dFISH o hibridación fluorescente in situ

Es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten

fluorescencia y permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así como de las anomalías que

puedan presentar. Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones,

inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética).

Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que son los más propensos a

sufrir anomalías. Están relacionados a enfermedades como el síndrome de Patau (13), el síndrome de Edwards (18),

el síndrome de Down (21), elsíndrome de Turner (X) y el síndrome del superhombre (Y), entre otros. Sin embargo,

como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta

técnica. FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia

fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. En un

principio se empleaban sondas de carácter radiactivo, pero este tipo de marcaje fue reemplazado por los fluoróforos

por mayor seguridad, eficacia y facilidad de detección.

La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase.

Protocolo básicoEl primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la muestra

desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero,

las sondas hibridan a las regiones específicas para las que han sido diseñadas. Después, se tiñen los núcleos con un

color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas

fluorescentes denominados fluoróforos (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos

fluorescentes (método indirecto). Por último, se visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.

FISH en metafaseCuando las células están en metafase, sus cromosomas se encuentran condensados a modo de preparación para

la división celular. Para detenerlas en metafase, se empleacolchicina, un agente despolimerizante de

los microtúbulos encargado de separar las cromátidas hermanas de un cromosoma, impidiendo así el avance de la

división celular. Este tipo de FISH se utiliza para detectar microdeleciones específicas, translocaciones o para

identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son:

Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean en estudios de

microdeleciones.

Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo

centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de cada cromosoma. Se usan para determinar

aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores.

Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma y

así marcar el cromosoma completo. Se usan para ver translocaciones.

En la imagen que acompaña el texto se muestra un ejemplo de uso de una sonda completa para el cromosoma 4, en

el que destacan las dos copias de dicho cromosoma sobre el resto.

FISH en interfaseNo siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para realizar el FISH, y los resultados obtenidos no serán tan

específicos. Sin embargo, el FISH en interfase tiene la ventaja de que no es necesario cultivar previamente las células

durante diversos días antes de poder analizar sus cromosomas. Además, cuando las células se encuentran en

interfase, la cromatina está en torno a 10 000 veces más descondensada que en metafase, lo cual permite una mayor

resolución a la hora de detectar anomalías pequeñas. Se emplea sobre todo para la detección de aneuploidias o

grandes deleciones, duplicaciones en células fetales o tumorales. No es posible distinguir entre un cariotipo normal y

un cariotipo que presente una translocación equilibrada. Además, puede ser empleado en el análisis de tumores

sólidos, que se dividen con muy poca frecuencia.

Una forma reciente derivada del FISH inverso son los arrays de CGH (del inglés "Comparative Genomic

Hybridization"), que están desplazando a técnicas como FISH y el cariotipo.

Otras variantes de FISHFISH en hebra

Este tipo de FISH (también llamado "Fiber FISH" o "Halo FISH") se aplica sobre hebras de ADN desproteinizadas (es

decir, desprovistas de las histonas encargadas de su compactación). Se extiende linealmente y de forma mecánica en

un porta el fragmento de cromosoma a estudiar. Se observarán puntos discontinuos por rotura de la hebra de ADN.

Esta técnica permite detectar pequeñas reorganizaciones porque admite una mayor resolución (permite incluso la

visualización de genes individuales). La técnica puede ser usada para detectar deleciones en clones y para estimar

huecos en los proyectos genoma.

FISH inverso

Por su parte, el FISH inverso es una técnica que se usa mucho para determinar la procedencia de un  cromosoma

marcador. Este tipo de FISH tiene la peculiaridad de ser el ADN problema el que se marca. El procedimiento consiste

en recortar un fragmento de cromosoma o dicho cromosoma marcador de un porta donde se encuentran todos los

cromosomas fijados. Se encuentran teñidos con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y

convertirlo en una nueva sonda. A continuación, ponemos los cromosomas de un donantes sin anomalías

(generalmente procedente de sus linfocitos y de un varón para contemplar todas las opciones, es decir, tener los

cromosomas X e Y) en un porta y añadimos la sonda preparada. Esperamos ver que hay hibridación de la sonda

(cromosoma marcador) con alguno de los cromosomas del donante por complementariedad en su secuencia. Así,

podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el que hibrida. Una vez identificado,

el cromosoma marcador pasaría a ser llamado un cromosoma derivativo.

FISH on a chip

Análisis de una muestra de sangre por la técnica FISH on chip:  Se introduce la muestra de sangre en el chip por capilaridad. Se

añade la proteína K para digerir las células y se desnaturaliza su ADN con calor. A continuación se introducen las sondas y se dejan

hibridar con el ADN diana.

