FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE INGENIERÍA DE BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N° 2

ALUMNO:

Tatiana Valencia

CÓDIGO:

2411

NIVEL:

Quinto

PARALELO:

A

TEMA:

Reacciones de identificación de carbohidratos

PERIODO ACADÉMICO:

Octubre 2015 – Febrero 2016.

PRACTICA 2

1. TEMA: Reacciones de identificación de carbohidratos

2. OBJETIVOS

Objetivo general

Caracterizar cualitativamente los carbohidratos empleando diferentes reacciones.

Objetivos específicos

Identificar carbohidratos a través de la reacción general Verificar la presencia de azucares reductores Establecer diferencias de sacáridos y disacáridos a través de reacciones

redox. Caracterizar cualitativamente a los polisacáridos.

3. MARCO TEORICO

Reacciones de coloración

a. Reacción de MolischLa prueba de Molisch permite detectar la presencia de hidratos de carbono en una muestra; está basada en la formación de furfural o derivados de éste (originado por los ácidos concentrados que provocan una deshidratación de los azúcares) a partir de los carbohidratos para obtener el furfural que se combina con el -naftol sulfonato originando un complejo púrpura. Es una reacción muy sensible puesto que soluciones de glucosa al 0.001% y sacarosa al 0.0001% dan positiva la prueba. También sirve para el reconocimiento general de carbohidratos donde polisacáridos y disacáridos se hidrolizan formando monosacáridos formando un color púrpura violeta.

Todos los glúcidos por acción del ácido sulfúrico concentrado se deshidratan formando compuestos furfúricos (las pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural). Estos furfurales se condensan con el reactivo de Molisch (solución alcohólica de alfa-naftol), dando un producto violeta.

b. Reacción de SeliwanoffEsta prueba es específica para las cetosas. Las cetosas se deshidratan más rápidamente que las aldosas, dando furfurales. Estos se condensan con el resorcinol produciendo un complejo coloreado. Si el tiempo de ebullición se prolonga, puede dar también positivo para otros azúcares.

La prueba de Seliwanoff es una prueba química que se usa para distinguir entre aldosas y cetosas. Los azúcares son distinguidos a través de su función como cetona o aldehído. Si el azúcar contiene un grupo cetona, es una cetosa, y si contienen un grupo aldehído, es una aldosa. Esta prueba está basada en el hecho de que, al calentar las cetosas son deshidratadas más rápido que las aldosas. (carbohidratos, s.f.)

Reacciones de óxido-reducción

a. Prueba para azucares reductorasLas pruebas colorimétricas para la determinación de azúcares se basan en la reacción específica de estos compuestos con determinados reactivos para dar derivados coloreados. La formación de color se toma como resultado positivo e indica la presencia del compuesto en cuestión, mientras que la no formación de color es indicativa de su ausencia. Para cada prueba se utilizará un control negativo, también denominado blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o solvente adecuado). Aunque en la presente práctica se llevará a cabo sólo la determinación cualitativa de azúcares, las técnicas que se describen pueden, también, ser utilizadas para la determinación cuantitativa de dichas biomoléculas. Es importante que el alumno conozca la estructura y propiedades químicas de los compuestos que se van a utilizar, por lo que se le recomienda que acuda a sus notas de clase o a un libro de texto de bioquímica general para un mejor entendimiento y aprovechamiento de la práctica y para presentar y discutir los resultados obtenidos en el cuaderno de prácticas. (Diaz, s.f.)

b. Prueba de BarfoedEsta prueba permite diferenciar la diferencia entre un monosacárido y un disacárido se echa la muestra del problema en el tubo de ensayo luego se adicionan el reactivo de Barfoed y se coloca a baño maría durante dos minutos observamos.

Cabe resaltar que el reactivo de Barfoed se prepara disolviendo 13.3 gramos de acetato de cobre neutro cristalizado en 200 ml de agua destilada si es necesario se filtra y luego se agrega 5 ml de agua destilada si es necesario luego se agrega 5 mililitros de ácido acético.

Prueba de polisacáridos

a. Prueba de yodoEsta prueba se realiza con el reactivo de Lugol y sirve para identificar polisacáridos en la muestra del problema. Al reaccionar con el reactivo de Lugol que es la mezcla de ioduro de potasio con yodo acuoso se forma un compuesto coordinado de mezcla , esta mezcla que está en el tubo de ensayo se coloca a baño maría durante 5 minutos y observamos. (Morales, 2005)

4. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

MATERIALES

Gradilla para tubos Tubos de ensayo (10) Pera de succión. Vaso de precipitación de 250 ml Reverbero Pipeta de 10 ml (3) Pinza para tubos Espátula

REACTIVOS

Solución de glucosa Ácido sulfúrico concentrado Agua destilada Solución de fructuosa Solución de sacarosa Reactivo de Molisch Reactivo de Barfoed Reactivo de Seliwanoff Lugol Solución de lactosa Solución de almidón

5. GRÁFICOS

Reacciones de identificación

Prueba de Molisch

Prueba de Fehling

Sacarosa

Reacción de Seliwanoff

Prueba de yodo

6. PROCEDIMIENTO

1. REACCION DEL α – NAFTOL (MOLISH): A 2,5 ml de a solución de azúcar en un tubo de ensayo se añade dos gotas de reactivo e Molisch (sol. Al 5% de α – naftol en alcohol). Se mezcla bien. Se inclina el tubo y se deja caer por las paredes del tubo un ml de ácido sulfúrico concentrado (no agitar), formando una capa de ácido bajo la de azúcar, una zona roja- violeta aparecen en la unión de los dos líquidos.

