Química de los AlimentosVolumen 119, Número 2 , 15 de marzo de 2010, Pages 851-858

Métodos analíticos

Extracción asistida por ultrasonido de polifenoles (glucósidos flavanona) de naranja ( Citrus sinensis L.) Peeling

Muhammad Kamran Khan  ,

Maryline Abert-Vian  ,

Anne-Sylvie Fabiano-Tixier  ,

Olivier Dangles  ,

Farid Chemat , 

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DOI: 10.1016/j.foodchem.2009.08.046

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Abstracto

En el presente estudio sobre la extracción de polifenoles especialmente flavanonas

de naranja ( Citrus sinensis L.) cáscara por el uso de etanol como disolvente de

calidad alimentaria. Después de un estudio preliminar muestran que se alcanzó el

mejor rendimiento de extracción para un tamaño de partícula de 2 cm 2 , se puso en

marcha una metodología de superficie de respuesta (RSM) para investigar la

influencia de las variables de proceso en la extracción asistida por ultrasonido

(Emiratos Árabes Unidos), seguido de un diseño central compuesto enfoque

(CCD). El análisis estadístico reveló que las condiciones optimizadas fueron una

temperatura de 40 ° C, una potencia de sonicación de 150 W y una mezcla 4:1 (v /

v) de etanol: proporción de agua. El contenido de fenoles totales alta (275,8 mg de

ácido gálico equivalent/100 g FW), las concentraciones de flavanona (70,3 mg de

naringina y 205,2 mg de hesperidin/100 g FW) y rendimiento de extracción (10,9%)

obtenidos a partir optimizado EAU ha demostrado su eficacia a la hora en

comparación con el método convencional. Además, la actividad antioxidante

determinado por las pruebas de DPPH y ORAC confirmó la idoneidad de EAU para la

preparación de extractos de plantas ricos en antioxidantes.

Palabra clave

Ultrasonido , Extracción , Antioxidante , Subproducto , cáscara de naranja

1. Introducción

Los estudios epidemiológicos han sugerido que los efectos beneficiosos de los

cítricos (ricos en flavanonas) contra muchas enfermedades degenerativas como las

enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer ( Benavente-García et al.,

1997  y  Trípoli et al., 2007 ). Estas influencias positivas en la salud humana se ha

incrementado de manera significativa el consumo de cítricos en los últimos años y

está aumentando de forma continua con una producción mundial estimada de los

cítricos hasta 72 millones de toneladas en el período de sesiones 2007-2008, entre

las cuales las principales frutas de color naranja de importancia comercial

representa unos 45 millones de toneladas ( USDA, 2008 ). El uso doméstico e

industrial de estas grandes cantidades de frutas cítricas, especialmente para la

producción de jugo, da como resultado la acumulación de grandes cantidades de

subproductos tales como residuos de cáscara, de semillas, de células y la

membrana que representan aproximadamente la mitad del peso de la fruta . Estos

subproductos se pueden utilizar para la producción de melaza, pectinas, aceites

esenciales, limoneno y la alimentación del ganado ( Bocco et al., 1998 , Jeong et al.,

2004 , Li et al., 2006a  y  Li et al., 2006b ).Además, cítricos subproductos son una

buena fuente de compuestos fenólicos, especialmente los glucósidos de flavanona

característicos que incluyen principalmente naringina, hesperidina, Narirutina, y

neohesperidina. En la actualidad, su extracción de las cáscaras de cítricos ha

atraído considerable interés científico para usarlos como antioxidantes naturales,

principalmente en los alimentos para prevenir la rancidez y la oxidación de los

lípidos ( Anagnostopoulou et al., 2006 , Peschel et al., 2006  y  Zia-ur-Rehman,

2006 ). De hecho, en los últimos años, una gran cantidad de investigación se ha

centrado en las plantas y sus subproductos para extraer los antioxidantes naturales

y de bajo costo que pueden reemplazar los aditivos sintéticos tales como

hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT), que podría ser el

hígado -dañar, carcinógeno ( Ak y Gülçin, 2008 ) y más generalmente tóxicos

( Moure et al., 2001 ).

Hasta ahora, varias técnicas de extracción convencionales han sido reportados para

la extracción de fenoles a partir de cáscaras de cítricos como la extracción con

disolvente ( Anagnostopoulou et al., 2006 ,Jeong et al., 2004 , Li et al.,

2006a , Manthey y Grohmann, 1996 , Xu et al., 2007  y  Zia-ur-Rehman, 2006 ), la

extracción de agua caliente ( Xu et al., 2008 ), la extracción alcalina ( Bocco et al.,

1998  y  Curto et al., 1992), basada en la extracción de resina ( Calvarano et al.,

