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Estudio ecotoxicológico del residuo de la extracciónartesanal de laca de NIIJ con 3 especies de organismos

de agua dulce: el alga verde unicelular Selenastrumcapricornutum, el rotífero Brachionus calyciflorus y elcrustáceo anacostraco Thamnocephalus platyurus

Informe final

Presentado al Instituto de InvestigacionesUniversidad del Valle de Guatemala

Lic. Pablo Mayorga

Guatemala, noviembre de 2001

_________________________________________________________________Análisis ecotoxicológico del remanente de la extracción artesanal de laca de NIIJPablo Mayorga Servicios y Productos Ambientales (SEPRA)

Contenido

RESUMEN .......................................................................................................................................ii

INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................1

LOS TOXKITS.....................................................................................................................................3

METODOLOGÍA..............................................................................................................................4

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ...........................................................................................................4BIOENSAYOS......................................................................................................................................4

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................................................5

CONCLUSIÓN.................................................................................................................................7

RECOMENDACIONES ...................................................................................................................7

LITERATURA CITADA ...................................................................................................................8

ANEXOS..........................................................................................................................................9


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Resumen

Se determinó la toxicidad aguda y el potencial eutroficante del remanente de laextracción artesanal de laca de NIIJ. Previo a los análisis, el material fue filtrado ycentrifugado. Este remanente particular contenía más de 30% de materialsedimentable y otro tanto de grasa, por apreciación cualitativa. Los microbioensayosecotoxicológicos utilizados fueron Algaltoxkit F (con el alga verde unicelular de aguadulce Selenastrum capricornutum), Rotoxkit F acute (con el rotífero de agua dulceBrachionus calyciflorus) y Thamnotoxkit F (con el crustáceo anacostraco de aguadulce Thamnocephalus platyurus).

La concentración letal media (CL50) del remanente, con el Rotoxkit F y elThamnotoxkit F, fue de 17% y 3.8%, respectivamente. No se hicieron determinacionescuantitativas con el bioensayo con algas porque hubo interferencia en lasdeterminaciones espectrofotométricas por crecimiento bacteriano (una sola especie).Sin embargo, se pudo observar, visualmente, un mayor crecimiento de algas entodas las diluciones del remanente que en el control (aproximadamente 18x más enla dilución al 0.391%).

Según el “Sistema de Clasificación de la Contaminación” para efluentes vertidos enambientes acuáticos, este efluente es de Clase IV: toxicidad aguda alta, con unpunteo ponderado de clase igual a 56.7%. También se concluye que este materialtiene un alto potencial eutroficante.

Se recomienda investigar las propiedades fisicoquímicas y microbiológicas delremanente y sus fracciones (especialmente potenciales propiedades biocidas yantimicrobianas) así como potenciales usos. No se recomienda verter el efluente alambiente sin recibir un tratamiento previo, especialmente si se piensa producir lacade NIIJ a gran escala.


Introducción

La determinación de los peligros resultantes de la contaminación accidental odeliberada de ambientes terrestres y acuáticos está, en la mayoría de países, aúnlimitada a la detección y cuantificación de los presuntos contaminantes por análisisquímicos (Persoone et al., 2000).

Desafortunadamente, esta metodología se ve limitada por los siguientes factores:

• los costos y dificultades técnicas de analizar cada sustancia química individualque pueda estar presente en la muestra, y

• la dificultad de calcular o valorar los peligros y riesgos de la contaminaciónambiental a partir de un conjunto de datos químicos (Persoone et al., 2000).

Durante las últimas décadas la comunidad científica y reguladora se ha dado cuentagradualmente que se deben considerar metodologías biológicas para una valoraciónde la significancia ecológica de los peligros toxicológicos de los contaminantes. Lasevaluaciones de efectos obtenidas con técnicas biológicas integran el impacto detodos los contaminantes a los que la biota está expuesta (Persoone et al., 2000).

Bioensayos con especies experimentales selectas, representantes de comunidadesbiológicas de los ambientes considerados se utilizan en la actualidad (más o menosrutinariamente [en algunos países industrializados]) para determinar efectos tóxicos ygenotóxicos. Considerando la especificidad de la toxicidad respecto de las especiesy de los químicos, la necesidad de un enfoque con una “batería de ensayos” conespecies de distintos niveles tróficos, generalmente se acepta e implementa en laactualidad (Persoone et al., 2000).