Esta nueva variante de la técnica FISH, ha surgido como una forma de automatizar los estudios de muestras por el

método convencional. Esta nueva técnica conlleva numerosas ventajas, como la necesidad de utilizar menor cantidad

de reactivos, el empleo de un menor número tiempo de análisis (ya que en menos de una hora se pueden analizar los

núcleos, frente a las 2-3 horas que precisa el procedimiento de FISH convencional), su rapidez para la obtención de

resultados, su alta sensibilidad o su menor coste, con comparación con la técnica convencional de FISH.

La principal aplicación de este novedoso sistema es en el campo del diagnóstico clínico, sobre todo en el estudio de

enfermedades neuronales, como es el caso de la enfermedad del Alzheimer en su estadio temprano, aunque no se

descarta su uso en otros campos como en la industria alimentaria.

Se emplea un chip microfluídico con estrechos canales, por los que se hace pasar la suspensión celular purificada por

capilaridad, lavada previamente con PBS. Una vez adheridas o fijadas las células a los canales por calor, digerimos las

células mediante la adición de proteinasa K y desnaturalizamos su material genético, nuevamente por un incremento

de temperatura. Tras estos pasos, ya pueden ser añadidas las sondas y reactivos necesarios, que difundirán a lo largo

de todo el canal, pudiendo observar los núcleos bajo el microscopio en el mismo chip y de manera ordenada.

FISH on chip es una técnica muy útil para detectar anomalías cromosómicas (aneuploidías), entre otros defectos. En el

caso del Alzheimer, es habitual utilizar muestras de linfocitos procedentes de sangre periférica, fibroblastos o muestras

de orina.

FISH multicolor

El ‘’FISH Multicolor’’, ‘’M-FISH’’ o ‘’SKY’’ (Spectral Karyotiping) es una adaptación del FISH que permite la visualización

de los 23 pares de cromosomas a la vez, teñidos con diferentes sondas fluorescentes.

A nivel comercial sólo hay 5 colores distintos posibles, por lo que se puede usar la sonda de un color concreto o

combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo color. El sistema de detección del equipo empleado debe estar

adaptado a los 5 colores. Un programa informático se encarga de analizar las imágenes y formar el cariograma:

organiza los cromosomas de acuerdo a la emisión de las sondas que tiene integradas y las combina hasta dar las 23

combinaciones. Se utiliza con frecuencia en el estudio de células tumorales. El poder de dicho método reside en su

habilidad para:

Determinar rápidamente si hay algún cromosoma adicional en el cariotipo y de qué cromosoma se trata, porque su

color permitirá identificarlo.

Determinar si está presente algún cromosoma translocado y qué cromosomas están implicados en la translocación

por la combinación de dos colores asociados a cromosomas diferentes en un mismo cromosoma.

Rápida identificación de material cromosómico de un cromosoma que haya sido insertado en otro cromosoma por

la variación del color del fragmento insertado respecto al color de todo el cromosoma.

Identificación de cromosomas pequeños o fragmentados que frecuentemente implican el problema de averiguar su

origen, como es el caso de los cromosomas marcadores.

Estas aplicaciones del SKY se deben a que cada cromosoma está teñido completamente de un único color (de una

única sonda) y por eso, viendo el color que van a tener todos los cromosomas de la muestra podemos saber que

anomalía presenta el paciente.

Sin embargo, aunque se pensaba que iba a desbancar al cariotipo tradicional, tiene una serie de desventajas que han

frenado su uso, especialmente el uso clínico. Estas son:

El elevado precio

Menor definición que el FISH convencional. Sólo se pueden ver cromosomas y traslocaciones grandes, sin poder

observar bandas.

AplicacionesEsta técnica ha resultado ser muy útil en el campo de la medicina reproductiva, con aplicación en el  diagnóstico

genético preimplantatorio (DGP). Resulta una forma muy precoz de diagnóstico que, apoyándose en las técnicas de

reproducción asistida, posibilita el estudio de embriones antes de ser transferidos al útero materno y, por consiguiente,

antes de que se lleve a cabo la implantación embrionaria.

Para el análisis de anomalías cromosómicas embrionarias, tanto numéricas como estructurales, puede utilizarse la

técnica DGP-FISH. Para este fin se requiere una biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una célula del

embrión en cultivo "in vitro". Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el núcleo en

interfase y se hibrida con sondas específicas para el estudio cromosómico de la patología que se sospecha pueda

estar presente en el embrión.