1996  y  Kim et al., 2007 ), la enzima de extracción asistida ( Li et al., 2006b ), haz

de electrones y basados γ-irradiación de extracciones ( Kim et al., 2008  y Oufedjikh

y col ., 2000 ) y la extracción de fluido supercrítico ( Giannuzzo, Boggetti, Nazareno,

y Mishima, 2003 ). Estas técnicas de extracción convencionales o más innovadoras

pueden ya sea causar la degradación de los compuestos específicos debido a las

altas temperaturas y largos tiempos de extracción como en la extracción de

solventes, o plantear algunos riesgos relacionados con la salud, debido a la falta de

conciencia de los criterios de seguridad durante la irradiación. Además, la

extracción de la enzima asistida es limitado debido a problemas de

desnaturalización de la enzima. Con el desarrollo del concepto de "Química Verde"

durante los últimos años, las técnicas respetuosas del medio ambiente se están

volviendo más y más atractivo. La extracción de compuestos bioactivos con

irradiación de ultrasonido (20-100 kHz) es una de las técnicas de extracción

próximas que puedan ofrecer una alta reproducibilidad en tiempos más cortos,

manipulación simplificada, reducción de consumo de disolvente y la temperatura y

menor consumo de energía ( Chemat, Tomao, y Virot, 2008 ).

Durante la sonicación, el proceso de cavitación provoca la inflamación de las células

o la ruptura de las paredes celulares, lo que permite altas tasas de difusión a través

de la pared celular en el primer caso o una simple eliminación por lavado de los

contenidos de las celdas en la segunda ( Vînătoru, 2001 ). Además del disolvente,

temperatura y presión, mejor recuperación de contenido de la celda se pueden

obtener mediante la optimización de factores de aplicación de ultrasonido,

incluyendo frecuencia, potencia y tiempo de sonicación, así como la distribución de

ondas ultrasónicas ( Wang y Weller, 2006 ). Optimización de la extracción asistida

por ultrasonido (EAU) se ha descrito recientemente para extraer hesperidina de

Penggan ( Citrus reticulata ) peel ( Ma, Chen, Liu, y Ye, 2008 a), ácidos fenólicos y

glucósidos flavanona de Satsuma mandarina ( Citrus unshiu Marc) cáscara ( Ma et

al., 2009  y  Ma et al., 2008b ) y el contenido total de fenólicos de Penggan cáscara

( Ma, Chen, Liu, y Ye, 2008a ) (véase el cuadro 1 ). En estas obras, metanol surgió

como una extracción de disolvente adecuado para alcanzar buenos rendimientos de

los compuestos fenólicos mencionados anteriormente. Sin embargo, la calidad

alimentaria disolventes orgánicos ambientalmente benignas y no tóxicos, como el

etanol, n -butanol e isopropanol son recomendados por la Food and Drug

Administration de EE.UU. para fines de extracción ( Bartnick, Mohler, y Houlihan,

2006 ).

Tabla 1.

Publicaciones recientes sobre la extracción de polifenoles bajo irradiación de ultrasonido.

El material vegetal Los analitos Comentarios Referencias

Satsuma mandarinaCitrus unshiuMarc

Los ácidos fenólicos (PA)

Tiempo UAE = 10-40 min; Maceración durante 8 horas para obtener rendimientos similares de PA

Ma et al. (2009)

Du Zhong Vosotros Folium eucommiae

Los flavonoides Emiratos Árabes Unidos se encontró más eficiente que la calefacción, microondas-y extracciones con enzimas asistida

Huang, Xue, Niu, Jia y Wang (2009)

El salvado de trigo Triticum aestivum

Heteroxilanos Fenoles-ricos

Tiempo de extracción redujo de 60 min (extracción convencional) a 5 min (Emiratos Árabes Unidos)

Hromádková, Košt'álová y Ebringerová (2008)

Penggan C.reticulata Hesperidina Rendimientos comparables con EAU, pero menos degradación de hesperidina en comparación con la extracción de Soxhlet

Ma et al. (2008c)

Satsuma mandarina C.unshiu Marc

Los ácidos fenólicos y glucósidos flavanona

Aumento en el contenido de polifenoles y la actividad antioxidante de los extractos obtenidos por EAU en

Ma et al. (2008b)

El material vegetal Los analitos Comentarios Referencias

comparación con maceración

Penggan C.reticulata Contenido de fenoles totales (TPC)

TPC aumentó en el aumento de tiempo de irradiación y la temperatura

Ma et al. (2008a)

Winged zarza ardienteEuonymus alatus

Los flavonoles rutina y quercetina

Eficiencia EAU monitoreado por microscopía

Yang y Zhang (2008)

Opciones de la tabla

Una búsqueda en la literatura no dió ninguna referencia acerca de los informes

anteriores sobre los Emiratos Árabes Unidos de los compuestos fenólicos de las

cáscaras de naranja por el uso de disolventes de grado alimentario. El objetivo de

este trabajo es dar una idea de la potencialidad de los Emiratos Árabes Unidos en la

preparación rápida de los extractos ricos en polifenoles (glucósidos especialmente

flavanona) de cáscaras de naranja con buenos rendimientos. Varios parámetros que

podrían afectar a la eficacia de la extracción fueron evaluados y optimizados

utilizando un enfoque estadístico del diseño experimental. Por último, los resultados

de los EAU optimizados obtenidos se compararon con los obtenidos mediante el uso

de un método de extracción convencional.