Entre los organismos que se utilizan o se han utilizado para efectuar bioensayos(“tradicionales”) se pueden mencionar, varias especies de:

bacterias; algas azulverdosas; levaduras; hongos; protistas flagelados y ciliados;algas microscópicas; plantas vasculares; celenterados; nemátodos; rotíferos;lombrices de tierra; moluscos; crustáceos; insectos; erizos de mar; peces; ranas y;mamíferos (ratones, ratas, cobayos, conejos y otros) (Kaiser y Palabrica, 1991).

Debe quedar claro que un balance entre análisis químicos, biológicos, toxicológicos ymicrobiológicos es siempre la mejor estrategia para generar la base de informaciónmás amplia sobre peligros ambientales (Persoone et al., 2000).

La necesidad de pruebas biológicas se ha topado con el problema de costosasociados con las pruebas ecotoxicológicas, especialmente las utilizadas paracontrol rutinario y monitoreo. Un problema mayor (si no el mayor problema) que limitala aplicación de bioensayos a un número restringido de laboratorios especializados,


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es la necesidad intrínseca y los altos costos de cultivo y mantenimiento continuo de“stocks” de organismos vivos para los ensayos (Persoone et al., 2000).

Intensa investigación se ha llevado a cabo en las últimas dos décadas en varioslaboratorios para desarrollar microbioensayos alternativos para permitir llevar a cabopruebas rutinarias de bajo costo, y con equipo y materiales básicos de laboratorio(Persoone et al., 2000).

Entre las principales características con las que debe contar un microbioensayo, sepueden mencionar:

• debe ser poco caro o rentable;• generalmente no requiere de trabajo intensivo;• potencialmente debe poder procesarse un alto número de muestras;• los cultivos de organismos deben ser fáciles de mantener o no requerir

mantenimiento del todo;• debe utilizar un modesto espacio de laboratorio e incubación;• bajo costo de consumibles (p.ej., recipientes para los bioensayos);• requiere de poco volumen de muestra (Blaise, 1991).

La reciente publicación de Persoone et al. (2000) evidencia la gran variedad debioensayos en pequeña escala desarrollados y la diversidad de aplicaciones quetienen. Algunos ejemplos del tipo de materiales o muestras que se puede analizarcon los bioensayos de toxicidad son los siguientes:

• aguas naturales (subterráneas, superficiales, intersticiales), efluentesindustriales (con o sin tratamiento), lixiviados (p.ej., de vertederos de desechos),lluvia, nieve

• suelos, sedimentos, lodos, compost, deposiciones atmosféricas• sustancias químicas sintéticas o naturales (puras o mezclas), productos de

consumo (doméstico o industrial), materias primas, biocidas, reactivos delaboratorio, pinturas preservantes para buques, medicamentos, extractosvegetales, alimentos, biotoxinas (algas, hongos, bacterias)

Entre las determinaciones que se pueden efectuar con los bioensayos se puedenmencionar las siguientes:

• evaluación de reducción de toxicidad (p.ej., en plantas de tratamiento)• concentración letal/efectiva/inhibitoria media (p.ej., CL50, CE50, CI50; en toxicidad

aguda y crónica)• concentración mínima inhibitoria• concentración sin efecto observado• riesgo ecotoxicológico de aguas naturales, efluentes y otras matrices, según el

Sistema de Clasificación de la Contaminación (FITA4 Programme, 2000)


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• potencial de eutroficación de aguas naturales o de efluentes líquidos, según elSistema de Clasificación de la Eutroficación (FITA4 Programme, 2000)

Para procesar los resultados de los efectos observados y obtener los datosnuméricos de las determinaciones de toxicidad aguda mencionadas anteriormente,existen paquetes de cálculos estadísticos para computadora (p.ej., Probit) y métodosmanuales de interpolación gráfica.

Los Toxkits

Los Toxkits son los microbioensayos utilizados por SEPRA. Estos son “kits” quecontienen todos los materiales necesarios para efectuar una prueba de toxicidad,incluyendo: “stocks” concentrados (sales prepesadas disueltas) de los mediosestándar; recipientes para incubación/lectura de resultados; y los organismos deprueba. Con estos se pueden efectuar bioensayos simples, rápidos, sensibles yreproducibles, a un costo muy por debajo del costo de bioensayos tradicionales.

