicos y no propiamente por enzimas hidrolíticas de tipo quitinasas (Prapagdee et al., 2008). Es importante mencionar que en el momento en el que se inoculó el agente fitopatógeno, el microorganismo antagonista ya se encontraba esporulado al llevar 11 días de incubación previa, esto con el fin de seguir lo reportado por Duque y Quintana (2008) quienes recomiendan dar una ventaja al antagonista para la colonización del medio, con el fin de esperar la generación y difusión de metabolitos con actividad antifúngica en el medio (amensalismo). Augustine y colaboradores (2005) encontraron que la producción de antibióticos usualmente ocurre en la fase estacionaria pudiéndose así suponer que la inhibición de los agentes fitopatógenos pudo estar relacionada con éstos metabolitos secundarios, sumado al hecho de que la producción de antibióticos forma parte de la transición de las células vegetativas a propágulos en actinomicetos como Streptomyces sp. (Duque y Quintana, 2008). Todos los actinomicetos evaluados que mostraron presentar inhibición micelial de los agentes fitopatógenos exceptuando las cepas 11 y 1 presentaron actividad quitinolítica para el ensayo en placa. De acuerdo al análisis de correlación realizado entre el área bajo la curva calculado para las quitinasas en la prueba semicuantitativa y el PICR para los agentes fitopatógenos evaluados, se observa que en general las cepas que presentaron una mayor actividad quitinolítica en placa mostraron la menor inhibición micelial de los hongos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. De Boer y colaboradores (1998) señalaron que a pesar de evidenciar la producción de enzimas del tipo quitinasas, en algunos casos el hongo a controlar no resulta ser afectado, indicando de esta manera que la producción de estas enzimas no genera siempre a un efecto antifúngico. Por otro lado, el caso contrario fue
132
observado; cepas como la 11, 7 y 16 que presentaron halos de hidrólisis de quitina con diámetro inferiores en comparación a las otras cepas evaluadas, mostraron un alto porcentaje de inhibición en la prueba del enfrentamiento dual, observándose de ésta manera un comportamiento inverso al esperado. En aquellos casos en los que la inhibición del crecimiento micelial no estuvo relacionada con la producción de quitinasas, pudieron haberse presentado mecanismos alternos, tales como la producción de antibióticos y productos tóxicos para los hongos, los cuales se difunden en el medio generando una pigmentación del mismo (Valois 1996).
Para poder determinar si existe una correlación entre la producción de quitinasas y el efecto antagónico, sería conveniente proporcionar las condiciones necesarias para que el actinomiceto secretara las quitinasas y posteriormente éstas generaran un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los hongos fitopatógenos. Para esto podría emplearse la técnica de la doble capa de agar, utilizando una capa de base de medio mínimo suplementado con quitina coloidal, de manera tal que las quitinasas se vieran inducidas, y que al adicionar la segunda capa éstas se difundieran en el medio de cultivo, ésta segunda capa podría ser de agar PDA ya que éste mostró ser un medio óptimo para el crecimiento de los hongos fitopatógenos evaluados. De esta manera, posterior a la inoculación se podría realizar un seguimiento del crecimiento radial empleando como control la misma técnica pero reemplazando el medio base por uno con otra fuente de carbono como por ejemplo glucosa. Otra posibilidad, sería emplear extracto enzimático obtenido de una inducción previa con quitina coloidal tal como lo reportan Prapagdee y colaboradores (2008), difundiéndolo sobre un medio favorable para el desarrollo del agente fitopatógeno e inoculando posteriormente un disco de agar con el hongo previamente crecido y observar de ésta manera la inhibición del crecimiento radial de éste.
Es importante tener presente que no puede excluirse que las quitinasas hayan contribuido a la actividad antifúngica evidenciada en este estudio en aquellas cepas en las que por medio de la prueba semicuantitativa se observó la producción de estas enzimas. Es posible que se haya generado una sinergismo durante la interacción en el proceso de inhibición de los crecimientos miceliales de los hongos fitopatógenos entre las enzimas del tipo quitinasas y los metabolitos antifúngicos, y/o entre diversas enzimas hidrolíticas tales como proteasas y/o β-1,3-glucanasas (De Boer et al., 1998), teniendo en cuenta que la correlación entre los porcentajes de inhibición de crecimiento radial y los valores de área bajo la curva para producción de quitinasas no fue significativa. De igual manera, Valois (1996) postuló una posibilidad con respecto a este mecanismo de sinergia, en donde sugiere que posiblemente los metabolitos antifúngicos podrían evitar el crecimiento de Phytophtora sp. perjudicando su mecanismo de defensa, mientras las
enzimas hidrolíticas, por degradación de la pared celular podrían contribuir a la lisis celular del patógeno y adicionalmente proveer nutrientes adicionales a la población antagonista. Por el tipo de investigación desarrollada, dichas sustancias no fueron identificadas por lo que no se llegó a dilucidar la razón por la que dichos resultados fueron obtenidos.