2. Materiales y métodos

2.1. El material vegetal

Cerca de 10 kg de naranja ( Citrus sinensis L. Osbeck de Valencia late cultivar,

España) cáscaras después de la extracción de jugo se recogieron de forma local

desde una industria de jugos cítricos (Vaucluse, Francia). Se almacenaron en un

congelador a -20 ° C.

2.2. Productos Químicos

Los disolventes utilizados fueron de grado analítico y suministrados por VWR

International (Darmstadt, Alemania). Flavanona glucósidos (naringina, hesperidina)

fueron adquiridos de Extrasynthese (Genay, Francia), ácido cafeico de Sigma-

Aldrich (Steinhaus, Alemania), y Trolox de Acros Organics (Slangerup,

Dinamarca). DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), AAPH (2,2 '-azobis (2-metil)

dihidrocloruro propionamidina) y fluoresceína se obtuvieron de Alfa Aesar

(Karlsruhe, Alemania), Sigma-Aldrich (Steinhaus, Alemania) y Acros Organics (Morris

Plains, Estados Unidos), respectivamente.

2.3. Instrumentación

2.3.1. Aparato de sonicación

Extracción asistida por ultrasonido (EAU) se realizó con un PEX 3 Sonifier (REUS,

Contes, Francia), compuesto por una jarra de inox con 23 × 13,7 cm Dimensiones

internas con una capacidad máxima de 3 L, y un transductor, en la base de la jarra ,

que funciona a una frecuencia de 25 kHz con una potencia máxima de entrada de

150 W. El manto de doble capa nos permitió controlar la temperatura del medio de

refrigeración por sistemas de calefacción /. La potencia de salida del generador es

de 150 W, mientras que la potencia disipada en el medio es aproximadamente de

60 W, como se mide por calorimetría. El diagrama detallado del aparato se muestra

en la fig. 1 .

La figura. 1. 

Aparato de ultrasonidos utilizado por los Emiratos Árabes Unidos.

Opciones Figura

2.3.2. El análisis por HPLC

Análisis de HPLC se realizaron utilizando un sistema de HPLC Waters (Milford, MA)

que consta de una bomba Waters 600E, un inyector automático Waters 717, un

detector de matriz de fotodiodos Waters 2996.El sistema de bombas de HPLC,

muestreador automático, temperatura de la columna y de red de diodos se

supervisa y controla mediante el uso de programas de software Waters Empower 2

Cromatografía de datos.La longitud de onda utilizada para la cuantificación de las

flavanonas glucósidos con el detector de diodo era 280 nm. La separación

cromatográfica se llevó a cabo en una columna de taponado terminalmente

Purospher estrella RP-18 (250 x 4 mm DI; 5 m de tamaño de partícula de VWR), con

una columna de guardia de RP-18 (4 × 4 mm DI; tamaño de partícula 5 m También

de VWR). La columna de la columna y el protector protegido terminalmente se

llevaron a cabo a 37 ° C y el caudal se fijó en 1 ml / min. La fase móvil consistió de

dos disolventes: ácido acético 0,5% (A) y 100% de acetonitrilo (B). El gradiente de

disolvente en relaciones de volumen fue la siguiente: 10-30% de B durante 20

min. El gradiente de disolvente se aumentó a 35% de B en 25 min y se mantuvo a

35% de B durante 5 min. El volumen de inyección fue de 20 l. Los análisis se

realizaron al menos tres veces y sólo se informaron los valores medios. La

cuantificación se llevó a cabo utilizando el método estándar externo y las

concentraciones finales se calcularon en mg/100 g de peso fresco.

2.3.3. Espectrofotómetros

Las medidas de absorbancia se realizaron en un Spectronic GENESYS 5 UV-Visible

espectrofotómetro (longitud de onda: 200-1100 nm) equipado con un soporte

multicelular de ocho posiciones. Las mediciones de la intensidad de la fluorescencia

se llevaron a cabo en un SPEX-Fluoromax 2 espectrofluorímetro de Jobin Yvon.

2.4. Procedimiento de extracción

Un estudio comparativo ha sido realizado entre las técnicas convencionales y

asistida por ultrasonido después de la optimización de este último. EAU : en

experimentos dirigidos a optimizar la temperatura de extracción, potencia de

ultrasonidos, y el porcentaje de etanol, cáscaras de naranja (0,25 g / ml) se

sometieron a ultrasonidos en el disolvente (mezcla de etanol-agua) durante 30

min. Los parámetros óptimos se utilizaron además para investigar el tiempo de

extracción requerida para el rendimiento máximo.extracción con disolventes ( SE ):

a la extracción de control se llevó a cabo mediante el uso de la temperatura y el

porcentaje de etanol que se encontraron óptimo para los Emiratos Árabes Unidos.