2. PRUEBA DE REDUCCION

a. Prueba de Fehling: a un tubo con 2 ml de solución de Fehling (un ml reactivo de Fehling A y un ml de reactivo de Fehling), se adicionan 4 ml de agua destilada y se hierbe. A la solución caliente se adiciona 10 gotas de la adición de azúcar y se calienta la mezcla luego de cada adición la formación de un precipitado de un color amarillo o anaranjado rojo, indica que la reacción es positiva.

b. Prueba de Barfoed: a 2 ml de la solución de Barfoed se añade 1 ml de la solución de azúcar, se hierbe por un minuto y se deja en reposo. La reducción se indica por la formación de un precipitado rojo de óxido cuproso. Si el precipitado o aparece luego de hervir por un minuto, hervir de nuevo, dejar en reposo por 15 min y observar.

3. REACCION RESORCINOL: ACIDO CLORHIDRICO (SELIWANOFF) a 2 ml de reactivo de Seliwanoff se agrega 4 gotas de l solución de azúcar y se caliente por un minuto en un baño hirviente. Observe la aparición de un color rojo intenso con o sin separación de un precipitado rojo pardo. Este último puede disolverse en alcohol, al cual transmitirá una coloración roja.

4. PRUEBA DE YODOA una muestra de almidón, se agregan 2 gotas de la solución de yodo (Lugol). En otro tubo se prepara un blanco sustituido de 2 ml de agua destilada y 2 gotas de solución de yodo. Se compara los colores. Para el almidón se producirá un color negro azulado.

Reacción de Molisch

7. REACCIONES:Reacción de Molisch:

Reacción de Fehling

Reacción de Benedict:

Reacción de Barfoed:

Reacción de Seliwanoff:

8. OBSERVACIONES

Muestra N° 6

Por si sola la solución azucarada, presenta una coloración amarillenta, tiene cierta transparencia al colocarla en el tubo de ensayo, su olor presenta un leve dulzor.

MOLISHAl mezclarla con reactivo de Molisch, el color amarillento se acentúa, el resto de características físicas anotadas no presenta variaciones, incluido el olor de la muestra. Al colocar el ácido sulfúrico concentrado (HCl) por las paredes del tubo, claramente se diferencia una sección transparente en el fondo del tubo, y una de color amarillento en la parte superior, en medio de estas dos capas se forma una franja de color marrón a manera de anillo, es muy notoria, de aproximadamente 2mm de espesor, presenta turbidez.

YODOLa muestra al mezclarse con una gota de Lugol, adquiere un color amarillo – marrón, similar al color del reactivo, no se presenta una coloración fuerte ni azulada.

FELHINGEl reactivo de Fehling α tiene una coloración celeste muy débil, al mezclarse con reactivo de Felhingβ adquiere un color azul muy fuerte el cual se mantiene sin variaciones en el proceso de baño maría. Al colocar la muestra azucarada en el reactivo caliente durante pocos minutos se mantiene con la misma coloración azulada, pero al pasar el tiempo empieza a tornarse de color anaranjado, al cabo de 2 minutos 43 segundos de baño hirviente, la muestra obtiene un color ladrillo muy fuerte y diferenciado de la parte azul, el color anaranjado muestra varias tonalidades.

BARFOEDEl reactivo de Barfoed tiene un color celeste claro, al mezclarlo con la muestra azucarada no se produce ningún cambio de coloración, ni de otras características. Al cabo de varios minutos de estar en baño maría, en la base del tubo se forma un precipitado de color rojizo muy intenso, se diferencia claramente en la base del tubo de ensayo.

SELIWANOFFLa solución de azúcar en contacto con el reactivo de Seliwanoff, no presenta ninguna transformación de manera inmediata, se conserva el color del reactivo al largo de pocos minutos de baño maría, al cabo de 3 minutos en agua hirviente en color de la muestra se torna rojizo muy débil, pero a medida que pasa el tiempo la coloración se vuelve más intensa, hasta que a los 5 minutos con 20 segundos la solución azucarada adquiere un color rojo muy intenso.

9. RESULTADOS:

Sustancia Pruebas

Molisch Yodo Benedict Barfoed Seliwanoff

Muestra 1 + - + +

Muestra 2 + - + + +

Muestra 3 + +

Muestra 4 -

Muestra 5 + - -

Muestra 6 + - + + +

10.CONCLUSIONES

MOLISH

El anillo marrón-violeta que se forma entre la muestra y el ácido concentrado, es señal de un proceso de deshidratación, en los que se forman compuestos derivados del furano, que tienen la propiedad de condensarse con los fenoles dando materias colorantes. Esta reacción es propia para carbohidratos.