Los Toxkits disponibles (F=agua dulce, M=marino/estuarino, y lo que se mide) son:

• protozoos: Protoxkit F (inhibición, densidad ópitca = DO, espectrofotómetro)• algas verdes unicelulares: Algaltoxkit F (inhibición, DO)• rotíferos: Rotoxkit F acute o chronic (mortalidad o reproducción,

estereomicroscopio), Rotoxkit M (mortalidad)• crustáceos anacostracos: Thamnotoxkit F, Artoxkit M (mortalidad)• crustáceos cladóceros: Daphtoxkit F magna, Daphtoxit F pulex,

Ceriodaphtoxkit F (inmovilización, con una mesa de luz y una lupa)• crustáceos ostrácodos: Ostracodtoxkit F (toxicidad crónica de contacto de

sedimentos; mortalidad y elongación corporal, estereomicroscopio)

Los Toxkits son utilizados en más de 40 países alrededor del mundo, incluyendoMéxico, Argentina, Chile, Colombia y Guatemala en América Latina.

El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la toxicidad ambiental aguda delresiduo o remanente de la extracción artesanal de laca de NIIJ de Rabinal, BajaVerapaz. Esto, para contribuir, por ejemplo, a la comercialización internacional delproducto final y a su certificación ambiental.


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Metodología

Preparación de la muestra

Se tomó un galón de la muestra del remanente en Rabinal, Baja Verapaz, enrecipientes plásticos nuevos y limpios. Se almacenó a 4ºC en oscuridad hasta quese analizó. En Guatemala se separó una alícuota de 400 ml.

La remoción de material suspendido se llevó a cabo por medio de centrifugación yfiltración. Primero se hizo una centrifugación (Gemmy PLC-012, Taiwán) a 3500 RPM(temperatura ambiente, 10 minutos) con remoción de, aproximadamente, 18% demateria sedimentable y 2% de grasa (estimado cualitativamente por volumen). Comoesto no fue suficiente, el material se filtró por un colador, un embudo con gasa,seguido de filtración al vacío (vertiendo el material gota a gota sobre el filtro)disminuyendo el tamaño de poro progresivamente (Whattman 41, 46 y 5). Con lafiltración se removieron más sólidos y grasa (~ 8%). Como el material no se aclaró,finalmente se hizo otra centrifugación (Hettich Rotina 35R, Alemania) a 10000 RPM(4ºC, 1 hora), sedimentándose una pequeña cantidad de un sólido pigmentado(púrpura, que mancha como una “tinta natural”) y más grasa (~ 2%).

El pH final de la muestra fue 6.

Bioensayos1

Se efectuaron bioensayos ecotoxicológicos con los siguientes kits (Toxkits,Microbiotests, Inc., Deinze, Bélgica) y organismos experimentales:

• Algaltoxkit F con el alga verde unicelular Selenastrum capricpornutum

Este bioensayo de 72h detecta la presencia de compuestos inhibitorios oestimulantes de la reproducción de las algas verdes unicelulares (respecto delcontrol) por mediciones en la densidad óptica (DO) a 670 nm con unespectrofotómetro con portacelda de 10 cm (Jenway 6300, Inglaterra). Como lamuestra purificada (100%) no dejó pasar la luz, se buscó la dilución cuya DO dejarapasar luz suficiente para leer un posible aumento en la DO. Esta dilución fue el6.25%, con una absorbancia de 0.887. Entonces, la serie de diluciones (1:1 vol.muestra / vol. medio estándar para algas) usada fue 6.25, 3.125, 1.563, 0.781 y0.391%. Como hubo toxicidad aguda en los otros bioensayos, crecimiento bacterianovisible después de 72h en todas las diluciones, y las diluciones 3.125 y 6.25% nodejaron pasar más luz después de 24 y 48h, respectivamente, no se efectuaron

1 para detalles visitar http://www.sepra-gt.com


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cálculos numéricos para determinar el potencial eutroficante de la muestra, segúnse indica en el Sistema de Clasificación de la Eutroficación (FITA4 Programme,2000). Se fotografió la prueba efectuada para mostrar el aumento en la densidad dealgas con el incremento de concentración de remanente (excepto al 6.25%, dondepredominó el color anaranjado) (Anexo 1). • Rotoxkit F, con el rotífero Brachionus calyciflorus, toxicidad aguda

Se hicieron diluciones 1:1 vol./vol. (100, 50, 25, 12.5 y 6.25 %).

• Thamnotoxkit F, con el crustáceo anacostraco Thamnocephalus platyurus

Se hicieron diluciones 1:1 vol./vol. (100, 50, 25, 12.5 y 6.25 %). Como hubo 100% demortalidad en todas las diluciones de la primera serie, se hizo otra serie: 6.25, 3.125,1.563, 0.781 y 0.391%.