2.5. Estudio Tamaño de partícula

Una serie de cinco experimentos con cinco tamaños de partícula diferentes (0,5,

1,0, 1,5, 2,0 y 2,5 cm 2 ) se llevó a cabo mediante el procedimiento de extracción

con disolvente convencional con las condiciones de punto central (25 ° C, solución

de etanol-agua 1:1, agitación, 30 min). Pelar partículas que tienen un espesor de

aproximadamente 0,5 cm se cortaron al azar con ayuda de cubos de acero

calibradas.

2.6. Contenido de fenoles totales (TPC)

El TPC de las muestras se midió con un kit (SEPPAL (Isitec-Lab), Francia)

especialmente adecuado para la medición de TPC de alimentos y bebidas. Este kit

incluye el reactivo A (reactivo de Folin-Ciocalteu modificado), el reactivo B (tampón

alcalino) y una solución de ácido gálico (3 g / l). Un pequeño volumen (20 l) de H 2 O

la solución (en blanco), ácido gálico (estándar) o el extracto (muestra) se mezcló

con el reactivo A (2 ml). Después de 1 min, se añadió 1 ml de reactivo B para cada

muestra. Las mezclas se dejaron reposar durante 30 min en la oscuridad a

temperatura ambiente. Entonces, su absorbancia se midió a 760 nm. TPC se

calcularon utilizando las fórmulas siguientes: TPC = 3 × (muestra de absorbancia -

absorbancia del blanco) / (absorbancia estándar - absorbancia del

blanco). Mediciones del TPC se realizaron tres veces y los valores medios,

expresados como mg gálico acid/100 g de peso fresco (mg GA/100 g FW), fueron

reportados.

2.7. Rendimiento determinación

Se eliminó el etanol a partir de los extractos por evaporación bajo vacío a 40 ° C en

un evaporador rotatorio.Entonces, las muestras se congelaron y se liofilizaron para

eliminar el agua. Finalmente, el rendimiento de cada extracto se calcula a partir de

su peso y se expresa en porcentaje.

2.8. Diseño del experimento

Diseño de Box-Wilson, también llamado diseño central compuesto (CCD), se usa

para conseguir el máximo de información sobre el proceso a partir de un número

mínimo de posibles experimentos. El tipo de CCD utilizado en este estudio fue de

diseño central centrada en las caras (CCF) compuesto experimental para

determinar las condiciones óptimas de los Emiratos Árabes Unidos. La aplicación de

un diseño CCF es una manera conveniente para optimizar un proceso con tres

niveles (-1, 0 y 1) para cada factor. En este diseño, los puntos de estrella están en

el centro de cada cara del espacio factorial, por lo tanto ± alpha  = ± 1. Se necesita

este diseño para evaluar los efectos e interacciones de tres variables

independientes, es decir, la temperatura (° C) ( X 1), potencia (W) ( X 2) y etanol:

proporción de agua (% v / v) ( X 3). Los niveles codificados y los valores naturales

de los factores usados en este diseño experimental se muestran en la Tabla 2 en

paralelo. Un total de 20 combinaciones diferentes, incluyendo seis repeticiones del

punto central, cada uno designado por el valor codificado 0, fueron elegidos de

forma aleatoria de acuerdo con una configuración de CCF por tres factores. Los

parámetros de optimización seleccionados fueron TPC después de 30 minutos (mg

gálico acid/100 g de peso fresco) ( Y 1), la concentración de naringina (mg/100 g PF)

( Y2), la concentración de hesperidina (mg/100 g PF) ( Y 3 ), el rendimiento de los

extractos (%) ( Y 4) y constante de velocidad de extracción (min -1 ) ( Y 5).

Tabla 2.

Diseño central compuesto de tres variables con sus respuestas observadas.

Exp.No.

Variables codificadas

Variables de Decoded

Respuestas

X1

X2

X3

T⁎ P ⁎ E⁎ TPC 30 min (mg GA/100 g)

Naringina (mg/100 g)

Hesperidina (mg/100 g)

Rendimiento (%)

Constante de la tasa de extracción (min -1)

1 0 0 0 25

100

50

185.493

36.193 119.290 7.8 0.0260

2 1 1 1 40

150

80

233.460

48.610 146.729 10.03 0.0402

3 0 0 0 25

100

50

185.068

32.721 112.853 7.77 0.0197

4 1 -1 1 40

50 80

197.646

33.347 113.332 8.09 0.0170

5 -1 -1 -1 10

50 20

121.259

17.831 71.692 6.27 0.0126

6 0 -1 0 25

50 50

162.480

28.247 93.183 6.97 0.0150

7 0 0 0 25

100

50

183.531

35.694 118.834 7.81 0.0215

8 0 0 0 25

100

50

185.994

33.295 113.186 7.76 0.0210

9 -1 1 1 10

150

80

187.276

34.007 117.123 7.93 0.0253

10 1 -1 -1 4 50 2 140.35 21.640 86.740 6.81 0.0152

Exp.No.