CONCLUSIONES
• El 83% (19 de 23) de los aislamientos de los
actinomicetos evaluados mostraron halo de
hidrólisis en el medio quitina coloidal durante
el screening inicial.
• La quitina coloidal al 1% resultó ser la
concentración más baja que permitió la mejor
visualización de la hidrólisis enzimática en la
prueba semicuantitativa en placa.
• El 53% de las cepas evaluadas en la prueba
semicuantitativa presentaron actividades
quitinolíticas superiores a las obtenidas con la
cepa control, por lo que pueden ser tenidas en
cuenta para estudios posteriores.
• Las cepas 22 y 24 mostraron la mayor
hidrólisis de la quitina coloidal en el ensayo
semicuantitativo en placa, con promedios de
diámetros de halos de hidrólisis de 8.13 y 7.50
mm respectivamente, presumiendo la
posibilidad de ser cepas con alta actividad
quitinolítica.
• El ensayo de antagonismo in vitro permitió
evidenciar la capacidad de las cepas
evaluadas para inhibir el crecimiento de
Rhizoctonia sp y Fusarium sp con promedios
de porcentajes de inhibición desde 20 hasta
84.4% y desde 35.83 hasta 86.67%,
respectivamente.
• La cepa 11 presentó el máximo porcentaje de
inhibición de crecimiento radial (PICR) contra
Rhizoctonia sp siendo éste de 84,44%, por su
lado el PICR más alto (86,67%) en el
antagonismo contra Fusarium sp fue obtenido
con la cepa 7.
• Las cepas en general presentaron una
actividad antifúngica no específica por especie
133
de patógenos ya que la correlación de la
inhibición entre los dos agentes fitopatógenos
fue representativa. Sin embargo, no se
encontraron valores significativos de
correlación entre la actividad quitinolítica y la
actividad antagónica de los actinomicetos
evaluados.
BIBLIOGRAFÍA
• Ahmadi, K., Yazdi, T., Najafi, M., Shahverdi, A.R., Faramarzi, M.A., Zarnini, G., Behravan, J. 2008. Optimization of Medium and
Cultivation Conditions for Chitinase Production
by the Newly Isolated: Aeromonas sp.
Biotechnology. 7: 266-272.
• Álvarez, A., Del Barrio, G. 2008. Propiedades
antivirales de plantas del género Phyllanthus.
Universidad de La Habana. Facultad de
Biología.[Online].http://www.bvs.sld.cu/revistas
/far/vol42_1_08/far11108.htm. Acceso 20 de
Enero de 2009.
• Ames, R.N. 1989. Mycorrhiza development in
onion in response to inoculation with chitin-
decomposing actinomycetes. New Phytologist-
Journal Information. 112: 423-427.
• Augustine, S., Bhavsar, S., Kapadnis, B. 2005. Production of a growth dependent
metabolite active against dermatophytes by
Streptomyces rochei AK 39. Indian Journal of Medical Research. 121: 164-170.
• Bhattacharya, D., Nagpure, A., Gupta, R. 2007. Bacterial Chitinases: Properties and
Potential. Critical Reviews in Biotechonology.
27: 21-28.
• Crawford, D., Lynch, J., Whipps, J., Ousley, M. 1993. Isolation and Characterization of
Actinomycete Antagonists of a Fungal Root
Pathogent. Applied and Environmental
Microbiology. 59: 3899-3905.
• De Boer, B., Gunnewiek, K., Lafeber, P., Janse, J., Spit, B., Woldendorp, J. 1998. Antifungal properties of chitinolytic dune soil
bacteria. Soil Biology and Biochemistry 30:193-203.
• De la Cruz, J., Hidalgo-Lora, J., Benitez, T., Pintor, J., Llobell, A. 1992. Isolation and
characterization of three chitinases from
Trichoderma havzianum. European Journal of
Biochemistry. 206: 859-867.