Los efluentes son, usualmente, mezclas complejas de compuestos. Por esto, losProcedimientos Estándar Operacionales (PEOs) de los Toxkits para pruebas detoxicidad de efluentes (Algaltoxkit F, 1996; Rotoxkit F, 1992; Thamnotoxkit F, 1995)difieren de los usados para sustancias químicas puras. Entonces, para efluentes, lasdiluciones y las determinaciones de CL50 se efectúan usando unidadesporcentuales (% de dilución y CL50 expresada en la dilución al x% que causó el 50%de mortalidad en la prueba). Cuando se trata de sustancias químicas puras, se usamg/l como unidad de trabajo para las diluciones y determinaciones de CL50.

La incubación de todos los bioensayos se llevaron a cabo en una incubadora paraAlgaltoxkit F (Jenway L-Box, Inglaterra) a 25 + 0.5ºC (T. platyurus y B. calyciflorus enoscuridad y S. capricornutum con 8000 lux). Los conteos de mortalidad de rotíferos ycrustáceos, en sus placas multipozo correspondientes, se efectuaron con unestereomicroscopio (CETI, Bélgica) con un aumento 10 a 12x.

Las CL50 de las pruebas con invertebrados se calcularon con el método USEPA/600/485/013, 1985 y su versión computarizada en DOS (USEPA. 1985. Methods formeasuring the acute toxicity of effluents to fresh water and marine organisms. 3rd. ed.Toxdat. Multimethod program: binomial, moving average and Probit method).

Resultados y Discusión

La toxicidad aguda de la muestra se determinó con la metodología para efluentes delos PEOs de los Toxkits. La toxicidad aguda del remanente es muy alta según elSistema de Clasificación de la Contaminación. También se notó un incrementosustancial en la densidad de células de algas en los recipientes con remanentediluido en comparación al control (incluso con la dilución más baja, al 0.391%). Losresultados se detallan en el Cuadro 1.


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Cuadro 1. Efecto del efluente de extracción artesanal de NIIJ en cada bioensayo

Bioensayo Efecto (CL50 u otro) ComentariosAlgaltoxkit F Estímulo en reproducción

celular de las algas(potencial eutroficante). Ladilución al 0.391% causóaproximadamente 18 vecesmás crecimiento* que elcontrol (sin descontar la DOproducida por las bacterias).

Determinado por apreciaciónvisual (Anexo 1). No se pudocuantificar numéricamente porhaber toxicidad aguda en losotros bioensayos y porinterferencia de crecimientobacteriano (de una sola especiede cocobacilos Gram negativo;Anexo 2).

Rotoxkit F • Interpolación gráfica:17%.

• Con computadora**:prueba binomial: 16.6%;“moving average”: 15.5%;Probit: 15.5%

El efecto porcentual (EP) delefluente al 100% fue de 100% yen la dilución 1:10 no fuesignificativo (< 20%).

Thamnotoxkit F • Interpolación gráfica3.8%.

• Con computadora**:prueba binomial: 3.7%;“moving average”: 3.4%.No fue posible usarProbit.

El EP del efluente al 100% y dela dilución 1:10 fue de 100%; enla dilución 1:100 no fuesignificativo (< 20%).

*determinado con la ecuación lineal con la que se calcula el número de células correspondiente apartir de densidad óptica (curva de calibración para este lote de algas)**intervalos de confianza de 95%

Según el “Sistema de Clasificación de la Contaminación” para efluentes, éstepertenece a la Clase IV: toxicidad aguda alta con un punteo ponderado de clase de56.7% (FITA4 Programme, 2000) (ver cálculos en el Anexo 3).

El resultado anterior podría deberse a propiedades antimicrobianas del remanente.Esto es una posible explicación del por qué se encontró una sola especie bacteriana(cocobacilos Gram negativo) contaminando el bioensayo con algas en los recipientescon remanente de NIIJ (en el control no hubo contaminación). O es una especieresistente a sustancias presentes en el remanente o es una especie nativa delmismo. No se trabajó en condiciones de asepsia pero, si fuera contaminaciónmicrobiana proveniente del ambiente, probablemente habría más diversidad deespecies microbianas (bacterias, hongos, etc.).

Entonces, podría ser nocivo verter (grandes cantidades de) estos residuos encuerpos de agua. Esto sería de especial importancia si la industria de NIIJ llegara aser de gran escala. Además de ser eutroficante, este material, rico en materia


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orgánica, podría causar demanda bioquímica de oxígeno al descomponerse en elagua.

