Tomo 5 - El Islote Pancreático En El Desarrollo Y Tratamiento De La Diabetes

El islote pancretico en el desarrollo y tratamiento de la diabetesCOORDINADOR

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Eduard Montanya

EDITORIAL DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES

El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes

COORDINADOR

Eduard Montanya

MIEMBROS DEL GRUPO DE TRABAJO ISLOTES PANCREATICOS DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES.Dr. Manuel Aguilar DiosdadoJefe de Servicio, Hospital Puerta del Mar, Cdiz

Dr. ngel Nadal NavajasInstituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.

Dr. Albert Barber LluisLaboratorio de Diabetes y Obesidad Experimentales. Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer, Barcelona

Dra. Anna Novials SardEndocrinloga. Directora Fundaci Sard Farriol

Dr. Ivan Quesada MollInstituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.

Dr. Francisco Jos Bedoya BerguaCentro Andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Universidad Pablo de Olavide de Sevilla

Dra. M Jos Redondo VelascoClnica Universitaria de Navarra

Dr. Enrique Blzquez FernndezCatedrtico y jefe de Servicio departamento de bioqumica y biologa molecular, facultad de Medicina Universidad Complutense.

Dr. Enrique Roche ColladoProfesor Titular de Universidad. Departamento de Biologa Aplicada, rea de Nutricin Universidad Miguel Hernndez. Alicante

Dr. Jess Cancelas NaviasDpto. Metabolismo, Nutricin y Hormonas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid.

Dra. Petra Snchez Garca CervignHospital Gregorio Maran

Dr. Lus Castao GonzlezHospital de Cruces- Bilbao

Dr. Bernat Soria EscomsCentro andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa, Universidad Pablo Olavide, Sevilla

Dra. Mara Gasa AmaldichLaboratorio de Diabetes y Obesidad Experimentales. Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer, Barcelona

Dr. Juan R. Tejedo HuamnInvestigacin, CABIMER, Sevilla

Dra. Isabel Valverde AlonsoConsultora, FJD, Departamento de Metabolismo, Nutricin y Hormonas, Madrid

Dr. Fernando Gmez Peralta,Adjunto Hospital Clnico Universitario de Salamanca

Dr. Ramn Gomis BarberHospital Clinic i Provincial. Barcelona

Dra. Mara Luisa Villanueva-PeacarrilloDpto. Metabolismo, Nutricin y Hormonas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid.

Dr. Antonino Jara AlbarrnJefe de Servicio Hospital Gregorio Maran

Dra. Marta Vives-PiServei dEndocrinologia Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Badalona. Barcelona

Dra. Judith Lpez FernndezAdjunto Hospital Universitario de Canarias

Dr. Franz Martin BermudoInvestigacin, CABIMER, Sevilla

Dr. Eduard Montanya MiasJefe de Seccin. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge. Profesor Asociado. Departamento de Ciencias Clinicas. Facultad de Medicina Universidad de Barcelona.

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SOCIEDAD ESPAOLA DE DIABETES.

JUNTA DIRECTIVAPRESIDENTE. Dr. Ramon Gomis de BarbarHospital Clnic i Provincial. Barcelona

VICEPRESIDENTE 1. Dr. Lus Castao GonzlezHospital de Cruces. Bilbao

VICEPRESIDENTA 2. Dra. Adela Rovira LoscosFundacin Jimnez Daz. Madrid

SECRETARIA. Dra. Lucrecia Herranz de la MorenaHospital La Paz. Madrid

VICESECRETARIO. Dr. Juan Emilio Feliu AlbianaInstitut de Recerca. Hospital Vall dHebron. Barcelona

TESORERO. Dr. Jos Manuel Fernndez-Real LemosHospital Joseph Trueta. Girona

VOCAL 1. Dra. Sara Artola MenndezCentro de Salud Loranca. Fuenlabrada (Madrid)

VOCAL 2. Dra. Ana Chico BallesterosHospital Cruz Roja Dos de Maig. Barcelona

VOCAL 3. Dr. Alberto Moreno CarazoCentro Hospitalario de Jan

VOCAL 4. Dr. Joseph Franch NadalABS Raval Sud-ICS Drassanes. Barcelona

VOCAL 5 Dr. Alfonso Lpez AlbaHospital Universitario de Canarias. Tenerife

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NDICE DE AUTORESQuesada Moll IInstituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.

Sancho Bmez VDpto. Metabolismo, Nutricin y Hormonas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid.

Tudur Lpez EInstituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.

Valverde Alonso IDpto. Metabolismo, Nutricin y Hormonas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid.

Nadal Navajas, AInstituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.

Villanueva-Peacarrillo MLDpto. Metabolismo, Nutricin y Hormonas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid.

Vives-Pi M Lucas Martn AServei dEndocrinologia Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Badalona. Barcelona

Montanya Mias EJefe de Seccin. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge. Profesor Asociado. Departamento de Ciencias Clinicas. Facultad de Medicina Universidad de Barcelona.

Planas Bas RLaboratori dImmunobiologia per a la Recerca i les Aplicacions Diagnostiques (LIRAD). Banc de Sang i Teixits (BST). Fundaci Institut dInvestigaci en Cincies de la Salut Germans Trias i Pujol

Nacher Garca MFacultativo Especialista. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge.

Tllez Besol NInvestigador, Institut dInvestigaci Biomdica de Bellvitge (IDIBELL), Servicio de Endocrinologa, Hospital Universitari de Bellvitge.

Roche Collado EProfesor Titular de Universidad. Departamento de Biologa Aplicada, rea de Nutricin Universidad Miguel Hernndez. Alicante

Barber Lluis ALaboratorio de Diabetes y Obesidad Experimentales. Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer, Barcelona

Bedoya Verruga FJCentro Andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Universidad Pablo de Olavide de Sevilla

Tejedo Huamn JRCentro Andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Universidad Pablo de Olavide de Sevilla

Gasa Amaldich RMLaboratorio de Diabetes y Obesidad Experimentales. Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer, Barcelona

Cahuana GCentro Andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Universidad Pablo de Olavide de Sevilla

Martn Bermudo FCentro andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa, Universidad Pablo Olavide, Sevilla

Novials Sard AEndocrinloga. Directora Fundaci Sard Farriol

Vaca Snchez PCentro andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa, Universidad Pablo Olavide, Sevilla

Casas Fontdevila SInvestigadora bsica. Fundaci Sard Farriol

Soria Escoms BCentro andaluz de Biologa Molecular y Medicina Regenerativa, Universidad Pablo Olavide, Sevilla

Cancelas Navias ADpto. Metabolismo, Nutricin y Hormonas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid.

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NDICE DE CAPTULOS14

Introduccin.Eduard Montanya 92 CAPTULO 6

18 CAPTULO 1

Regulacin por la glucosa de la funcin de las clulas alfa, beta y delta del islote de Langerhans.Ivan Quesada, Eva Tudur, Angel Nadal 34 CAPTULO 2

Las incretinas en la secrecin de insulaJess Cancelas, Vernica Sancho, Isabel Valverde, Mara Luisa Villanueva-Pealcarrillo. 108 CAPTULO 7

Autoinmunidad frente a los islotes en pacientes con diabetes mellitus tipo 1M Vives-Pi, A Lucas, R. Planas 50 CAPTULO 3

Terapia celular en diabetes: trasplante de islotesEduard Montanya, Montserrat Ncher, Noelia Tllez. 124 CAPTULO 8

Glucolipotoxicidad en la clula beta y su relacin con la diabetes tipo 2Enrique Roche Collado 66 CAPTULO 4

Desarrollo embrionario del pncreas y regeneracin en el pncreas adultoAlbert Barber, Rosa Gasa 140 CAPTULO 9

Lesin y supervivencia de las clulas beta pancreticasFrancisco Bedoya, Juan Tejedo, Gladys Cahuana 78 CAPTULO 5

Celulas Troncales en el tratamiento de la diabetesFranz Martin, Pilar Vaca, Bernat Soria

Amilina y toxicidad beta pancreticaAnna Novials Sard

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Edita: Sociedad Espaola de Diabetes

Diseo, realizacin y produccin:

Orfila, 5. 28010 Madrid 2007 Sociedad Espaola de Diabetes (SED) Don Ramn de la Cruz, 88 28006 Madrid Impresin: Grficas Monterreina Impreso en Espaa- Printed in Spain Depsito Legal: ISBN: 978-84-691-0089-9Todos los derechos reservados. Prohibido reproducir ninguna parte de esta publicacin, ni transmitirla a ningn medio electrnico, mecnico, fotocopiarlo, en discos, ni de cualquier otra forma, sin la previa autorizacin escrita del copyright. Responsabilidad de productos: el editor no puede garantizar los datos sobre posologa y aplicaciones de los productos indicados en este libro. En cada uno de los casos, el usuario tiene que comprobar su precisin consultando otra literatura farmacutica.

www. sediabetes.org

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Introduccin

AUTOR

Eduard Montanya

Jefe de Seccin. Servicio de Endocrinologa. Hospital Universitari de Bellvitge. Profesor Asociado. Departamento de Ciencias Clinicas. Facultad de Medicina Universidad de Barcelona.