Entre las anomalías cromosómicas que pueden ser analizadas, caben citarse:

Anomalías numéricas.-

Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo en pacientes implica que, en

muchos casos, sólo se den defectos leves en el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por

ir asociado, en mayor o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son los casos de síndrome de

Klinefelter, trisomía X ymonosomía X.

Edad materna avanzada, aborto de repetición de causa desconocida y/o fallo de implantación : Más

de la mitad de los casos son debidos a alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos

casos, la selección de aquellos embriones normales para los cromosomas citados, aumenta las

probabilidades de conseguir una gestación a término.

Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar las alteraciones cromosómicas

surgidas en la descendencia de aquellos grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que

recurrir a la técnica de microinyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI).

Anomalías estructurales.-

Surgen espontáneamente, en la mayoría de los casos, como consecuencia de un fallo de meiosis durante

la oogénesis o espermatogénesis, en los casos en que los padres presentan cariotipos normales. Algunas

veces, algún miembro de la pareja puede ser portador de una anomalía estructural equilibrada, que podría

transmitir a su descendencia. De esta manera, por medio del estudio genético específico de embriones de la

pareja portadora, podrían distinguirse aquellos embriones desequilibrados cromosómicamente de los

equilibrados. Una vez hecha esta selección de embriones, podrían transferirse con total tranquilidad al útero

materno los embriones que no presentan la alteración génica. Para detectar translocaciones recíprocas se

aplica un FISH en metafase usando sondas teloméricas y centroméricas, de manera que la ausencia de una

señal del telómero indica que existe una translocación, indistinguible con un FISH en interfase.

Una aplicación adicional del FISH en interfase es obtener mayor información sobre la organización de los

cromosomas en el núcleo interfásico (los llamados territorios cromosómicos).

Además de ser útil para realizar diagnósticos preimplantatorios, el FISH tiene aplicación en medicina para

detectar enfermedades y determinar el pronóstico de las mismas, así como para evaluar la remisión de

algunas enfermedades, como el cáncer. Con FISH es posible diagnosticar enfermedades incapaces de ser

detectadas por otros métodos tradicionales que implicaban el análisis de cromosomas en metafase. Además

su utilización es mucho más sencilla que los métodos citogenéticos más habituales, los cuales requieren

células en división, así como un mayor esfuerzo en tiempo y trabajo para la preparación manual y análisis de

las muestras.

También puede utilizarse para la detección directa de patógenos a partir de sangre o restos de tejidos de un

paciente. Esto supone una gran ventaja teniendo en cuenta que muchos microorganismos no son cultivables

en condiciones de laboratorio.

El FISH también se usa para comparar genomas de dos especies biológicas y deducir relaciones evolutivas.

Asimismo, se puede usar en el área de la Ecología Microbiana para identificar microorganismos dentro de un

biofilm, así como para observar su distribución y localización dentro del biofilm o realizar ensayos de

colocalización utilizando sondas de distinto color para cada microorganismo.

¿Qué es una prueba de ELISA?

Pruebas de ELISA son pruebas diagnósticas altamente sensibles y específicas para los médicos a diagnosticar

enfermedades, infecciones y sensibilidades. Una prueba de ELISA utiliza sangre de un paciente para medir

componentes específicos (llamadas antígenos) vinculados a una condición para proporcionar niveles cuantitativos.

Varias pruebas de ELISA están disponibles en los laboratorios, tales como la enfermedad del VIH, de Lyme, el

embarazo, hepatitis, úlceras gástricas o la faringitis estreptocócica.

Importancia 

Una prueba de ELISA es un ensayo inmunoenzimático. También se le llama una prueba de EIA. Las pruebas ELISA

son altamente pruebas específicas realizadas por un laboratorio médico (ensayos) que proporcionan mediciones de

las concentraciones de una sustancia (antígenos) en la sangre (resultados cuantitativos). Los niveles se establecieron

que determinar si la concentración de antígeno se diferencia de las cantidades normales, lo que indica un resultado

positivo o negativo. Dado que las pruebas de ELISA son muy específicos, estos son eficaces para ayudar a los

médicos a diagnosticar infecciones como el VIH o la enfermedad de Lyme, identifican alergias o confirmar el

embarazo.