• Duque, C.; Quintana, M. 2008. Determinación Preliminar de la Actividad
Promotora de Crecimiento Vegetal de
Actinomycetes Aislados de Suelo. Trabajo de
grado. Pontificia Universidad Javeriana,
Bogotá. Director. Marcela Franco Correa. Co
director. María Ximena Rodríguez. pp. 126.
• El-Fiky, Z., Mansour, S., El-Zawhary, Y., Ismail, S. 2003. DNA-fingerprints and
phylogenetic studies of some chitinolytic
actinomycete isolates. Biotechnology. 2: 131-
140.
• El-Nakeeb, M., Lechevalier, H. 1962. Selective Isolation of Aerobic Actinomycetes.
Applied Environmental Microbiology. 11: 75-
77.
• Ezziyyani, M., Pérez, C., Requena, M., Ahmed, A., Candela, M. 2004. Evaluación del
biocontrol de Phytophthora capsici en pimiento
(Capsicum annuum L.) por tratamiento con
Burkholderia cepacia. Anales de Biología. 26:
61-68.
• Ezziyyani, M., Pérez, C., Requena, M., Rubio, L., Candela, M. 2004. Biocontrol por
Streptomyces rochei –Ziyani-, de la
podredumbre del pimiento (Capsicum annuum
L.) causada por Phytophthora capsici. Anales
de Biología. 26: 69-78.
• Gadelhak, G, El-Tarabily, K., Al-Kaabi, K. 2005. Insect Control Using Chitinolytic Soil
Actinomycetes as Biocontrol Agents.
International Journal of Agriculture and
Biology.7: 627-633.
• Gómez, M., Rojas, L., Rojas, N., Cruz, R. 2004. Colloidal chitin stained with Remazol
134
Brilliant Blue RR, a useful substrate to select
chitinolytic microorganisms and to evaluate
chitinases. Journal of Microbiological Methods.
56: 213– 219.
• Gomes, R., Semedo, L., Soares, R., Linhares L., Ulhoa, C., Alviano, C., Coelho, R. 2001. Purification of a thermostable
endochitinase from Streptomyces RC1071
isolated from a cerrado soil and its antagonism
against phytopathogenic fungi. Journal of
Applied Microbiology. 90: 653-661.
• Gravel, V., Martinez, C., Antoun, H., Tweddell, R. 2005. Antagonist
microorganisms with the ability to control
Pythium damping-off of tomato seeds in
rockwool. BioControl. 50: 771-786.
• Hoster, F., Schmitz, J.E., Daniel, R. 2005.
Enrichment of chitinolytic microorganisms:
isolation and characterization of a chitinase
exhibiting antifungal activity against
phytopathogenic fungi from a novel
Streptomyces strain. Applied Microbial and
Cell Physiology. 66: 434-442.
• Istifadah N., Saleeba, J.A., McGee, P.A. 2006. Isolates of endophytic Chaetomium spp.
inhibit the fungal pathogen, Pyrenophora
triticirepentis, in vitro. Canadian Journal of
Botany. 84:1148-1155.
• Iznaga, Y., Lemus, M., González, L., Garmendía, L., Nadal, L., Vallín, C. 2003. Antifungal activity of actinomycetes from cuban
soils. Phytotherapy research. 18:494-496.
• Kamil, Z., Rizk, M., Saleh, M., Moustafa, S. 2007. Isolation and Identification of
Rhizosphere Soil Chitinolytic Bacteria and their
Potential in Antifungal Biocontrol. Global
Journal of Molecular Sciences. 2: 57-66.
• Leisner, J., Larsen, M., Jørgensen, R., Brøndsted, L., Thomsen, L., Ingmer, H. 2008. Chitin hydrolysis by Listeria spp.
including 1 L. monocytogenes. Applied
Environmental Microbiology. pp. 25.
• Leveau, J.Y., Bouix, M. 2000. Microbiología
industrial: los microorganismos de interés
industrial. Acribia. Zaragoza, España.
• Mukherjee, G., Sen, S. 2006. Purification,
Characterization and Antifungal Activity of
Chitinase from Streptomyces venezuelae P10.
Current Microbiology. 53: 265–269.
• Ogawa, K., Yoshida, N., Kariya, K., Ohnishi, C., Ikeda, R. 2002. Purification and
characterization of a novel chitinase from
Burkholderia cepacia strain KH2 isolated from
the bed log of Lentinus edodes, Shiitake
mushroom. The Journal of General and
Applied Microbiology. 48: 25-33.