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Introduccin

IntroduccinLa edicin de este nuevo libro de la coleccin de monografas de la Sociedad Espaola de Diabetes es una oportunidad para hacer una breve presentacin del Grupo de Islotes Pancreticos. El Grupo de Islotes est integrado por investigadores cuyas lneas de trabajo estn centradas en el estudio de la biologa celular y molecular del islote pancretico desde perspectivas diversas. A partir del nexo comn que significa el inters por el islote pancretico, el grupo incorpora perfiles profesionales y reas de conocimiento diversas con mdicos, bilogos, bioqumicos o farmacuticos con lneas de investigacin bsicas, preclnicas y clnicas. Los captulos de la monografa tienen una relacin directa con las lneas de trabajo que los miembros del Grupo de Islotes desarrollan y refleja la diversidad y complementariedad de sus lneas de investigacin. En un entorno en el que la interrelacin entre investigadores es fundamental, el Grupo de Islotes ofrece un foro de comunicacin, intercambio y participacin entre profesionales de mbitos distintos que a menudo es difcil encontrar en otras sociedades o grupos de trabajo. La monografa que presentamos pretende ofrecer al lector interesado pero no especializado, una visin actual del papel fundamental del islote pancretico en la etiopatogenia y el tratamientos de la diabetes. El captulo 1 muestra una visin global de la funcin del islote como rgano endocrino en el que la integracin de las respuestas de los distintos tipos celulares del islote conforman su funcin. El papel fundamental de la destruccin autoimmune del islote en el desarrollo de la diabetes tipo 1, cuyos mecanismos se revisan de forma actualizada en el captulo 2, est bien establecido desde hace aos. Por el contrario, la aceptacin del concepto de que la disfuncin y prdida de clulas beta es tambin esencial para la aparicin de la diabetes tipo 2 es ms reciente. En este sentido en el capitulo 3 se discute el papel de la glucotoxicidad en la clula beta en el desarrollo de diabetes tipo 2. Recientemente se ha postulado que aunque con orgenes distintos, los mecanismos de destruccin de las clulas beta del islotes pueden ser comunes en la diabetes tipo 1 y tipo 2, y estos aspectos, junto con los procesos de supervivencia que se ponen en marcha tras la lesin de la clula beta se discuten en el captulo 4. Las controversias acerca del papel de la amilina en la etiopatognesis de la diabetes tipo 2 se analizan en el captulo 5, que incluye los interesantes hallazgos de mutaciones en el gen de la amilina en16

Introduccin

pacientes con diabetes. Las aportaciones de la investigacin en islotes al tratamiento de la diabetes se aprecian en el captulo 6, dedicado al papel de las incretinas en el estmulo de la secrecin de insulina, aspecto de gran actualidad por la reciente aprobacin de los primeros frmacos basados en la accin de GLP-1 para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Finalmente, la sustitucin o la regeneracin de las clulas beta ofrece la apasionante posibilidad de lograr la curacin de la diabetes. La situacin actual del trasplante celular en la diabetes y en especial del trasplante de islotes se revisa en el captulo 7, y la posibilidad de generar clulas productoras de insulina a partir de clulas madres embrionarias o adultas, para cuyo fin el conocimiento de la embriognesis del pncreas endocrino aporta una informacin que puede ser fundamental, se analiza en los captulos 8 y 9 de la monografa. Es el deseo de los miembros del Grupo de Islotes que hemos participado en la elaboracin de esta monografa que sea de utilidad para facilitar una mejor comprensin del papel central del islote pancretico en el desarrollo de la diabetes, y acerque de una forma rigurosa pero comprensible las implicaciones que para el conocimiento y curacin de la diabetes puede aportar la actividad de los miembro del grupo desde los resultados de sus lneas de trabajo.

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CAPTULO 1Regulacin por glucosa de la funcin de las clulas alfa, beta y delta en el islote de LangerhansAUTORES

Ivan Quesada Eva Tudur ngel Nadal

Instituto de Bioingeniera, Universidad Miguel Hernndez, Elche.

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1. IntroduccinLa regulacin de la glucemia por parte del islote depende principalmente de la funcin individual de las diferentes poblaciones celulares que lo integran y de la interaccin entre stas. La masa de clulas endocrinas del pncreas apenas constituye un 1% del total del rgano, y se agrupa en poblaciones de 1000-3000 clulas formando los islotes de langerhans. El tipo celular predominante corresponde a la clula -pancretica, responsable de la liberacin de insulina, mientras que la clula secretora de glucagn y la secretora de somatostatina estn representadas en una menor proporcin. Si bien en ratn la clula constituye alrededor del 70-80 % del islote y la clula en torno al 20 %, estudios recientes en humano han demostrado una presencia mayor de clulas (55 % de clulas frente a un 40 % de ). Estos trabajos han puesto de manifiesto la especial relevancia de las clulas secretoras de glucagn en la funcin del islote humano. En el caso de las clulas secretoras de somatostatina, stas pueden llegar a constituir el 10 % del total del islote. Otros tipos celulares minoritarios como las clulas PP productoras del polipptido pancretico constituyen menos del 1 %. El control de la glucemia por parte del islote se debe mayoritariamente a la accin directa de las clulas y . Mientras que la clula libera insulina con concentraciones crecientes de glucosa, la secrecin de glucagn por parte de la clula tiene lugar en condiciones hipoglucmicas. La poblacin ejerce una funcin reguladora indirecta a travs de mecanismos paracrinos ya que la somatostatina inhibe la secrecin de las clulas y . Adems de la funcin y la interaccin de estos tipos celulares, la regulacin de la glucemia est tambin sometida a varios niveles de control neuronal y hormonal aunque no vamos a abordarlos en este captulo. Casi todos los trabajos cientficos han sido dirigidos al estudio de la clula y la secrecin de insulina, de manera que hoy en da se tiene un gran conocimiento de la regulacin de este tipo celular. Sin embargo, se sabe muy poco de la fisiologa de las poblaciones no- pese a su importancia en el islote y a su papel en el control de la glucosa. Esta falta de informacin en los estudios del islote se debe a varios factores; siendo el principal la escasa representacin de estos tipos celulares en el islote frente a la presencia dominante de la clula . Igualmente contribuye el hecho de que debido a la escasa caracterizacin de estas clulas hayan faltado patrones de identificacin y que las metodologas convencionales presentaban limitaciones tcnicas para poder estudiar de forma inequvoca e independiente estas poblaciones en el islote entero. Las innovaciones recientes en mltiples tcnicas ha propiciado en20

Regulacin por glucosa de la funcin de las clulas alfa, beta y delta en el islote de Langerhans

los ltimos aos la aparicin de varios estudios abordando la fisiologa de las clulas y . Una caracterstica especialmente interesante es que varios de estos trabajos se han realizado en el islote intacto. Si bien la informacin acerca de las clulas y basndose en lneas celulares o en clulas aisladas en cultivo resulta relevante, se ha constatado que estos modelos presentan diferencias fisiolgicas con respecto a las observaciones realizadas en el islote de Langerhans intacto. De hecho, segn han evidenciado algunos trabajos in vivo, el islote intacto como modelo de estudio se acerca mucho ms al comportamiento fisiolgico. Estas diferencias resultan principalmente de la importancia crtica en el funcionamiento del islote del contacto clula-clula y de la regulacin autocrina y paracrina. En base a estos motivos, en los ltimos aos varios grupos de investigacin han tratado de caracterizar la fisiologa de las clulas , y en el islote intacto, o incluso revisar conceptos cuyas conclusiones previas derivaban de estudios procedentes de modelos diferentes. En este captulo nos centraremos en la descripcin de los mecanismos que regulan la funcin de los tipos celulares , y , principalmente en base a estudios realizados en el islote intacto. La funcin individual e interaccin de estos tres tipos celulares constituye la principal lnea de accin en la regulacin de la glucemia.

2. Regulacin de la secrecin de insulina de la clula por glucosa.El esquema de acoplamiento estmulo-secrecin en clula est ampliamente aceptado, si bien algunos datos de este modelo se han revisado tras diversos estudios en islote entero utilizando tcnicas electrofisiolgicas y de microscopa confocal. La glucosa extracelular entra en el citosol a travs de transportadores especficos (tipo GLUT-2), donde se metaboliza a piruvato mediante la gliclisis. El piruvato en la clula es mayoritariamente metabolizado por va aerbica, de manera que entra en la mitocondria, activando el ciclo de Krebs que da lugar a la produccin de CO2 y los nucletidos NADH y FADH2. Estos ltimos actan como fuente de transferencia de electrones en la cadena de reacciones que participan en la fosforilacin oxidativa y en la sntesis de ATP. El incremento en la razn ATP/ADP da lugar al cierre de los canales de K+ dependientes de ATP (KATP), lo cual lleva a una despolarizacin respecto a los valores de potencial de reposo que se sitan de -60 a -80 mV (ver figura 1A). En ausencia de21


glucosa, la conductancia de los canales KATP es de 4 nS, y con el incremento de la concentracin de este azcar se produce una disminucin creciente de esta conductancia con una inhibicin media en torno a 5 mM glucosa. La despolarizacin derivada del cierre de canales KATP activa canales de Ca2+ dependientes de voltaje, permitiendo as la entrada de Ca2+ desde el exterior. En condiciones de concentraciones estimulatorias de glucosa, la actividad elctrica en la clula sigue un patrn oscilatorio en el islote de manera que se generan oscilaciones del potencial de membrana entre un valor de despolarizacin, sobre el que se generan potenciales de accin (fase activa), y una fase silente de repolarizacin del potencial de membrana. Si bien durante los potenciales de accin de la fase activa slo intervienen corrientes de Ca2+ mediadas por canales tipo L en ratn, en humano adems participan corrientes de Na+ dependientes de voltaje. El incremento de Ca2+ citoslico derivado de la apertura de canales de Ca2+ dependientes del potencial de membrana es la seal que desencadena la secrecin de insulina. Ante un estmulo de glucosa por encima de 8 mM, se produce una seal de Ca2+ oscilatoria que da lugar a una liberacin pulstil de insulina (ver figura 2). A diferencia de lo que ocurre cuando se encuentran aisladas en cultivo, las clulas en el islote intacto generan un patrn oscilatorio regular y sincrnico tanto a nivel de la actividad elctrica como de la seal de Ca2+. En ratn, esta coordinacin se debe a la existencia de un alto grado de acoplamiento celular mediado por uniones tipo gap (gap-junctions) que permiten el funcionamiento en forma de sincitio de toda la poblacin . Este acoplamiento en islotes de ratn se cree que es indispensable para una adecuada liberacin de insulina, dando lugar a una secrecin ms vigorosa. Sin embargo, estudios recientes en islotes humanos indican que el acoplamiento celular y la coordinacin de las seales de Ca2+ tienen lugar en grupos de clulas, coincidiendo con su organizacin espacial, pero no en todo el islote. En el islote de ratn la poblacin est agrupada en el centro con ramificaciones hacia la superficie, mientras que las clulas y se disponen en las capas ms superficiales. Sin embargo, la organizacin espacial en el islote humano es mucho ms azarosa con grupos celulares ubicados sin un patrn espacial definido. El significado funcional de esta estructuracin en el caso del islote humano est an por resolver. Adems de un efecto directo sobre la secrecin de la clula , la glucosa tambin ejerce una accin indirecta al estimular la exocitosis de la propia poblacin y de clulas vecinas, favoreciendo as la co-secrecin junto a las hormonas del islote, de diferentes molculas que permiten una regulacin autocrina y paracrina. En condi22


ciones de hipoglucemia se secreta glucagn, que tiene un efecto positivo sobre la secrecin de insulina, posiblemente por incremento de los niveles de AMP cclico en clula . En cambio, a concentraciones elevadas de glucosa extracelular se secretan varias molculas con efecto inhibitorio. Una de ellas es la somatostatina liberada desde las clulas . Aunque el mecanismo de accin no est todava completamente analizado, parece que implica una disminucin de niveles de AMP cclico. Por otro lado, el cido -aminobutrico (GABA) cosecretado con la insulina regula negativamente y de manera autocrina al unirse a receptores GABAB que se expresan en la clula . La disminucin de la exocitosis tiene lugar por activacin de protenas G inhibitorias. Por ltimo comentar el papel autocrino y paracrino del ATP extracelular que se cosecreta junto a las hormonas del islote desde los grnulos. Estudios recientes utilizando tcnicas electrofisiolgicas demuestran que el ATP es capaz de reducir la secrecin inducida por glucosa actuando a varios niveles pero sobretodo por una interferencia directa con el proceso de exocitosis. Aunque los mecanismos de control de las clulas y no estn todava muy definidos, existen importantes paralelismos con respecto a la clula . Las clulas y no slo son elctricamente excitables sino que adems la glucosa regula su actividad elctrica, y su secrecin hormonal es dependiente de Ca2+ y de canales dependientes de voltaje.