Muestra de sangre 

Un profesional de la salud o en el laboratorio técnico recoge una muestra de sangre de una vena en un vial usando

una técnica aséptica (es decir, la zona, como el interior de su codo se limpia antes de insertar una aguja estéril). El vial

que contiene la muestra de sangre se etiqueta y se envía a un laboratorio para su análisis. El análisis implica ver si los

componentes en la sangre reaccionan con una sustancia diana (anticuerpo) para un resultado positivo, que indica que

el paciente tiene el antígeno para la afección o enfermedad. A veces, un resultado positivo es normal porque una

enfermedad puede afectar a las funciones normales del cuerpo (lo que en este caso, un resultado positivo para la

enfermedad estaría indicada por ninguna reacción a la sustancia diana).

Ensayo 

La prueba de ELISA utiliza una placa que contiene múltiples pozos (microplaca). Las muestras diluidas se colocan en

los pocillos y una muestra de control también se dispensa para la comparación. Anticuerpos marcados se añaden a las

muestras y se retira el exceso de solución. La placa se procesa en una máquina que mide la cantidad de reacción que

se produjo a través del nivel de anticuerpos y antígenos restantes etiquetados. Este análisis calcula la concentración

de la sustancia que se encuentra en la sangre. La muestra de control proporciona una comprobación de que la prueba

está funcionando correctamente y proporciona una concentración conocida para un resultado positivo o negativo.

Precisión 

Pruebas de ELISA son muy específicas con anticuerpos para medir diversas sustancias en la sangre. Un frasco de

sangre se puede dividir para múltiples muestras de prueba, porque una indicación de cualquier número de sustancias

puede determinar un resultado positivo para una enfermedad. La concentración medida por el análisis puede

proporcionar a los profesionales de la salud con la extensión o gravedad de la condición.

Consideraciones 

Una extracción de sangre es necesario para una prueba de ELISA. Informe a su profesional de la salud o en el

laboratorio técnico de la recogida de una muestra de sangre si usted tiene problemas de la vena o la presión arterial

problemas de sangrado o de coagulación, o. Algunos pacientes tienen venas pequeñas que son difíciles de aislar para

la extracción de sangre y puede tomar más tiempo para recoger una muestra de tamaño adecuado.

VENTAJAS PRUEBA DE ELISA

(ELISA) ensayos ligados a enzimas, son pruebas que se utilizan para detectar la respuesta inmune en el cuerpo

humano. Pruebas de ELISA se utilizan para detectar una variedad de condiciones médicas tales como virus de

inmunodeficiencia humana (VIH), las alergias y el Virus del Nilo Occidental y los resultados se obtienen normalmente a

través de la prueba de sangre.

Resultados rápidos 

Una de las mayores ventajas en lo que respecta a la prueba de ELISA es la capacidad de obtener resultados rápidos y

precisos. Todo lo que se requiere para llevar a cabo una prueba de ELISA es una simple muestra de sangre, que se

obtiene normalmente a través de la extracción de sangre del brazo o del dedo del paciente. Una vez que se extrae la

muestra, la sangre se envía al laboratorio de la preferencia del médico, donde se comprueba si es para los anticuerpos

que son consistentes con los observados en los pacientes que tienen VIH, Virus del Nilo Occidental u otras

enfermedades de base de sangre que el médico pueda ser la comprobación de.

Mínimas molestias 

Porque todo lo que se requiere para hacer un diagnóstico preciso es una muestra de sangre, la mayoría de los

médicos, enfermeras o flebotomistas pueden obtener la muestra de sangre necesaria a través de una sola muestra.

Esto puede reducir en gran medida el malestar y la ansiedad de tener que dar su consentimiento para dibuja varios

sangre. Típicamente, las muestras de sangre se pueden obtener en menos de cinco minutos y no requieren sedación

o adormecimiento de la piel. Sin embargo, si el paciente está sufriendo de una condición que ha afectado a la

capacidad de obtener una muestra debido a las venas disminuidos, valores aleatorios que sean necesarias, que a

veces puede conducir a la aparición de moretones y molestias adicionales.

Altamente Sensible 

Una de las razones más comúnmente celebrado para la utilización de ensayos ELISA para detectar las presencias de

los anticuerpos que se encuentran en condiciones tales como el Virus del VIH y del Nilo Occidental es la naturaleza

altamente sensible de las pruebas, lo que puede permitir que un médico se sienta seguro en su diagnóstico de la

paciente. Pruebas de ELISA son favorecidas frente a otras opciones de pruebas tales como radioinmunoensayo (RIA)

las pruebas, ya que, no sólo son pruebas de ELISA más sensible que el radioinmunoensayo (RIA) las pruebas, pero se

pueden realizar en las medidas más rentables. A diferencia de radioinmunoensayo (RIA) Ensayos de ELISA no

requieren pruebas de radioisótopos o equipos adicionales tales como herramientas de la radiación de conteo.