• Patidar, P., Agrawal, D., Banerjee, T., Patil, S. 2005. Chitinase production by Beauveria
felina RD 101: optimization of parameters
under solid substrate fermentation conditions.
World Journal of Microbiology and
Biotechnology. 21: 93-95.
• Prapagdee, B., Kuekulvong, C., Mongkolsuk, S. 2008. Antifungal Potential of
Extracellular Metabolites Produced by
Streptomyces hygroscopicus against
Phytopathogenic Fungi. International Journal
of Biological Sciences. 4: 330-337.
• Rodríguez, M.X. 2001. Towards identifying
markers for post-harvest physiological
deterioration in cassava (Manihot esculenta
Crantz). Tesis de Doctorado.University of Bath,
Inglaterra.
• Salazar, R., Guevara, J, M., Béjar, V., Godoy, A. 1997. Bacteriemia por
Actinomyces. Anales de la Facultad de
Medicina. 58.
• Salazar, L., Patiño, L., Bustamante, E. 2006. Sustratos Foliares para el Incremento de
Bacterias Quitinolíticas y Glucanolíticas en la
Filosfera de Banano. Revista Facultad
Nacional de Agronomía. 59: 3449-3465.
• Sánchez, L., Corrales, L. 2005. Evaluación de
la congelación para conservación de especies
135
autóctonas bacterianas. Nova – Publicación
Científica. 3: 21:29
• Sastoque, L. 2006. Aislamiento y selección de
microorganismos productores de Quitinasas a
partir de residuos de concha de camarón con
potencial biocontrolador. Trabajo de Grado.
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá.
Director: Aura Marina Pedroza. Coodirector:
Balkys Quevedo. pp 134.
• Shanmugaiah, V., Mathivanan, N., Balasubramanian, N., Manoharan, P. 2008. Optimization of cultural conditions for
production of chitinase by Bacillus
laterosporous MML2270 isolated from rice
rhizosphere soil. African Journal of
Biotechnology. 7: 2562-2568.
• Sharaf, E. 2005. A potent Chitinolytic Activity
of Alternaria alternate Isolated from Egyptian
Black Sand. Polish. Journal of Microbiology.
54: 145-151.
• Skujins, J., Potgieter, H., Alexander, M. 1965. Dissolution of fungal cell walls by a
Streptomycete chitinase and β (1,3) glucacase.
Archives of Biochemistry and Biophysics. 111:
358-64.
• Swiontek, M., Porczyk, E., Donderski, W. 2007. Chitinolytic activity of bacteria and fungi
isolated from shrimp exoskeletons. Institute of
Oceanography. 36: 101-111.
• Taddei, A., Tremarias, M., Hartung, C. 1999. Viability studies on actinomycetes.
Mycopathologia. 143: 161-164.
• Taechowisan, T., Peberdy, J., Lumyong, S. 2003. Chitinase production by endophytic
Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and its
antagonism against phytopathogenic fungi.
Annals of Microbiology. 53: 447-461.
• Thangapandian, V., Ponmurugan, P., Ponmurugan, K. 2007. Actinomycetes
Diversity in the Rhizosphere Soils of Different
Medicinal Plants in Kolly Hills-Tamilnadu,
India, for secondary metabolite production.
Asian Journal of Plant Sciences. 6: 66-70.
• Tsay, T., Chen, P., Wu, W. 2006. A New
Method for Isolating and Selecting Agents with
High Antagonistic Ability Against Plant
Parasitic Nematodes. Plant Pathology Bulletin.
15: 9-16.
• Valois, D., Fayad, K., Barasubiye, T., Garon, M., Déry, C., Brzezinski, R., Singh, P.P., Shin, Y.C., Park, C.S., Chung, Y.R. 1996. Biological Control of Fusarium Wilt of
Cucumber by Chitinolytic Bacteria.
Phytopathology. 89: 92-99.
• Wang, S., Yen, Y., Tsiao, W., Chang, W., Wang, C. 2002. Production of antimicrobial
compounds by Monascus purpureus
CCRC31499 using shrimp and crab shell
powder as a carbon source. Enzyme and
Microbial Technology. 31: 337-344.
• Whipps, J. 1987. Effects of Media on Growth
and Interactions Between a Range of Soil-
Borne Glasshouse pathogens and Antagonistic
Fungi. New Phytologist. 107: 127-142.