3. Regulacin de la secrecin de glucagn de la a clula por glucosaA pesar de que la regulacin de la glucemia en unos determinados lmites depende tanto de la insulina como del glucagn en base a perfiles de funcionamiento antagnicos, se sabe muy poco de la regulacin de la clula . El inters por su estudio ha ido creciendo no slo por una comprensin de la fisiologa integral del islote, sino tambin por razones clnicas. En el caso de pacientes diabticos se pueden observar niveles de glucagn elevados que, junto a los niveles bajos de insulina, agravan la hiperglucemia. Se puede observar adems en estos casos que la inhibicin caracterstica de la secrecin de glucagn al aumentar la glucemia est alterada, e incluso falla. Hasta hace poco, los nicos datos acerca del comportamiento de este tipo celular se basaban en estudios de secrecin de glucagn. En los ltimos aos se han desarro23


llado mltiples estudios que abordan su fisiologa tanto a nivel celular como molecular. No obstante, an no se ha llegado a un consenso respecto a los mecanismos que dirigen su funcionamiento ya que son mltiples los niveles de regulacin que afectan a la poblacin , incluyendo un control neural, un importante control paracrino a partir de la secrecin de clulas y vecinas, y tambin un control directo por parte de la glucosa. Debido a que el efecto paracrino es importante dentro del islote, todava no se sabe con exactitud si la inhibicin en la secrecin de glucagn a concentraciones elevadas de glucosa es debida estrictamente al azcar o a un efecto paracrino de las clulas vecinas. En cualquier caso, en base a varios estudios realizados principalmente en islote entero, se sabe que la respuesta ante la glucosa de las clulas y es totalmente opuesta en cuanto a la actividad elctrica, las seales de Ca2+ y la liberacin hormonal, de manera que las primeras son ms activas en bajas concentraciones de glucosa y se inhiben a altas concentraciones, mientras que la poblacin responde antagnicamente. El grupo de Patrick Rorsman propuso un modelo de funcionamiento para la clula que reconciliaba los datos aportados por varios laboratorios y explicaba el mecanismo de actuacin de la glucosa (ver figura 1B). A continuacin detallamos algunas de las caractersticas fisiolgicas de este tipo celular en base a este modelo, si bien muchos de los trabajos de los ltimos dos aos empiezan a proponer varios cambios de menor o mayor consideracin. La clula presenta canales KATP, al igual que la clula , y su actividad es la principal responsable del potencial de membrana en este tipo celular. En bajas concentraciones de glucosa, estos canales tienen una baja actividad dando lugar a un potencial de membrana por debajo de -60 mV A este potencial negativo se genera . una actividad elctrica basada en potenciales de accin mediados por canales de Ca2+ dependientes de voltaje tipo T, los cuales llevan el potencial de membrana a niveles ms positivos donde se activan canales de Na+ y canales de Ca2+ dependientes de voltaje tipo L y N. La repolarizacin tendra lugar mediante la activacin de canales de K+ tipo A. La entrada de Ca2+ a travs de los canales tipo L y N sera responsable del aumento citoslico de este in que da lugar a la exocitosis. En cambio, el incremento de la concentracin extracelular de glucosa, llevara a un aumento intracelular de la relacin ATP/ADP que dara lugar al bloqueo de los canales KATP, despolarizando as la membrana hasta valores de potencial para los cuales se inactivan las corrientes dependientes de voltaje mencionadas anteriormente y que sustentan los potenciales de accin. Esto, por tanto, llevara a la disminucin de la actividad elctrica. La apertura de canales de Ca2+ en la fase elctrica activa a baja concentracin de glucosa facilita la entrada de Ca2+ extracelular dando lugar a una24


seal oscilatoria (figura 2). Este aumento de Ca2+ en el citosol favorece la exocitosis de los grnulos de glucagn. Este modelo propone, por tanto, un efecto directo de la glucosa, y un mecanismo de accin donde los canales KATP tendran un papel fundamental en acoplar cambios metablicos a cambios inicos y seales de Ca2+ que controlaran la liberacin de glucagn, de manera muy similar a como ocurre en clula pero generando cambios opuestos. Sin embargo, varios estudios acerca del metabolismo de la glucosa observan importantes diferencias entre las clulas y que el modelo anteriormente expuesto no recoge. Aunque ambos tipos celulares disponen de transportadores de glucosa diferentes, principalmente GLUT-2 en el caso de las clulas y GLUT-1 en el caso de , se ha demostrado que el transporte de glucosa no es un factor limitante en el metabolismo del azcar. No obstante, parece que las diferencias tienen lugar a nivel mitocondrial. Se ha observado mediante diversas aproximaciones tcnicas que los cambios inducidos por glucosa en la activacin del metabolismo aerbico mitocondrial son mucho menores en las clulas . De hecho, algunos estudios bioqumicos en clulas del islote separadas por cell sorting indican una mayor grado de metabolismo anaerbico en clulas frente a una mayor actividad metablica mitocondrial en las clulas . Esta idea se sustenta adems por estudios que indican que la razn lactato deshidrogenasa / glicerol fosfato deshidrogenasa mitocondrial es baja en la poblacin , lo cual favorecera la oxidacin mitocondrial de la glucosa, mientras que esta razn es ms elevada en clulas no-. Parece por tanto que la clula presenta un acoplamiento muy bajo entre la gliclisis en el citosol y la sntesis de ATP en la respiracin mitocondrial. Estos datos podran explicar porqu se observan apenas cambios en la relacin ATP/ADP en respuesta a la glucosa en clulas comparado con la poblacin . Por tanto, en el modelo anteriormente expuesto por el grupo de Rorsman habra que proponer mecanismos alternativos de regulacin del canal KATP por parte de la glucosa, a parte del incremento en la razn ATP/ADP. Como hemos comentado anteriormente, aparte de un posible efecto directo de la glucosa sobre la clula , la regulacin paracrina juega un papel importante en el islote. La elevacin de la concentracin de la glucosa tiene un inevitable efecto estimulatorio sobre la exocitosis de clulas y vecinas. De entre varios mecanismos, uno de los ms importantes en la inhibicin de la secrecin de glucagn es el llevado a cabo por la insulina. Varios estudios coinciden en que la insulina activa canales KATP en clula , inhibiendo la actividad elctrica y la secrecin. Algunos trabajos tambin indican un papel significativo del Zn2+ aunque estos datos son an controvertidos. Los tomos de Zn2+ almacenados junto a la insulina en los grnulos25


de las clulas quedan en forma libre en el medio extracelular una vez que se ha producido la exocitosis. En clulas de islotes de rata se observ inhibicin sostenida tanto de la actividad elctrica como de la secrecin hormonal en presencia de Zn2+. Este proceso parece estar mediado tambin por la apertura de canales KATP. En cambio, estudios realizados en ratn, tanto en clulas aisladas como en islotes, concluyeron que el Zn2+ no inhiba la secrecin de glucagn y que tampoco se produca activacin de los canales KATP. Al margen de estos agentes paracrinos tambin se han descrito otros como la somatostatina y el cido -aminobutrico (GABA), con un notable efecto regulador. El GABA se libera desde los grnulos de secrecin durante la exocitosis, difundiendo por los intersticios del islote y activando receptores GABAA de clulas . La activacin de estos receptores se encuentra acoplada a la activacin de corrientes de entrada de Cl-. Dependiendo de la concentracin de Cl- intracelular, la apertura de estos canales suprimir la actividad elctrica por hiperpolarizacin o despolarizacin de la membrana respecto a los valores en los que se generan los potenciales de accin de Ca2+ y Na+ (modelo explicado anteriormente), inhibindose en ambos casos la liberacin del glucagn. La somatostatina (SST) tiene un efecto negativo sobre la liberacin de glucagn. Esta hormona se produce y secreta en varios rganos adems de en las clulas , abundando la forma activa SST-14 en el pncreas, la cual inhibe tanto la secrecin de insulina como la de glucagn al interaccionar con receptores de membrana especficos. En ratn, el efecto de la somatostatina sobre la clula se ha estudiado a nivel de la actividad elctrica, observando que activa canales de K+ acoplados a protenas G, induciendo hiperpolarizacin de la membrana e inhibiendo los potenciales de accin espontneos que permiten la entrada de Ca2+ y la secrecin de glucagn. En rata, se ha estudiado el papel de la somatostatina en la clula a nivel de capacitancia de la membrana, indicando efectos similares sobre la secrecin. Tambin se ha observado una accin inhibitoria por parte de la amilina o polipptido amiloide pancretico, tanto sobre los niveles basales de glucagn como sobre los niveles alcanzados tras estimulacin con L-arginina. Esta hormona peptdica de 37 aminocidos se cosecreta junto con insulina o somatostatina desde las clulas o del islote de Langerhans. Por tanto, la elevacin de la glucemia puede ejercer un efecto directo sobre la clu26


la y la secrecin de glucagn, y/o puede participar indirectamente al estimular la secrecin de clulas y activando respuestas paracrinas.