YODO

La muestra mantiene la coloración del reactivo debido a que no se trata de un polisacárido, ya que la reacción con yodo adquiere una coloración azul intensa, únicamente cuando entran en contacto con polisacáridos.

FELHING

La muestra azucarada es un azúcar reductor, dado que en la prueba de Fehling produce un precipitado.

BARFOED

La muestra problema es un monosacárido reductor, dado que la solución produce un precipitado de óxido cuproso en un tiempo menor a 5 minutos.

SELIWANOFF

El color rojo intenso que adquirió la solución en un tiempo mayor a 5 minutos indica que se trata de una aldosa, dado que se demora más tiempo en completar la reacción que una cetosa. Ciertos azúcares reaccionan con fenoles formando colorantes derivados del xanteno.

11.CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de identificación de azúcares con el reactivo de Molisch?

Se basa en la deshidratación de los carbohidratos por la presencia de ácido sulfúrico o ácido clorhídrico para producir un aldehído, que se condensa con 2 moléculas de α-naftol resultando en la coloración rosa/morada característica. Todos los carbohidratos debería dar una reacción positiva, y los ácidos nucleicos y glicoproteínas también dan una reacción positiva, ya que todos ellos son hidrolizados por los ácidos fuertes.

2. Indique cuales reacciones sirven para identificar azúcares reductores y explique su fundamento.

La prueba de Benedict nos ayuda al reconocimiento de azúcares reductores, es decir, aquellos compuestos que presentan su OH anomérico libre, en la reacción de Benedict, se puede reducir el Cu2+ que presenta un color azul, en un medio alcalino, el ión cúprico es capaz de reducirse por efecto del grupo aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso (Cu2O), que precipita de la solución alcalina con un color rojo-naranja, a este precipitado se lo considera como la evidencia de que existe un azúcar reductor. La evidencia de la reacción de Benedict es la formación del precipitado Ion Cuproso (Cu2O).

3. Indique cuales reacciones sirven para diferenciar entre monosacáridos y disacáridos y explique su fundamento.

Prueba de Barfoed: Se coloca la muestra del problema en el tubo de ensayo luego se adicionan el reactivo de Barfoed y se coloca a baño maría durante dos minutos observamos. en este caso se forma el gluconato de cobre o gluconato cúprico que es una sal orgánica, depositándose en el fondo del recipiente el oxido cuproso de color rojizo y la solución sobrante es el agua.

4. ¿Cuál es la reacción que nos permite distinguir entre aldosas y cetosas y explique su fundamento?

La prueba de Seliwanoff es una prueba química que se usa para distinguir aldosas y cetosas. Los azúcares son distinguidos a través de su función como cetona o aldehído. Si el azúcar contiene un grupo cetona, es una cetosa, y si contienen un grupo aldehído, es una aldosa. Esta prueba está basada en el hecho de que, al calentarlas, las cetosas son deshidratadas más rápido que las aldosas.

5. Explique con que prueba podemos distinguir polisacáridos

Esta prueba se realiza con el reactivo de Lugol y sirve para identificar polisacáridos en la muestra del problema.

Al reaccionar con el reactivo de Lugol que es la mezcla de ioduro de potasio con yodo acuoso se forma un compuesto coordinado de mezcla , esta mezcla que está en el tubo de ensayo se coloca a baño maría durante 5 minutos, la acción de este calor esta se torna de color azulino pues se ha formado el ioduro de almidón este almidón se formó por la acción de halógeno correspondiente como lo es el yodo con la diferencia que arranca una molécula de agua sin formar derivados del furfural como lo son en la reacción con los ácidos orgánicos y también se forma agua.

12.RECOMENDACIONES Lavar muy bien el material empleado antes, durante y después de la

práctica, para así evitar que existan resultados contrarios a los esperados.

Manejar con precaución todos los reactivos empleados, dado que pueden causar lesiones graves, especialmente el ácido debido que es corrosivo.

Usar una pipeta para cada reactivo, evitando que exista una contaminación de los mismos.

Mantener la temperatura del reverbero constante, para que el agua se mantenga hirviente durante toda la práctica para optimizar los resultados de las reacciones.

Usar un cronómetro confiable, para obtener el tiempo exacto en el que se produzcan los cambios de coloración.

Etiquetar los tubos con materiales que no se borren durante el baño maría, para evitar confusiones en las muestras.

BIBLIOGRAFÍA

Carbohidratos, Q. d. (s.f.). bioquimica.dogsleep. Obtenido de bioquimica.dogsleep: http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp06.pdf

Diaz, N. A. (s.f.). uco. Obtenido de uco: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/20%20REACCIONES%20COLOREADAS%20DE%20AZ%C3%9ACARES.pdf

Morales, A. F. (2005). Universidad nacional del callao. Obtenido de Universidad nacional del callao: http://www.fsalazar.bizland.com/pdf/POLISACARIDOS.pdf

13.ANEXOS

Muestra 6 Molisch

Yodo

Barfoed

Fehling

Seliwanoff