Conclusión

El remanente de la extracción artesanal de laca de NIIJ es altamente tóxico (a B.calyciflorus y especialmente a T. platyurus) según el Sistema de Clasificación de laContaminación. Además, contiene compuestos potencialmente eutroficantes, quefavorecen el crecimiento del alga S. capricornutum.

Recomendaciones

• No verter el remanente (crudo) al agua ni al suelo;• Efectuar pruebas de biodegradabilidad del remanente para evaluar posibles

métodos biológicos (p.ej., compost) de tratamiento previo a verterlo al ambiente;• Evaluar otros métodos de tratamiento (p.ej., oxidación química, etc.);• Determinar la toxicidad del material resultante del tratamiento;• Realizar pruebas de ecotoxicidad del efluente no tratado con organismos

descomponedores cuando haya un bioensayo adecuado en el que no interfiera elcolor de la muestra;

• Caracterizar fisicoquímicamente el efluente (compuestos de N, P, DBO/DQO yotros análisis básicos como materia seca, cenizas, etc.)

• Caracterizar microbiológicamente el efluente (o el interior de los insectos), asícomo sus posibles propiedades antimicrobianas (bacterias, hongos, etc.) ybiocidas en general;

• Determinar si es rentable optimizar la recuperación de la grasa recuperada porcentrifugación;

• Determinar si podría dárseles uso a (y si es rentable recuperar) otros compuestosseparados del remanente (como el sedimento púrpura y el material sólido);

• Implementar las recomendaciones como parte de un posible plan de manejointegrado de desechos de este remanente en particular.


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Literatura Citada

Algaltoxkit F. 1996. Freshwater toxicity test with microalgae. Standard OperationalProcedure. Creasel, Deinze, Bélgica. 28 pp.

Blaise, C. 1991. Microbiotests in aquatic ecotoxicology: characteristics, utility, andprospects. Toxicity Assessment 6:145-155

FITA4 Programme. 2000. Pollution Classification System y EutrophicationClassification System, en: Sustainable development, water quality and human health.International Workshop, Budapest, Hungary, 7-8 December 2000.

Kaiser, K.L.E. y V.S. Palabrica. 1991. Photobacterium phosphoreum toxicity data index.Water Pollution Research Journal in Canada 26(3): 361-431.

Persoone, G., C. Janssen y W. de Coen (eds.). 2000. New microbiotests for routinetoxicity screening and biomonitoring. Kluwer Academic / Plenum Publishers, NewYork. 550 pp.

Rotoxkit F. 1992. Rotifer toxicity screening test for freshwater. Standard OperationalProcedure. Cresel, Deinze, Bélgica. 22 pp.

Thamnotoxkit F. 1995. Crustacean toxicity screening test for freshwater. StandardOperational Procedure. Creasel, Deinze, Bélgica. 23 pp.


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Anexos


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Anexo 1. Cocobacilos Gram negativo presentes en el bioensayo de toxicidad conalgas con remanente de NIIJ diluido. Tinción de Gram. Aumento 1000x. Fotos:Cecilia Díaz de Mayorga.


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Anexo 2. Bioensayo de toxicidad con algas mostrando más crecimiento en lasceldas espectrofotométricas con remanente de NIIJ que en el control. El controlson los primeros 3 recipientes de la izquierda. Fotos: Charles MacVean.


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Anexo 3. Cálculos con el Sistema de Clasificación de la Contaminación paradesechos vertidos en ambientes acuáticos

• Determinación de unidades de toxicidad (UT = (1/CL50) x 100)

Bioensayo UT Punteo de claseAlgaltoxkit F no se aplica 0Rotoxkit F acute (1/17) x 100 = 5.9 2Thamnotoxkit F (1/3.8) x 100 = 26.3 3

Seguidamente, las muestras se clasifican en categorías, con base en el númeromás alto de UT encontrado en uno de los ensayos de la batería. En este caso,corresponde al Thamnotoxkit F.

• Clasificación en clases de toxicidad aguda

Clase IV: toxicidad aguda alta =.la LC50 se alcanzó en la dilución 10x en por lomenos un ensayo, pero no en la dilución 100x y posee entre 10 y 100 UT

• Asignación de punteo de ensayo

ver cuadro anterior

• Cálculo del punteo ponderado de clase

= suma de punteo de ensayos = 0 + 2 + 3 = 1.7número de ensayos efectuados 3

• Cálculo del punteo ponderado de clase en porcentaje

= punteo ponderado de clase x 100 = (1.7/3) x 100 = 56.7%punteo máximo de clase

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