4. Regulacin de la secrecin de somatostatina d en la clula por glucosa.La clula apenas est caracterizada, mucho menos que en el caso del tipo celular , y an es prematuro proponer un modelo de funcionamiento consolidado. Son pocos los estudios realizados a nivel molecular y celular acerca de su fisiologa. No obstante, la escasa informacin existente indica que estas clulas tienen un comportamiento fisiolgico y unos mecanismos de control con grandes paralelismos con la clula : incrementos en la concentracin extracelular de glucosa llevan a un aumento de la actividad elctrica, la seal de Ca2+ y la liberacin de somatostatina. La omisin de Ca2+ en el medio bloquea la secrecin de la hormona, sugiriendo que la liberacin de somatostatina es dependiente de Ca2+. Con los pocos datos existentes se ha propuesto un mecanismo, todava precario, para explicar la fisiologa de la clula . En ausencia de glucosa el potencial de membrana se sita en torno a -70 mV posiblemente debido a la actividad de cana, les KATP. Estos canales han sido medidos e identificados en la clula por tcnicas electrofisiolgicas, y se ha demostrado que las sulfonilureas que bloquean estos canales, despolarizan la membrana de estas clulas, aumentan el Ca2+ intracelular y la liberacin de somatostatina. Por tanto, se propone que estos canales tienen el mismo papel que en clula , de manera que acoplan los cambios metablicos inducidos por la glucosa a cambios elctricos y de la seal de Ca2+. Se cree, por tanto, que el incremento en la glucosa extracelular tambin aumenta la razn ATP/ADP bloqueando los canales KATP y generando la despolarizacin de la membrana. Esto llevara a un nivel de potencial en torno a -50 mV en el que se desarrollan potenciales de accin de Ca2+ y Na+, y por encima de los -30 mV se activaran canales de K+ (del tipo Kv3.4) que colaboraran en la repolarizacin. La apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje permitira la entrada de Ca2+ al citosol y la exocitosis de los grnulos de somatostatina. Las clulas generan una seal oscilatoria de Ca2+ a partir de concentraciones tan bajas de glucosa como 3 mM (figura 2). Esta mayor respuesta a la glucosa en comparacin a las clulas se27


ha explicado debido a una menor densidad de canales KATP en las clulas secretoras de somatostatina (un 50 % menos). Con una menor densidad, la despolarizacin de membrana hasta llegar al potencial al que se generan los potenciales de accin tendra lugar mucho antes de que se generara una completa inhibicin de los canales KATP en comparacin con las clulas , y por tanto, podran responder antes a la glucosa. Estudios recientes utilizando microscopa confocal redox en islote entero muestran que la glucosa aumenta el metabolismo aerbico mitocondrial en clula , aunque del orden de cuatro veces menos que en el caso de la poblacin . Estos datos sugieren que el metabolismo de la glucosa en estas clulas tiene ms similitud con el de la clula , al contrario de lo que ocurre en . Estos experimentos, junto a los existentes de electrofisiologa y seal de Ca2+, tambin sugieren que el canal KATP en clula juega un papel fundamental en acoplar cambios metablicos en elctricos en respuesta a la glucosa. La regulacin paracrina inducida por glucosa debe ser relevante en clula , sin embargo existen muy pocos trabajos abordando este aspecto en detalle. Dado que la clula contiene grnulos con GABA que se cosecretan con los de insulina, y las clulas expresan receptores de GABA acoplados a canales de Cl-, es plausible que el aumento de glucemia active esta sealizacin paracrina. La activacin de estas corrientes de Cl- posiblemente afecte a la actividad elctrica de las clulas y a su secrecin. Recientemente se ha visto tambin que el L-glutamato incrementa la liberacin de somatostatina a bajas concentraciones de glucosa. En estas condiciones el L-glutamato es cosecretado con el glucagn desde las clulas . Se ha demostrado que la poblacin expresa receptores ionotrpicos de glutamato que mediaran este efecto positivo sobre la secrecin de somatostatina. Por ltimo comentar que tanto la poblacin de clulas como , funcionan como unidades individuales a diferencia de lo que ocurre en la clula que se comporta como un sincitio en ratn o en pequeos grupos coordinados en humano, tal como hemos mencionado anteriormente. Si bien trabajos clsicos utilizando transferencia de sondas fluorescentes indicaron la existencia de acoplamiento homlogo y heterlogo entre los tres tipos celulares del islote, estudios posteriores con tcnicas electrofisiolgicas y medidas de las seales de Ca2+ tanto en islotes de ratn como de humanos, demuestran que las clulas y no estn acopladas entre s ni con otros tipos celulares, de manera que tienen un comportamiento individual.28


5. Conclusiones.Si bien cada tipo celular del islote tiene un papel particular con relacin a la regulacin de la glucemia, la funcin del islote depende de la integracin de las respuestas de cada tipo celular y a sus interacciones, a parte de otros mecanismos de control como el neural. Si bien los estudios en lneas celulares y en clulas del islote aisladas aportan informacin relevante sobre la respuesta especfica de una clula o tipo celular, es relevante estudiar tambin esta respuesta en el islote intacto, pues es en este escenario donde se integran los diferentes mecanismos de comunicacin clula-clula, aproximndose en mayor medida a la realidad fisiolgica.

Agradecimientos Los laboratorios de los autores estn financiados por el Ministerio de Educacin y Ciencia y el Instituto de Salud Carlos III.29


6. Bibliografa seleccionadaCabrera O, Berman DM, Kenyon NS, Ricordi C, Berggren PO, Caicedo A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103: 2334-2339. Gilon P, Shepherd RM, Henquin JC. Oscillations of secretion driven by oscillations of cytoplasmic calcium as evidences in single pancreatic islets. J Biol Chem. 1993; 268: 2226522268. Gopel SO, Kanno T, Barg S, Rorsman P. Patchclamp characterisation of somatostatin-secreting -cells in intact mouse pancreatic islets. J Physiol. 2000; 528: 497-507. Gopel SO, Kanno T, Barg S, Weng XG, Gromada J, Rorsman P. Regulation of glucagon release in mouse alpha-cells by KATP channels and inactivation of TTX-sensitive Na+ channels. J Physiol. 2000; 528: 509-520. Nadal A, Quesada I, Soria B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. J Physiol. 1999; 517: 85-93. Prentki M, Matchinsky FM. Ca2+, cAMP and phospholipid-derived messengers in coupling mechanisms of insulin secretion. Physiol Rev. 1987; 67: 1185-1248. Quesada I, Nadal A, Soria B. Different effects of tolbutamide and diazoxide in alpha, beta and delta-cells within intact islets of Langerhans. Diabetes. 1999; 48: 2390-2397. Quesada I., Todorova M.G., Alonso-Magdalena P., Beltr M., Carneiro E.M., Martin F., Nadal A., Soria B. Glucose induces opposite [Ca2+]i oscillatory patterns in identified a- and b-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 2006; 55: 2463-2469. Quesada I., Todorova M.G., Soria B. Different metabolic responses of a, b and d-cells monitored by redox confocal microscopy within the intact islet of Langerhans. Biophys. J. 2006; 90: 2641-2650. Santos RM, Rosario LM, Nadal A, GarciaSancho J, Soria B, Valdeolmillos M: Widespread synchronous [Ca2+]i oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflugers Arch. 1991; 418: 417-422.

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Tablas y Figuras


FIGURA 1

Modelo de acoplamiento estmulo-secrecin en la clula b (A) y a (B). Ver texto para detalles acerca de estos dos modelos.

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Tablas y Figuras


FIGURA 2

A. Imagen de un islote de ratn cargado con una sonda fluorescente sensible a Ca2+. La imagen fue adquirida mediante microscopa confocal e ilustra una seccin ptica de 8 mm. Barra de calibracin = 100 mm. B. Seales oscilatorias de Ca2+ en clulas a, b y d al pasar de 3 a 11 mM glucosa (G).

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CAPTULO 2Autoinmunidad frente a los islotes en pacientes con diabetes mellitus tipo 1AUTORES

M. Vives-Pi, A.Lucas* R. PlanasLaboratori dImmunobiologia per a la Recerca i les Aplicacions Diagnostiques (LIRAD) Banc de Sang i Teixits (BST) Fundaci Institut dInvestigaci en Cincies de la Salut Germans Trias i Pujol *Servei dEndocrinologia Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Badalona. Barcelona

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1. IntroduccinLa autoinmunidad se define como una reaccin del sistema inmunitario frente a componentes del organismo causada por una prdida de tolerancia inmunolgica. Cuando el sistema inmunitario causa dao tisular y afectacin con manifestaciones clnicas, aparecen las enfermedades autoinmunitarias. La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad autoinmunitaria resultante de la destruccin de las clulas pancreticas insulares productoras de insulina por un proceso destructivo selectivo. Los autoantgenos de clulas beta, linfocitos T y B, macrfagos y clulas dendrticas estn involucrados en la patognesis de esta enfermedad. Tras una etapa de autoinmunidad asintomtica, la enfermedad suele manifestarse en la infancia o adolescencia, en el momento en que aproximadamente un 80% de las clulas beta ha desaparecido. Las evidencias existentes a favor de que la DM1 es una enfermedad de origen autoinmunitario en humanos se especifican en la tabla 1.TABLA 1

Evidencias de autoinmunidad en la DM1AUTOINMUNIDADInfiltrado insular leucocitario Autoanticuerpos circulantes Asociacin con otras enfermedades AI Asociacin gentica a HLA Transferencia de la enfermedad Efecto de inmunosupresores

CARACTERSTICAST CD4, T CD8, M, DCs ICA, IAA, anti-GAD, anti IA-2 Tiroiditis, Addison, Anemia perniciosa, vitligo Aumento del riesgo relativo para ciertos haplotipos Trasplante de mdula sea en gemelos idnticos Mejora de la enfermedad

A pesar de los importantes avances en el conocimiento de los fenmenos que acompaan esta prdida de tolerancia hacia los autoantgenos insulares, la etiopatogenia de la enfermedad mantiene muchas incgnitas, entre ellas el elemento o elementos iniciadores del proceso. El estudio de la misma es complicado por el periodo asintomtico y por la dificultad de acceder al tejido diana. Como en otras muchas enfermedades autoinmunitarias, hay factores que confieren susceptibilidad a desarrollar la enfermedad, pero que por s solos no la desencadenan. Estos factores se clasifican en genticos (HLA), ambientales (dieta, latitud, patgenos) e incluso estocsticos (repertorio clonotpico individual). En el caso de la predisposicin gentica, ciertos36

Autoinmunidad frente a los islotes en pacientes con diabetes mellitus tipo 1

haplotipos de los antgenos de histocompatibilidad de clase II (HLA-DR3/4, -DQ) as como otros loci de susceptibilidad (IDDM) contribuiran a una presentacin ms eficaz de un pptido relevante en la enfermedad; otros haplotipos confieren un papel protector. Evidencias epidemiolgicas apuntan a la existencia de un papel crtico de los factores ambientales en el desarrollo de autoinmunidad contra la clula beta: concordancia de la enfermedad del 50% en gemelos univitelinos, variaciones geogrficas, incidencia estacional, estudios epidemiolgicos de emigrantes a zonas de mayor incidencia que resultan en un aumento de la enfermedad, dieta, patgenos etc. Respecto a los patgenos y su influencia en autoinmunidad, destaca la hiptesis de la higiene, segn la cual, la exposicin a patgenos contribuira a la correcta maduracin del sistema inmunitario; por tanto, en una sociedad avanzada con pocas infecciones, antibiticos, ausencia de parsitos y vacunacin a edades muy tempranas, el sistema inmune no madurara de forma correcta influyendo en la mayor incidencia de alergia y autoinmunidad en dicha poblacin.