Variables codificadas

Variables de Decoded

Respuestas

X1

X2

X3

T⁎ P ⁎ E⁎ TPC 30 min (mg GA/100 g)

Naringina (mg/100 g)

Hesperidina (mg/100 g)

Rendimiento (%)

Constante de la tasa de extracción (min -1)

0 0 2

11 0 0 -1 25

100

20

174.472

30.860 99.236 7.14 0.0153

12 0 0 1 25

100

80

192.352

32.260 110.866 7.96 0.0189

13 0 0 0 25

100

50

184.666

32.051 112.310 7.78 0.0208

14 -1 1 -1 10

150

20

169.918

29.345 96.847 7.09 0.0292

15 -1 0 0 10

100

20

159.217

29.531 98.749 6.89 0.0164

16 1 1 -1 40

150

20

225.302

36.469 124.489 9.59 0.0353

17 1 0 0 40

100

50

190.878

31.257 106.286 8.15 0.0186

18 -1 -1 1 10

50 80

155.258

24.561 87.903 6.86 0.0125

19 0 0 0 25

100

50

186.496

34.051 118.650 7.75 0.0211

20 0 1 0 25

150

50

213.188

35.146 119.252 8.93 0.0326

⁎

T  =  X 1 = temperatura (° C); P  =  X 2 = potencia (W); E  =  X 3 = etanol: proporción de agua (% v / v).

Opciones de la tabla

Los diseños experimentales usados fueron construidas y se procesaron los

resultados experimentales utilizando el software Statgraphics Plus (versión 5.1,

Estadísticos Gráficos Corporation, Rockville, EE.UU., 2000). A continuación, se

realizó un análisis de varianza (ANOVA) con el nivel de confianza del 95% para cada

variable de respuesta con el fin de probar la importancia de modelo y de

idoneidad. El F -valor en ANOVA es la relación de error cuadrático medio para el

error puro obtenido a partir de las repeticiones en el centro de diseño y la P -valor

define la importancia de las diferentes variables. Una descripción de los efectos

significativos obtenidos de ANOVA para TPC (30 min) fue presentado por un gráfico

de Pareto Estandarizado.

2.9. Los estudios cinéticos

2.9.1. Constante de la tasa de extracción ( k )Durante cada proceso de extracción, la absorción de 1 ml de la mezcla se realizó a

5, 10, 20 y 30 min para determinar los valores de TPC

correspondientes. Suponiendo una acumulación de primer orden de fenoles totales

en solución ( . Fig. 4 ), se puede escribir:

T P C   t   = T P C   ∞   ( 1 - e   -   k t   )Gire MathJaxen 

TPC t : valor TPC en el momento t , TPC ∞ : valor TPC final (determinado en t  = 8

h), k : constante aparente de velocidad de primer orden de extracción. Por lo tanto,

a partir de los gráficos lineales de Ln-(1 - (TPC t / TPC ∞ )) contra el tiempo

(coeficiente de correlación en el intervalo de 0,90-0,99), los k valores podrían ser

determinados.

2.9.2. La energía de activación ( E  a )A partir de la ecuación de Arrhenius, las energías de activación para la extracción

de fenoles totales en los Emiratos Árabes Unidos y SE se determinaron a partir de

gráficas de Ln  k frente a 1 / T , donde T es la temperatura absoluta (283, 298 y 313

K).

2.10. Pruebas de antioxidantes

Como no existe un método estandarizado para evaluar el potencial antioxidante de

los alimentos y los sistemas biológicos, se recomienda para evaluar la actividad

antioxidante mediante diversos métodos (Frankel & Meyer, 2000 ).

2.10.1. Ensayo de DPPH

DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) es un establo muy coloreado de los radicales libres

que pueden abstractas lábiles átomos de hidrógeno de los antioxidantes fenólicos

con la formación concomitante de una hidrazina incoloro (DPPH-H) ( Diouf,

Stevanovic, y Cloutier, 2009 ) . La actividad de eliminación de radicales libres

(FRSA) de un extracto puede ser expresado como el porcentaje de DPPH reducida

por una cantidad dada de extracto. El FRSA de los extractos se evaluó de acuerdo

con el método descrito por Mimica-Dukic, Bozin, Sokovic, y Simin (2004) , con

algunas modificaciones. El extracto se disolvió en 50% (v / v) de metanol acuoso

con una concentración final de 5 g / L. Un pequeño volumen (0,1 ml) de la solución

de extracto se mezcló con 2,0 ml de una solución 0,1 mM de DPPH en MeOH y la

mezcla se dejó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 60 min. La

absorbancia se midió a 517 nm. El FRSA total de cada extracto se expresó como el

porcentaje de DPPH reducida y se calculó mediante la siguiente ecuación: FRSA =

100 × (absorbancia inicial - absorbancia final) / absorbancia inicial. La absorbancia

inicial y la absorbancia final son los valores de absorbancia de DPPH a tiempo cero y

después de 60 min, respectivamente.