2. Alteraciones inmunolgicas en el islote asociadas a DM1: antes, durante y despus del inicio clnico2.1 AntesEl inicio clnico de la diabetes coincide con la fase final de destruccin de las clulas beta, iniciados durante el perodo asintomtico o prediabetes. Esta interesante etapa latente de difcil estudio debido a la falta de manifestaciones y lo inaccesible del tejido diana- puede durar aos. El nico marcador de dao insular son los autoanticuerpos sricos, siendo los anti-insulina los primeros en aparecer. De esta etapa, se sabe que no todos los individuos con anticuerpos anti-islote desarrollarn la enfermedad, lo que significa que la autoinmunidad contina de forma silente o bien acaba desapareciendo. La positividad para uno o varios autoanticuerpos anti-islote es determinante para la actividad de la respuesta autoinmunitaria que es muy activa en esta etapa, lo que sugiere que podra ser la mejor fase para utilizar la inmunomodulacin preventiva. Datos obtenidos de modelos animales indican que esta fase se caracteriza por el inicio y progresin de la insulitis o infiltracin leucocitaria de los islotes con el consiguiente establecimiento de un microambiente proinflamatorio. El avance de la destruccin se interpreta gracias a la descripcin de los procesos de migracin leucocitaria. As, las clulas endoteliales de los capilares insulares regularan la llegada leu37


cocitaria a los tejidos y sus poros ayudaran a una rpida difusin de los mensajeros qumicos entre la sangre y el espacio insular: la insulitis -infiltracin leucocitaria de los islotes- va acompaada por un incremento de los elementos vasculares de los tejidos, dato que sugiere la participacin activa del endotelio en el proceso patognico de la DM1.

2.2 DuranteLos fenmenos autoinmunitarios en el islote al inicio clnico de la DM1 se han estudiado en los pocos casos de pacientes que han fallecido en esta etapa y en las biopsias pancreticas que practican algunos grupos en Japn. Tras identificar la esperada disminucin del nmero de clulas beta, se describi una infiltracin leucocitaria relativamente escasa con predominio de linfocitos T CD4+ y CD8+ y algunos macrfagos. Parece ser que los macrfagos y las clulas dendrticas seran los primeros tipos celulares en infiltrar los islotes. La lesin inflamatoria de los islotes o insulitis, es una caracterstica comn en los escasos pncreas analizados histolgicamente procedentes de pacientes diabticos y se correlaciona, a nivel molecular, con una alteracin de marcadores inmunolgicos en las clulas beta (tabla 2): hiperexpresin de molculas de HLA de clase I y clase II, aumento de molculas de adhesin (ICAM-1, LFA3, VLA-4), aumento de molculas de transporte antignico endgeno (TAP-1), Fas, as como depsitos de inmunoglobulinas y complemento. Todas estas molculas estn implicadas en la respuesta inmune. Este hecho otorga un papel activo de la clula beta en el proceso de su desaparicin, sugiriendo un incremento de la presentacin antignica por parte de la clula diana. A nivel del microambiente insular, se han definido alteraciones del patrn de expresion de citocinas y quimiocinas, observndose un perfil de citocinas proinflamatorio y caracterstico de linfocitos T citotxicos: (IFN-, IFN- e IL-6) y perforina. Los experimentos in vitro sometiendo islotes humanos a condiciones similares a las proinflamatorias y antivirales demuestran la capacidad de los islotes para producir quimiocinas proinflamatorias que podran contribuir al homing y activacin de leucocitos y clulas autoreactivas en los islotes. En esta fase, se observan tambin fenmenos de puesta en marcha de procesos de regeneracin de la clula beta con aparicin de neoislotes a partir de ductos pancreticos. Estudios en modelos animales han determinado que la regulacin de la respuesta hacia un componente Th1 conlleva la aparicin de la enfermedad. Las citoquinas de tipo 1, producidas por linfocitos T (IFN-, TNF-, IL-2 y IL-12) se relacionan con38


una insulitis destructiva, mientras que las de tipo Th2 (IL-4, IL-10) estaran asociadas con una insulitis benigna. El reclutamiento de estas clulas hacia los islotes es un paso crtico en la patognesis de la enfermedad. Las quimiocinas son citocinas que promueven la migracin de clulas mononucleares, por lo que el trfico hacia la clula diana, podra asociarse a la expresin temporal de quimiocinas, y que la polarizacin de la expresin de las mismas por clulas Th1 vs Th2 determinara la composicin de la insulitis y la posterior destruccin o proteccin de las clulas beta. Resultados de estudios in vitro indican que las clulas beta de rata son capaces, bajo el estmulo de IL-1, de expresar ciertas quimiocinas que podran afectar al reconocimiento de la clula beta por parte del sistema inmunitario.

TABLA 2

Alteraciones inmunolgicas en pncreas de pacientes con DM1ALTERACINInsulitis con predominancia de linfocitos TCD8+ Hiperexpresin de HLA I

LOCALIZACINIslote y periferia insular

REFERENCIABottazzo, 1985; Hanninen, 1992; Itoh, 1993; Somoza, 1994; Imagawa, 2001. Bottazzo, 1985; Hanninen, 1992; Itoh, 1993; Somoza, 1994; Imagawa, 2001 Botazzo, 1985; Foulis, 1986 Hanninen, 1992; Somoza, 1994; Imagawa, 2001 Hanninen, 1992; Itoh, 1993; Somoza, 1994 Vives-Pi, 1996 Sai, 1984; Botazzo, 1985; Somoza, 1994 Somoza, 1994; Imagawa, 2001 Somoza, 1994 Stassi, 1997; Moriwaki, 1999 Foulis, 1987; Somoza, 1994; Yamagata 1996

Islote

Expresin inapropiada de HLA II Hiperexpresin de molculas de adhesin (ICAM-1, VLA) Hiperexpresin de TAP-1 (Transportador de pptidos) Depsitos de anticuerpos IgG fijadores de complemento Prdida de la expresin de autoantgenos (GAD, Insulina) Presencia de perforina Expresin de Fas Presencia de mRNA de IFN-, IFN-, IFN- e IL-6

Islote

Islote y endotelios

Islote Islote y periferia insular Clulas beta Pncreas Clulas beta y alfa Pncreas

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2.3 DespusTras el inicio clnico de la DM1, suele presentarse una etapa llamada luna de miel. Se define la luna de miel como el periodo en que los requerimientos de insulina son inferiores al 50% de los iniciales. Esta etapa sugiere un descanso de la clula beta tras la administracin de insulina exgena y probablemente un intento de regeneracin insular. A pesar de que existen pocos estudios de los fenmenos insulares que ocurren al iniciar la insulinizacin, parece ser que a partir de esta etapa iran disminuyendo las alteraciones inmunolgicas observadas en el inicio clnico de la DM1: en pncreas de pacientes con ms de diez aos de evolucin de la enfermedad ya no se detecta insulitis, hiperexpresin de HLA clase I, molculas de adhesin, inmunoglobulinas, complemento, y como es de esperar, tampoco clulas positivas para insulina. Sin embargo, estudios recientes demuestran la presencia de clulas beta remanentes en pncreas de pacientes de hasta 67 aos de evolucin de la enfermedad, que son ms numerosas en pacientes con glicemias ms bajas. Estos datos, junto con un aumento de la fibrosis periductal y la apoptosis de clulas beta implican una inflamacin crnica con nueva formacin/destruccin de clulas productoras de insulina. Algunos autores postulan que en esta etapa, la enfermedad podra remitir si se inhibiera la destruccin autoinmunitaria mediante el restablecimiento de la tolerancia.

3. Autoantgenos: Protagonistas o figurantes?Los antgenos son molculas que portan una serie de determinantes antignicos o eptopos que son reconocidos por anticuerpos o por el receptor de los linfocitos T (TCR) del sistema inmunitario especfico y pueden iniciar una respuesta adaptativa. La mayora son ajenos al individuo pero cuando un componente del propio organismo es reconocido por componentes del sistema inmunitario adaptativo, se denomina autoantgeno. Tanto en humanos como en modelos murinos, se han identificado numerosos antgenos y eptopos insulares frente a los que responden linfocitos T CD4 o CD8 autoreactivos y frente a los que se producen autoanticuerpos. En la DM1 los autoantgenos se pueden dividir en funcin de su distribucin tisular: en antgenos especficos de clula beta como la insulina, los derivados de la insulina y IGRP (Islet-specific Glucose-6-phosphatase catalytic subunit Related Peptide); antgenos neuroendocrinos como la carboxipeptidasa H, IA-2 (Insulinoma Associeted Antigen), GAD65 (Glutamic Acid Decarboxylase), periferina y carbo40


xipeptidasa E y en antgenos de amplia expresin como hsp60 (Heat Shock Protein 60). Los mejor caracterizados en funcin de la respuesta de autoanticuerpos- son la insulina, GAD e IA-2. La insulina es un autoantgeno diana segn demuestran numerosos estudios en modelos animales. Adems, el polimorfismo del gen de la insulina es un determinante importante en la DM1. El locus VNTR (variable nucleotide tandem repeat) afecta la expresin de la insulina en el timo y por tanto, puede influir en el establecimiento de la tolerancia central hacia dicha molcula. Recientemente, se ha demostrado que la liberacin de autoantgenos en DM1 y en otras enfermedades autoinmunitarias tiene un papel quimioatrayente de leucocitos, especialmente de clulas dendrticas inmaduras. ste sera un mecanismo de alerta hacia el sistema inmunitario en forma de seales de peligro para facilitar la reparacin tisular y esto supondra, en algunos individuos predispuestos, el desarrollo de autoinmunidad.

4. La importancia de los marcadores de autoinmunidadDurante el perodo asintomtico de inicio y progresin de la destruccin de la clula beta aparecen anticuerpos circulantes anti-islote, marcadores de autoinmunidad humoral que identifican individuos en fase pre-diabtica y que distinguen esta enfermedad autoinmunitaria de otras formas de diabetes mellitus. Hasta el momento, estos marcadores sirven, junto con los datos metablicos, para llevar a cabo un mejor seguimiento del paciente. Los marcadores ICA (Islet Cell Antibodies) se detectan mediante immunofluorescencia indirecta y se expresan en unidades JDF (Juvenile Diabetes Foundation). Engloban un conjunto de anticuerpos contra diferentes determinantes antignicos, entre ellos GAD (Decarboxilasa del cido glutmico), insulina e IA-2 (proteina tirosin-fosfatasa-like). Se han estandarizado ensayos moleculares especficos para la deteccin de cada anticuerpo: La mayora de los pacientes pre-diabticos y el 90% de los diabticos presenta autoanticuerpos anti-GAD y/o IA-2. Los anticuerpos anti-insulina son muy determinantes en la fase pre-diabtica en nios. La positividad de varios de estos anticuerpos incrementa el riesgo de desarrollo de la enfermedad y permite seleccionar a los individuos para ensayos clnicos de prevencin. Los pacientes con DM1 tienen clulas T autorreactivas contra varios autoantgenos insulares lo que sugiere que, si bien en la fase41


inductiva de la enfermedad la respuesta ira dirigida contra uno o unos pocos autoantgenos, la progresin de la destruccin requerira el esparcimiento de una serie de molculas (GAD65, GAD67, ICA512, IA-2b, GM2-1 ganglisido, CPH, ICA69, Imogen, hsp65, periferina, REG, sinapsina...) que amplificaran la respuesta y daran paso a los autoanticuerpos contra molculas de las clulas beta como consecuencia de la liberacin del contenido citoplasmtico. Otro parmetro inmunolgico, adems de los autoanticuerpos, es la determinacin de linfocitos T autoreactivos contra antgenos insulares en pacientes diabticos o individuos pre-diabticos. Esta tcnica, que se basa en la determinacin de la capacidad de respuesta de los linfocitos T en sangre perifrica a autoantgenos insulares est actualmente en fase de estandarizacin.

5. Contribuyen las infecciones al proceso autoinmunitario que causa la DM1?Adems de la predisposicin gentica, los factores ambientales contribuyen a la susceptibilidad frente la DM1, ya que la concordancia de la enfermedad en gemelos univitelinos es tan slo un 40-50%. Las infecciones vricas se han relacionado indirectamente con la diabetes autoinmunitaria durante muchos aos, en humanos y en modelos animales. Junto con la incidencia estacional de la enfermedad, la deteccin de virus en pncreas y en clulas mononucleares de sangre perifrica de pacientes en el inicio de la DM1 y la presencia de interferones de tipo 1 citocinas antivirales- en los islotes apoyan la hiptesis vrica en la etiologa de la diabetes. Adems, se han reportado varios casos clnicos de desarrollo de diabetes autoinmunitaria en pacientes con hepatitis viral crnica tras un tratamiento con interferones de tipo 1, principalmente con IFN-. Algunos datos epidemiolgicos recientes parecen indicar que las infecciones vricas como factor de riesgo tendran ms impacto en los individuos genticamente menos predispuestos. Se han propuesto distintos mecanismos para explicar la asociacin entre virus y DM1: 1) La hiptesis ms aceptada es el mimetismo molecular entre eptopos de protenas propias de agentes infecciosos y eptopos de autoantgenos. Tras una infeccin vrica, podra darse una reaccin cruzada y generarse una respuesta con42


FIGURA 1

Hiptesis sobre mecanismos de accin para explicar la asociacin entre las infecciones vricas y la DM1:

1) Mimetismo molecular entre eptopos de protenas propias de agentes infecciosos y eptopos de autoantgenos. Tras una infeccin vrica, una reaccin cruzada generara una respuesta contra eptopos de protenas propias en individuos susceptibles; 2) La destruccin tisular y celular producida por una infeccin vrica puede comportar la liberacin de nuevos eptopos (epitope spreading) que de ser presen-

tados y reconocidos por linfocitos T autoreactivos, stos podran activarse e iniciar una respuesta autoinmunitaria. 3) Una inflamacin del rgano diana en el contexto de una infeccin sera el desencadenante del proceso autoinmunitario, mediada por interferones de tipo 1, quimiocinas, citocinas proinflamatorias y otros factores de la inmunidad innata, que contribuiran a la activacin de clulas T

autoreactivas. 4) Se ha propuesto la destruccin citoltica directa de las clulas beta aunque parece un mecanismo incompatible con el largo perodo asintomtico que precede a la enfermedad. 5) Otra posibilidad es la presentacin de nuevos eptopos procesados de una forma distinta despus de una infeccin, o bien secuestrados hasta este momento en un rgano inmunoprivilegiado.

tra eptopos de protenas propias en individuos susceptibles; este mecanismo podra estar implicado en la patognesis de algunas enfermedades como la miocarditis post-viral o la enfermedad de Chagas. En referencia a la DM1 se ha observado, por43


ejemplo, reactividad cruzada entre eptopos de GAD y coxsackievirus, citomegalovirus y rotavirus. 2) La destruccin tisular y celular producida por una infeccin vrica puede comportar la liberacin de nuevos eptopos (epitope spreading). Si algunos de estos eptopos fueran presentados y reconocidos por linfocitos T autoreactivos, stos podran activarse y proliferar, iniciando una respuesta autoinmunitaria. 3) Otra hiptesis sugiere que la inflamacin del rgano diana en el contexto de una infeccin sera el desencadenante del proceso autoinmunitario: esta inflamacin suele estar mediada por interferones de tipo 1, quimiocinas, citocinas proinflamatorias y otros factores de la inmunidad innata, que contribuiran a la activacin de clulas T autoreactivas, de forma colateral e inespecfica. 4) La destruccin citoltica directa de las clulas beta se ha propuesto en algunas infecciones vricas en modelos animales. An y as, el mecanismo de una infeccin aguda de las clulas beta parece incompatible con el largo perodo asintomtico que precede a la enfermedad en humanos. 5) Otra posibilidad es la presentacin de nuevos eptopos, antes eptopos crpticos, procesados de una forma distinta despus de una infeccin, o bien secuestrados hasta este momento en un rgano inmunoprivilegiado. Sin embargo, todos estos mecanismos son hasta el momento hipotticos, ya que no se ha podido demostrar una relacin causa-efecto en la enfermedad en humanos. Estos mecanismos propuestos se resumen en la figura 1. Hasta el momento ms de una decena de virus, con y sin tropismo por el pncreas, han sido asociados a la DM1 en humanos y en modelos experimentales. Un ejemplo clsico es el virus de la rubola -Rubella, que pertenece a la familia Togaviridae, ya que se ha visto que nios con sndrome de la rubola congnito presentan una mayor incidencia de diabetes. Probablemente, los virus que ms se han relacionado con la DM1 son los enterovirus (familia de los Picornavirus) y, dentro de este grupo, los echovirus y coxsackievirus A y B (especialmente el serotipo B4). Algunos estudios epidemiolgicos sugieren una asociacin entre infecciones por enterovirus y el posterior desarrollo de DM1. Se han detectado anticuerpos y respuesta de linfocitos T contra enterovirus en pacientes diabticos. Adems, se report un caso en el que se pudo aislar un virus del pncreas de un paciente diabtico en el inicio clnico de la enfermedad: se trataba de una variante de coxsackievirus B4 que adems era capaz de inducir la enfermedad en ratones. Los coxsackievirus son trpicos para las clulas beta humanas y el mecanismo que se propone para el desarrollo de la enfermedad es el mimetismo molecular. Los rotavirus, pertenecientes a la familia de los reovirus, son los principales causantes de gastroenteritis durante la infancia y se han relacionado tambin con DM1. Las infecciones por rotavirus44


se han asociado a la aparicin de autoanticuerpos especficos de islote, segn datos epidemiolgicos. Adems, se ha observado una similitud entre eptopos de rotavirus VP7 y autoantgenos de islote (GAD e IA-2). stos son los ejemplos ms evidentes, pero existen otros virus que tambin se han relacionado con la DM1 en humanos y en modelos animales, como el citomegalovirus, el virus de la encefalomiocarditis, el mengovirus, los retrovirus endgenos, el virus Epstein-Barr, el virus Ljungan, etc. Por el contrario, a algunas infecciones tambin se les atribuye un papel protector frente a la DM1. La incidencia de la enfermedad ha aumentado notablemente en las ltimas dcadas en los pases desarrollados, paralelamente a una mayor atencin a la higiene y mejor control de las enfermedades infecciosas. Tambin se ha observado, mediante estudios epidemiolgicos, que el hecho de que los nios empiecen antes su etapa pre-escolar, asociada a sus primeras exposiciones a patgenos, tiene un efecto protector frente la enfermedad.

6. Regeneracin y autoinmunidad. Un crculo vicioso?En el inicio clnico de la DM1 la destruccin de la poblacin celular beta alcanza el 80%. Las clulas beta humanas adultas tienen una baja tasa de replicacin, pero en los ltimos aos se han publicado estudios que demuestran la existencia de regeneracin de clulas beta incluso en pacientes diabticos. En el pncreas de pacientes que murieron justo en el inicio clnico de la enfermedad, se detectan signos de regeneracin y neoformacin de islotes en zonas ductales. Adems, en pacientes con hasta 67 aos de evolucin de la enfermedad siguen existiendo tanto clulas beta cmo apoptosis de stas mismas, lo que sugiere la cronicidad de la autoinmunidad. Los mecanismos de regeneracin propuestos son tres: la replicacin de clulas beta preexistentes; la neoformacin de clulas beta a partir de clulas ductales y la transdiferenciacin a partir de otros tipos celulares. REG es una familia de genes implicados en la regeneracin de clulas beta. Las protenas REG actan de forma autocrina y paracrina a travs de la interaccin con su receptor (REG receptor), induciendo la proliferacin de clulas beta. En humanos existen distintos genes pertenecientes a la familia REG: REG1, REG1,45


REG3, REG3, REG4. Estos genes se expresan, entre otros tejidos, en islotes en procesos de regeneracin y se hiperexpresan en condiciones de inflamacin y diabetognesis, en un intento de regeneracin mediado en parte por REG para intentar contrarrestar la destruccin de clulas beta. Sin embargo, REG podra tener un papel dual en la DM1, ya que por otro lado se ha descrito una respuesta autoreactiva contra REG en la enfermedad. En el modelo murino NOD, se aisl una clona diabetognica TCD4+ REG3-especfica a partir del infiltrado de islotes. Recientemente, se ha descrito la presencia de autoanticuerpos anti-REG en el 25% de pacientes con DM1 y en el 15% de pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Estos anticuerpos son neutralizantes de la actividad anti-REG in vitro. Estos datos indican que REG es a su vez un factor de regeneracin y un autoantgeno en DM1. As pues, el intento de regeneracin paralelo a la destruccin de la masa celular beta podra contribuir al proceso autoinmunitario.