2.10.2. ORAC (capacidad de absorción de radicales de oxígeno) de ensayo

En este método, los radicales peroxilo (ROO hidrófilos ) Generado por la

descomposición térmica de la AAPH compuesto diazo oxidar la sonda fluorescente

FL, causando así una extinción de la fluorescencia.Por lo tanto, la inhibición de este

enfriamiento rápido por un antioxidante es una medida de su capacidad para

reducir ROO ( Gomes, Fernandes, y Lima, 2005 ). El método ORAC empleada es una

adaptación de un método descrito previamente por Ou, Hampsch-Woodill, y Prior

(2001) . Todos los reactivos se prepararon en un tampón fosfato 75 mM a pH

7,4. Trolox (0-75 mM) se utilizó como el estándar. Una mezcla de la sonda

fluorescente de fluoresceína (FL, 2 ml de una solución 26 nM en tampón de fosfato)

y extraer (15 l de una solución de 5 g / L en MeOH) se pre-incubaron durante 10 min

a 37 ° C. A continuación, se añadió 1 ml de una solución 664 mM AAPH en el

tampón fosfato. La intensidad de fluorescencia se midió cada 2 min durante 40 min

con longitudes de onda de excitación y emisión fijados en 490 y 511 nm,

respectivamente. Su decadencia se refiere a FL oxidación por los radicales peroxilo

derivados AAPH. El valor ORAC se calcula a partir del área bajo la curva que expresa

la extinción de fluorescencia de FL en presencia del extracto en comparación con

las curvas construidas con concentraciones conocidas de Trolox. Las mediciones se

realizaron por triplicado. El área bajo la curva (AUC) se calculó como AUC = 1

+  f  2 / f  0  +  f  4 / f  0  ... +  f  i / f  0donde f  i es la lectura de fluorescencia en el

tiempo i (en s). El AUC neto se obtuvo restando el AUC de la pieza en bruto (sin

antioxidante). Los resultados se expresaron como milimoles de equivalentes Trolox

(TE) por gramo de muestra sobre una base de peso fresco (TE/100 mmol g

FW). Ambas pruebas antioxidantes (DPPH y ORAC) se realizaron al menos tres

veces para cada extracto y sólo se registraron valores medios.

3. Resultados y discusión

3.1. Influencia del tamaño de partícula

A partir de estudios anteriores ( Cuoco et al., 2009 , García-Ayuso y Luque de

Castro, 1999 , Vilkhu et al., 2008  y  Wang y Weller, 2006 ), el tamaño de partícula

se considera uno de los factores importantes que pueden afectar a la eficiencia de

extracción de polifenoles de las cáscaras de naranja. Por lo tanto, los experimentos

preliminares sobre cáscaras de naranja de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 cm 2 dieron

rendimientos finales de 3,44%, 3,65%, 4,32%, 4,41% y 4,38%, respectivamente. Un

tamaño de 2 cm 2 fue seleccionado como un óptimo para nuestros experimentos de

extracción. El rendimiento ligeramente inferior observado con partículas de tamaño

más pequeño podría ser debido a las partículas que permanecen en la superficie del

disolvente durante la extracción, lo que limita su exposición a las ondas

ultrasónicas.

3.2. Compuestas central resultados de diseño

Los valores codificados y descodificados de las variables independientes y las

respuestas obtenidas en el estudio multivariante para cada experimento se

muestran en la Tabla 2 . En esta segunda parte del estudio, el efecto de la

temperatura (° C) X 1, de energía ultrasónica (W) X 2 y etanol: proporción de agua

(% v / v) X 3 en la UAE de polifenoles cáscara de naranja en términos de TPC (mg

GA/100 g FW) Y 1, la concentración de naringina (mg/100 g PF) Y 2 y la

concentración de hesperidina ( mg/100 g PF) Y 3 se evaluó mediante la metodología

de superficie de respuesta. Identificación de naringina y hesperidina se logró

mediante la comparación de sus tiempos de retención y los espectros UV con las

normas ( . Fig. 2 ). El rendimiento (%)Y 4 y la constante de velocidad de extracción

( k ) (min -1 ) Y 5 también se determinaron. ANOVA para la determinación de TPC (30

min) dio un coeficiente de determinación ( R  2 ) de 98,3%, lo que indica una

estrecha concordancia entre los valores experimentales y predictivos. Datos del

ANOVA de TPC también se muestran en un gráfico de Pareto ( . Fig. 3 ), que

representa los efectos significativos de todas las variables (lineales y cuadráticas) y

sus interacciones. La longitud de las barras es proporcional a la magnitud absoluta

de los coeficientes de los efectos estimados mientras que la línea discontinua

representa la magnitud mínima de efectos estadísticamente significativos (95% de

intervalo de confianza) con respecto a la respuesta. Se puede observar que el poder

de ultrasonido tiene la influencia más importante en el TPC seguido por la

temperatura, etanol: proporción de agua, la interacción de la energía y etanol:

proporción de agua, ajustado plazo de la temperatura y la interacción de la energía

y la temperatura. La falta de significación de los términos de productos cruzados

sugiere la ausencia de interacciones entre las variables en el rango estudiado.

La figura. 2. 

El análisis por HPLC de un extracto obtenido por extracción asistida por ultrasonido de las

cáscaras de naranja.