7. Inmunoterapia y perspectivas de futuroPor el momento, no disponemos de prevencin frente a la DM1 aunque sta es la finalidad de los ensayos clnicos de administracin de antgenos insulares. En sujetos con alto riesgo de desarrollar la enfermedad, pueden aplicarse tratamientos de tolerancia que sirvan para impedir su desarrollo, como es el caso de la administracin de insulina a travs de las mucosas. Esta insulina podra actuar, quiz como inmunomodulador, induciendo tolerancia o favoreciendo el reposo de la clula beta. Por el momento, los resultados de estos ensayos no son excesivamente esperanzadores. En la actualidad, se estan desarrollando inmunoterapias en humanos para evitar o suprimir el desarrollo de la autoinmunidad contra la clula beta. Las estrategias teraputicas se clasifican en base al aspecto inmunolgico a tratar, es decir, inmunomodulacin de linfocitos T (citocinas, anticuerpos anti CD3, dmeros pptido+HLA clase II y clulas T reguladoras), modulacin de la inmunidad innata ( alfa-galactosilceramida o pptido 277), vacunacin antgeno especfica (GAD e insulina) etc. Cabe destacar la terapia con anticuerpos monoclonales anti CD3 nomitognicos que ha supuesto un xito al restaurar la tolerancia hacia las clulas beta lo que se traduce en una remisin de la enfermedad. Adems, numerosos estudios de nuevas inmunoterapias estn en marcha en modelos experimentales.46


Otros campos prometedores como la terapia gnica, las clulas troncales, la regeneracin de las clulas beta y el transplante de islotes -cuya finalidad es en todos los casos conseguir una fuente de insulina endgena con regulacin metablicadeben apoyarse en disminucin del proceso autoinmunitario o de lo contrario puede suponer la recurrencia de la enfermedad. A pesar de la expresin tmica de autoantgenos insulares, algunas clulas T autoreactivas frente al islote escapan del timo durante la tolerancia central, lo cual es un primer paso a la susceptibilidad a la enfermedad. Sin embargo, su activacin se ve favorecida por factores genticos, ambientales y por ciertas condiciones microambientales que capaciten a las clulas T en el entorno de la clula diana: frecuencia de precursores especficos autoreactivos, estado ptimo de activacin y expresin de molculas accesorias, accesibilidad del autoantgeno y posibilidad de encuentro con elementos ambientales que favorezcan el mimetismo y las reacciones inflamatorias. El rgano diana podra tener un papel activo en la presentacin de antgenos, o quiz sera un dao inicial de la clula beta lo que dispersara sus autoantgenos al entorno donde seran presentados por clulas presentadoras profesionales. Al mismo tiempo, la clula beta es capaz de producir quimiocinas y citocinas que atraeran a los componentes leucocitarios a un microambiente proinflamatorio. El ataque autoinmunitario y la persistencia de hiperglicemia causan un aumento en la produccin de radicales libres que si se asocia a una disminucin de las defensas antioxidantes, producto de los llamados genes de respuesta protectora (glutation, HO-1, hsp...) puede aumentar la susceptibilidad al dao celular, al no bloquear la apoptosis mediada por NFkB. La presentacin clnica de la enfermedad es el resultado de un complejo proceso en el que dominan los elementos inflamatorios y destructivos del propio sistema inmunitario frente a elementos reparadores o regeneradores del islote. La investigacin sobre DM1 es un campo prioritario por la prevalencia y gravedad de la enfermedad. Es de esperar que los prximos avances en este campo consigan determinar las causas de la DM1 y conseguir su prevencin mediante la aplicacin de vacunas o tratamientos de tolerancia eficaces.

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8. Bibliografa seleccionadaBach JF, Chatenoud L: Tolerance to islet autoantigens in type I diabetes. Annu. Rev. Immunol. 19:131-61, 2001 Bottazzo GF, Dean BM, McNally JM, MacKay EH, Swift PG, Gamble DR. In situ characterization of autoimmune phenomena and expression of HLA molecules in the pancreas in diabetic insulitis. N Engl J Med. 313:353-60, 1985 Foulis AK, Liddle CN, Farquharson MA, et al: The histopathology of the pancreas in type 1 diabetes: a 25 year review of deaths in patients under 20 years of age in the United Kingdom. Diabetologia 29:267-274, 1986 Hanninen A, Jalkanen S, Salmi M, Toikkanen S, Nikolakaros G, Simell O:Macrophages, T cell receptor usage, and endothelial cell activation in the pancreas at the onset of insulin-dependent diabetes mellitus.J Clin Invest.90:1901-1910, 1992 Honeyman M. How robust is the evidence for viruses in the induction of type 1 diabetes? Curr Opin Immunol 17:616-623, 2005 Imagawa A, Hanafusa T, Tamura S, et al: Pancreatic biopsy as a procedure for detecting in situ autoimmune phenomena in type 1 diabetes: close correlation between serological markers and histological evidence of cellular autoimmunity. Diabetes 50:1269-1273, Meier JJ, Bhushan A, Butler AE, Rizza RA, Butler PC. Sustained beta cell apoptosis in patients with longstanding type 1 diabetes: indirect evidence for islet regeneration? Diabetologia 48:2221-2228, 2005 Shervani NJ, Takasawa S, Uchigata Y et al. Autoantibodies to REG, a beta-cell regeneration factor, in diabetic patients. Eur J Clin Invest 34: 752-758, 2004 Somoza N, Vargas F, Roura-Mir C, et al: Pancreas in recent onset insulin dependent diabetes mellitus: Changes in HLA, Adhesion molecules and autoantigens, Restricted T cell receptor 48 V usage and cytokine profile. J.Immunol. 153:1360-1377, 1994 Vives-Pi M, Somoza N, Vargas F, Pujol-Borrell R. Overexpression of MHC proteins in pancreatic islets: a link between cytokines, viruses, breach of tolerance and Insulin Dependent Diabetes Mellitus. In: G. E. Blair, C.R. Pringle and D.J. Maudsley (Eds), Mod Meier JJ, Bhushan A, Butler AE, Rizza RA, Butler PC. Sustained beta cell apoptosis in patients with longstanding type 1 diabetes: indirect evidence for islet regeneration? Diabetologia 48:2221-2228, 2005 Shervani NJ, Takasawa S, Uchigata Y et al. Autoantibodies to REG, a beta-cell regeneration factor, in diabetic patients. Eur J Clin Invest 34: 752-758, 2004 Somoza N, Vargas F, Roura-Mir C, et al: Pancreas in recent onset insulin dependent diabetes mellitus: Changes in HLA, Adhesion molecules and autoantigens, Restricted T cell receptor V usage and cytokine profile. J.Immunol. 153:1360-1377, 1994 Vives-Pi M, Somoza N, Vargas F, Pujol-Borrell R. Overexpression of MHC proteins in pancreatic islets: a link between cytokines, viruses, breach of tolerance and Insulin Dependent Diabetes Mellitus. In: G. E. Blair, C.R. Pringle and D.J. Maudsley (Eds), Modulation of MHC Antigen expression and disease. Cambridge University Press, 1995, pp. 361-389

Tratamiento de la Diabetes con Bombas la Insulina El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de de Diabetes

CAPTULO 3Glucolipotoxicidad en la clula y su relacin con la diabetes tipo 2AUTOR

Enrique Roche Collado

Profesor Titular de Universidad. Departamento de Biologa Aplicada, rea de Nutricin Universidad Miguel Hernndez. Alicante

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1. IntroduccinLa clula juega un papel central en la homeostasis de los nutrientes que llegan al organismo a travs de la dieta, no slo por ser capaz de fabricar y secretar la insulina, sino adems por hacer que dicha secrecin sea en el momento justo y en la cantidad adecuada. Para ello, la clula es capaz a travs de un sistema sensor de poder medir las concentraciones extracelulares de glucosa, el principal nutriente inductor del proceso secretor. Por otro lado, los cidos grasos tambin son capaces de inducir la liberacin de insulina, pero mecansticamente es necesaria la presencia de glucosa para inducir dicho efecto secretor. Este acoplamiento entre las concentraciones extracelulares del estmulo (glucosa o cidos grasos) y la liberacin de la hormona, se lleva a cabo a travs de complejas rutas metablicas, cuyo estudio ha sido un tema clave de investigacin en los ltimos aos. Mientras que las elevaciones posprandiales de glucosa generan una respuesta secretora aguda en la clula , en la patologa diabtica el escenario cambia radicalmente. En estas circunstancias, las concentraciones circulantes de glucosa y cidos grasos estn anormalmente elevadas de forma crnica, resultando en una disfuncin a nivel de la clula que se caracteriza por un proceso secretor alterado y mltiples cambios fenotpicos. En estas circunstancias en las que los nutrientes glucosa y cidos grasos estn elevados de forma crnica, stos se convierten en sustancias txicas que con el tiempo pueden llegar a provocar la muerte de la propia clula . En este sentido, se acu el trmico de toxicidad a los nutrientes para explicar cmo una exposicin crnica de la clula a elevadas concentraciones de glucosa y cidos grasos generaba cambios irreversibles que culminaban en la muerte de este tipo celular. Dado que no existe ninguna hormona que pueda reemplazar funcionalmente a la insulina, aparece la diabetes tipo 2. Cuando sta se declara se pueden observar ciertos puntos coincidentes con la diabetes tipo 1. As por ejemplo, en ambos casos la clula sufre una destruccin, aunque en el caso de la diabetes tipo 1 es por causas autoinmunes, y en ambos casos el paciente debe recurrir a las inyecciones de insulina para salvar su vida. Recientes investigaciones se han centrado en averiguar las causas moleculares que subyacen a este proceso de toxicidad a los nutrientes permitiendo caracterizar las fases en las que ste se divide y la verdadera naturaleza de los cambios funcionales y fenotpicos ms importantes que operan (Tabla 1).52

Glucolipotoxicidad en la clula y su relacin con la diabetes tipo 2TABLA 1

Fases caracterizadas en el proceso de toxicidad a los nutrientes.FASEIGluco/Lipo-adaptacin Gluco/Lipo-deoxificacin

CARACTERSTICASRepuesta secretora aguda Homeostasis correcta de nutrientes Respuesta secretora incrementada Activacin de procesos detoxificadores Cambios fenotpicos y funcionales reversibles Posibilidad de intervencin diettica-farmacolgica Respuesta secretora nula Activacin de programas apoptticos Cambios fenotpicos y funcionales irreversibles Necesidad de insulina inyectada