Opciones Figura

La figura. 3. 

Diagrama de Pareto para el contenido de fenoles totales (mg GA/100 g) a 30 min.

Opciones Figura

Los datos experimentales construidas después de correr 20 ensayos nos permitió

encajar todas las respuestas en función de la temperatura, la potencia y el etanol:

la relación de agua. Los de segundo orden ecuaciones polinómicas de las

superficies de respuesta obtenidos son los siguientes:

ecuación( 1 )

Gire MathJaxen 

ecuación( 2 )

Gire MathJaxen 

ecuación( 3 )

Gire MathJaxen 

ecuación( 4 )

Gire MathJaxen 

ecuación( 5 )

Gire MathJaxen 

donde T es la temperatura (° C), P la potencia de ultrasonidos (W) y E el etanol:

proporción de agua (% v / v).

3.3. Las condiciones óptimas

Optimización de superficie de respuesta se puede encontrar en función de las tres

variables clave, a saber, la temperatura, la energía y etanol: proporción de

agua. Las condiciones óptimas obtenidos a partir de las primeras derivadas de la

ecuación polinómica de segundo orden se derivaron un segundo tiempo. Los

derivados se igualaron a continuación, a 0 y resueltos en un sistema de

ecuaciones. Los valores codificados obtenidos a partir de estas ecuaciones fueron

por lo tanto decodificados y redondeadas con el fin de ser aplicado al

dispositivo. Los valores naturales obtenidos correspondientes a las condiciones

óptimas para cada respuesta fueron como sigue: Y 1 = 40 ° C, 150 W, 80%; Y 2 =

40 ° C, 150 W, 80%; Y 3 = 40 ° C, 150 W , 80%; Y 4 = 40 ° C, 16 W, 80%; Y 5 = 39 °

C, 50 W, 69%. Como se esperaba y de acuerdo con las superficies de respuesta, la

eficacia de la extracción en términos de TPC, las concentraciones naringin y

hesperidina aumenta mediante el aumento de todos los tres factores. En todas

estas respuestas, los valores óptimos fueron más allá de los límites que hemos

seleccionado. Por lo tanto, los valores finalmente seleccionados corresponden a los

valores máximos seleccionados para definir el dominio experimental (Lucchesi,

Smadja, Bradshaw, Louw, y Chemat, 2007 ). Sobre la base de nuestros principales

respuestas ( Y1, Y 2, Y 3), la temperatura de 40 ° C, la potencia de ultrasonido de

150 W y etanol: proporción de agua (v / v) de 80% fueron elegidos como valores

óptimos para ir con nuestros experimentos. Un estudio de repetibilidad se llevó a

cabo mediante el uso de estas condiciones óptimas para evaluar la capacidad de

predicción de los modelos y se encontró que los resultados de acuerdo con los

obtenidos en el segundo juicio {1 (40 ° C), 1 (150 W), 1 (80% de etanol)} de diseño

experimental. Varias investigaciones recientes sobre la extracción de contenidos

fenólicos de piel de cítricos también han sugerido condiciones de funcionamiento

similares a las recomendadas en este estudio ( Li et al., 2006a , Ma et al.,

2008c  y  Ma et al., 2009 ).

3.4. Comparación de los Emiratos Árabes Unidos vs SE

TPC extrae de las cáscaras de naranja por los Emiratos Árabes Unidos (40 ° C, 150

W, 80% de etanol, agitación) y SE (idem excepto sonicación) que se muestra en la

figura. 4 . El TPC obtenido por EAU durante 15 min fue significativamente mayor

que por SE durante 60 min. Debido a los efectos mecánicos sobre las paredes

celulares evidenciadas por microscopía electrónica de barrido ( Balachandran et al.,

2006  y  Li et al., 2004 ), EAU permite rendimientos de extracción más altos en

períodos de tiempo más cortos, reduciendo de este modo la entrada de energía.

La figura. 4. 

Comparación de los contenidos de fenoles totales (mg GA/100 g) de la extracción asistida

por ultrasonido (UAE)   y extracción con disolventes (SE)  .

Opciones Figura

Los principales glucósidos flavanona encuentran en naranja ( C. sinensis ) son

naringina y hesperidina, siendo estos últimos más abundantes que las primeras

( Wang, Chuang, y Hsu, 2008 ). Ambos se titularon simultáneamente por HPLC de

las muestras obtenidas por los Emiratos Árabes Unidos y SE después de 60 min. Las

cantidades de naringina y hesperidina desde Emiratos Árabes Unidos (70,3 y 205,2

mg/100 g de peso en fresco, respectivamente) fueron considerablemente más altos

que los obtenidos de SE (50.9 y 144.7 mg/100 g PF, respectivamente). No hay

evidencia de la degradación flavanona bajo tratamiento con ultrasonidos se pudo

encontrar. De hecho, la degradación de ultrasonidos de fenoles es típicamente lento

en comparación con compuestos aromáticos más volátiles que se difunden más

fácilmente en la burbuja de cavitación para la pirólisis ( Chowdhury y Viraraghavan,

2009 ). Además, la degradación del fenol se ve favorecida a frecuencias más altas

(requerido para la generación de radicales hidroxilo por homólisis agua) que la

seleccionada en este trabajo (20 kHz). El rendimiento de extracción es un factor

importante para evaluar la respuesta de un proceso de extracción. Se estima que el

10,9% y el 8,6% para los Emiratos Árabes Unidos y SE, respectivamente. Esto es

consistente con EAU que tiene un potencial para extraer productos naturales en

mejores rendimientos que las técnicas convencionales, no sólo en la escala de

laboratorio, sino también en la escala de planta piloto ( Boonkird, Phisalaphong, y

Phisalaphong, 2008 ).

La extracción de fenoles totales se encontró CA . 3 veces más rápido bajo

ultrasonidos ( k  = 0,10 (± 0,01) min -1 ) como en el procedimiento convencional

( k  = 0,03 (± 0,01) min -1 ). En consonancia, la energía de activación (6,34 kJ / mol

para los Emiratos Árabes Unidos vs 34,21 kJ / mol para SE) es menor. Efectos

cinéticos similares fueron evidenciados por Chemat, Lagha, AITAMAR, Bartels y

Chemat (2004) de los Emiratos Árabes Unidos de semillas de alcaravea en hexano.

3.5. Capacidades antioxidantes

Emiratos Árabes Unidos y SE fueron finalmente evaluados comparando el potencial

antioxidante de los extractos correspondientes. Antioxidantes fenólicos son

normalmente capaces de reducir rápidamente las especies reactivas del oxígeno

(ROS) que incluyen los radicales libres, protegiendo así biomoléculas ( por ej.,

ácidos grasos poliinsaturados) contra la oxidación ( Dangles, 2006 ). El valor FRSA

fue del 54% y del 42% para los extractos obtenidos por los Emiratos Árabes Unidos

y SE, respectivamente. El aumento en FRSA observó con Emiratos Árabes Unidos,

aunque modesto, está de acuerdo con la concentración de fenoles totales superior

estimada por los Emiratos Árabes Unidos y confirma la correlación habitual entre la

actividad antioxidante y TPC ( Anagnostopoulou et al., 2006  y  Ma et al.,

2008b ). Se calcularon los valores ORAC ser 712 mmol TE/100 g FW y 509 mmol

TE/100 g FW para los Emiratos Árabes Unidos y SE extractos, respectivamente.

Mientras que los Emiratos Árabes Unidos durante 60 min resultados en un aumento

del 35-40% en el TPC vs SE, el FRSA estimado por el ensayo DPPH se incrementa en

menos del 30% y el valor ORAC en un 40%.Por lo tanto, el ensayo ORAC aparece

más consistente con el aumento en el TPC que el ensayo de radical de DPPH. De

hecho, el principal flavanonas naranja naringenina y hesperetina son antioxidantes

relativamente débiles, ya que no muestran un grupo catecol (1,2-dihidroxibenceno),

que es el determinante estructural crítica de fuertes antioxidantes fenólicos

( Goupy, Loonis, Dufour, y Dangles, 2003 ). Como consecuencia, se espera que

reaccionan muy lentamente con el establo radical DPPH. Por lo tanto, es mucho más

reactiva radicales, tales como los radicales peroxilo entregados en la prueba ORAC,

están obligados a expresar plenamente el electrón / actividad H-donación de

flavanonas naranja ( TABART, Kevers, Pincemail, Defraigne, y Amas,

2009 ). También hay que señalar que los antioxidantes no fenólico, tales como

ascorbato (que es sensible a la prueba para la determinación de TPC) pueden ser

parcialmente responsable de la actividad antioxidante de los extractos general,

especialmente en el ensayo de DPPH donde se espera que las flavanonas para

hacer un menor contribución.

4. Conclusión

Los Emiratos Árabes Unidos de antioxidantes fenólicos de las cáscaras de naranja

con mezclas de etanol-agua parecía muy eficaz en comparación con el

procedimiento convencional. Los resultados de CCD señalaron la potencia de

ultrasonidos como el factor más influyente en el proceso de los Emiratos Árabes

Unidos, seguido por la temperatura y etanol: proporción de agua. Aunque se

utilizaron los mismos volúmenes de disolvente en ambos procesos de extracción, la

duración del proceso asistida por ultrasonido y en consecuencia la entrada de

energía se redujeron drásticamente sin afectar el rendimiento global. Por lo tanto,

los Emiratos Árabes Unidos puede ser llamado una o técnica 'ecológico', 'verde'. En

general, la extracción asistida por ultrasonido de los polifenoles de la comida

abundante subproductos tales como cáscaras de naranja y mediante el uso de

disolventes de grado alimentario tiene un fuerte potencial de desarrollo industrial

como un proceso eficiente y favorable al medio ambiente para la preparación de

extractos ricos en antioxidantes naturales dirigido a la sustitución de los

antioxidantes sintéticos.