Gluco/Lipo-toxicidad

Las primeras investigaciones en este campo all por los aos 60, acuaron el trmino de glucotoxidad, indicando que las elevadas concentraciones circulantes de glucosa tpicas de la patologa diabtica, eran la causa principal de esta disfuncin observada a nivel de la clula . Estudios posteriores en los aos 80, acuaron el trmino lipotoxicidad al observar la estrecha relacin entre diabetes tipo 2 y obesidad, considerando de esta forma a los cidos grasos como los factores desencadenantes de dicha disfuncin celular. Aunque ambas hiptesis permitieron avanzar mucho en el campo, ninguna de las 2 lograba explicar satisfactoriamente los acontecimientos moleculares que concurran en la diabetes tipo 2. De hecho, numerosos estudios in vitro e in vivo demostraron que la clula era capaz de activar mecanismos de defensa (Tabla 1) para corregir las alteraciones producidas ante la presencia crnica de estos nutrientes. Adems la glucosa per se no suele ser txica, ya que hay numerosos estados fisiolgicos en los que el azcar est elevado en circulacin, como por ejemplo tras una ingesta de sobrecarga o en determinadas patologas pancreticas. Lo mismo podra decirse para los cidos grasos que se encuentran elevados en situaciones de ayuno prolongado. Adems un 50% aproximadamente de las personas obesas no son diabticas y lo mismo se ha constatado en modelos animales bien establecidos, como la rata ZDF (Zucker Diabetic Fatty) frente a la ZF (Zucker Fatty). Actualmente, el concepto emergente es el de glucolipotoxicidad, en el que las concentraciones elevadas tanto de glucosa, como de cidos grasos conjuntamente seran la causa real y particular de la disfuncin de la clula en la diabetes tipo 2. En estas circunstancias, cuando ambos nutrientes estn presentes y eleva53


dos al mismo tiempo, la clula no puede activar correctamente su respuesta adaptativa y su capacidad detoxificadora. En la fase adaptativa, los cambios funcionales que concurren intentan asegurar una secrecin adecuada a pesar del exceso de nutrientes y por tanto de demanda extracelular. Esto puede observarse porque la curva que monitoriza la cintica de secrecin, muestra ya respuesta secretora a concentraciones muy bajas de azcar, cuando en condiciones normales la clula suele estar silente (Figura 1). Por otro lado, los mecanismos detoxificadores tienen como misin eliminar el exceso de molculas sealizadoras intracelulares, que como respuesta a la elevada concentracin extracelular de nutrientes, estn generando informaciones errneas en la propia clula. Sin embargo, estos cambios son el resultado de un proceso continuo y de acuerdo con el estado actual de los conocimientos, es muy difcil adscribirlos exclusivamente a una respuesta adaptativa o detoxificadora propiamente dicha.

FIGURA 1Ejemplo representativo de una hipottica curva secretora de dosis dependencia en condiciones normales (lnea continua) y en condiciones de glucolipotoxicidad (lnea discontinua). Obsrvese que en la situacin patolgica existe ya una respuesta a bajas concentraciones de glucosa (alrededor de 5 mM) y que la curva alcanza una menor saturacin y mucho antes que en la situacin normal. En lneas generales se puede indicar que la clula ha perdido la sensibilidad a la glucosa.

En cualquier caso, una caracterizacin detallada de estos aspectos es crucial, ya que stos ocurren antes de la destruccin de la clula por mecanismos apoptticos. Todo ello implicara por un lado la reversibilidad del proceso y la posibilidad de corregirlo antes de llegar a un callejn sin salida. Uno de los principales obstculos que no ha permitido avanzar a un ritmo adecuado en este campo es la gran variedad de sistemas experimentales utilizados con sus correspondientes ventajas e inconvenientes. stos comprenden cultivos de lneas celulares, cultivo de islotes aislados y modelos animales. As, en los cultivos se pueden utilizar concentraciones extremadamente elevadas de nutrientes que desarrollan sus54

Glucolipotoxicidad en la clula y su relacin con la diabetes tipo 2

efectos txicos a los pocos das. Esto contrasta con lo que ocurre en humanos o en ciertos modelos animales, donde las concentraciones crnicas de nutrientes ya no pueden ser tan elevadas y los efectos txicos tardan en aparecer meses e incluso aos. Para poder comprender todo este proceso de la glucolipotoxicidad hay que tener en cuenta 2 observaciones clave que concurren en la propia clula . Por un lado, los nutrientes glucosa y cidos grasos son capaces de modular programas especficos de expresin de genes. Por otro lado, los metabolismos de la glucosa y de los cidos grasos estn interrelacionados. As por ejemplo, las concentraciones intracelulares del precursor de la sntesis de cidos grasos, el malonil-CoA, varan en funcin de la concentracin intracelular de glucosa. Adems la enzima encargada de la sntesis de malonil-CoA, la acetil-CoA carboxilasa, viene codificada por un gen regulado por la propia glucosa. Otro ejemplo que ilustra la conexin de ambos metabolismos, seran la utilizacin de intermediarios metablicos de la glucolisis para sintetizar triglicridos y diacilgliceroles. Teniendo en cuenta estas premisas, se puede proponer que la glucolipotoxicidad sea un fenmeno que pudiera estar ms cercano al desarrollo de la diabetes tipo 2 que las propias glucotoxicidad o lipotoxicidad. Aunque las evidencias experimentales son todava muy escasas, se van a presentar algunos datos preliminares que podran avalar dicha hiptesis. En cualquier caso, el caballo de batalla sigue siendo la transferencia de la experiencia acumulada in vitro y en modelos animales, a la situacin real del paciente diabtico tipo 2.

2. GlucolipotoxicidadComo ya se ha sealado anteriormente, la evidencia experimental ha establecido que las concentraciones elevadas y persistentes de glucosa o de cidos grasos por separado alteran el funcionamiento de la clula , llegando a provocar la muerte de sta por mecanismos de suicido o apoptticos. Sin embargo, los modelos experimentales tambin han revelado que ciertos mecanismos intracelulares de tipo adaptativo y/o detoxificador pueden retrasar e incluso corregir esta situacin desfavorable (Tabla 2). Sin embargo, cuando ambos nutrientes se encuentran juntos en el medio extracelular y elevados al mismo tiempo, dichos55


mecanismos son ms ineficaces y la progresin hacia la muerte celular por apoptosis es ms rpida.

2.1 Evidencias de glucolipotoxicidad en cultivos celulares in vitroEstudios en islotes cultivados han mostrado que la exposicin prolongada de stos a altas concentraciones de glucosa (16,7 mM) y palmitato (0,5 mM), result en una disminucin en la expresin del gen de la insulina y un incremento en los depsitos intracelulares de triglicridos. Adems, islotes aislados de la rata hiperglicmica y prediabtica ZDF e incubados en presencia de cidos grasos elevados presentaban apoptosis que poda prevenirse bloqueando las rutas de sntesis de ceramidas o de activacin de la xido ntrico sintasa inducible. Tratamientos farmacolgicos en estos modelos experimentales tambin permitieron restablecer la funcionalidad de los islotes y poder identificar la existencia de factores de transcripcin especficos como mediadores del proceso de glucolipotoxicidad. Entre ellos cabe destacar por su inters SREBP-1c (sterol regulatory element binding protein) y los PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors). La expresin de SREBP-1c se encuentra incrementada en condiciones de hiperglucemia en el medio de cultivo. Este factor es clave en la expresin de genes que codifican enzimas de la ruta lipognica, observndose un incremento intracelular en los

TABLA 2

Eventos moleculares que concurren durante las fases de glucoadaptacin, glucodetoxificacin, lipoadaptacin y lipodetoxificacin.GlucoadaptacinActivacin gnica Metabolismo incrementado Aumento de la sensibilidad a la glucosa Secrecin a bajas concentraciones de glucosa Hipertrofia e hiperplasia de la clula

GlucodetoxificacinEliminacin de glucosa* Incremento del estado redox Cataplerosis de citrato Esterificacin lipdica Adaptacin del ciclo celular

LipoadaptacinActivacin gnica Modulacin metablica Secrecin de insulina alterada

Lipodeoxificacin-oxidacin incrementada Desacoplamiento mitocondrial Deposicin de triglicridos

(*) Todava por demostrar experimentalmente. Por ejemplo incrementando hipotticamente la expresin o actividad de IGPR (islet-specific glucose-6-phosphate-related protein).

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Glucolipotoxicidad en la clula y su relacin con la diabetes tipo 2

depsitos de triglicridos. Esta deposicin en condiciones de alta glucosa pudo evitarse induciendo un mutante dominante negativo en clulas cultivadas INS-1. Estos datos confirman que glucotoxicidad y lipotoxicidad estn interrelacionadas y forman parte de un mismo fenmeno. Por otro lado PPAR- es un factor de transcripcin clave en la expresin de la acil-CoA oxidasa (enzima clave en la -oxidacin peroxisomal) y de la protena desacopladota mitocondrial UCP-2. Ambas protenas juegan un papel clave en el proceso de lipodetoxificacin eliminando el exceso de lpidos intracelulares y preservando la funcin mitocondrial. La expresin de PPAR- se ve severamente disminuida a altas concentraciones de glucosa, impidiendo con ello la eliminacin del exceso de lpidos. A todo esto hay que unir el hecho de que el malonil-CoA tambin se encuentra elevado en estas condiciones de alta concentracin de glucosa. Este metabolito, a parte de ser el precursor de la sntesis de cidos grasos, es el inhibidor fisiolgico de la carnitina-palmitoil transferasa I, la enzima clave en la -oxidacin mitocondrial y que tambin podra jugar un papel detoxificador clave eliminando el exceso de lpidos (Figura 2).FIGURA 2Esquema tentativo intentando enfatizar los puntos clave a nivel molecular en el proceso de glucolipotoxicidad. La glucolipotoxicidad ocurre cuando la glucosa (G) y los cidos grasos libres (FFA) a elevadas concentraciones aparecen juntos. Bajo estas condiciones, dichos nutrientes son capaces de modular programas gnicos especficos que imposibilitan la activacin de mecanismos detoxificadores. La inhibicin de la expresin de PPARs impide la expresin de la protena desacopladora mitocondrial (UCP-2) y la acil-CoA oxidasa (ACO). La carnitina palmitoil transferasa I (CPT-I) es inhibida por la alta concentracin de malonil-CoA como resultado de un metabolismo incrementado de la glucosa. La baja expresin de la ACO y la inhibicin de la CPT-I dan como resultado una reduccin en la oxidacin (-ox) de los cidos grasos en exceso. Los procesos de esterificacin se ven favorecidos por la induccin de la expresin de SREBP-1c por la alta concentracin de glucosa, que contribuye tambin proporcionando esqueletos de glicerol para la biosntesis de triglicridos (TG). Se establece una disfuncin mitocondrial progresiva con produccin de radicales libres del oxgeno (ROS) y activacin de

mecanismos apoptticos por parte de los propios cidos grasos, como sntesis de ceramidas y activacin de la sintetasa inducible del xido ntrico (iNOS). El gen de la insulina no se expresa en estas condiciones por una inhibicin de la expresin de factores de trascripcin clave, como Pdx-1. todo ello conjuntamente da como resultado una carencia en la produccin de insulina y una secrecin defectuosa. Ver el texto para ms detalles

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De todo ello se deduce que ciertas estrategias farmacolgicas dirigidas a modular la expresin de estos factores de transcripcin, podran ser efectivas en el tratamiento de la diabetes tipo 2, muy probablemente retrasando la aparicin de las alteraciones descritas. En este sentido, activadores farmacolgicos de los PPARs han permitido restaurar muchas de las alteraciones funcionales de la clula , abriendo un campo de posibilidades muy interesantes que merecen ser exploradas en mayor detalle.

2.2 Evidencias de glucolipotoxicidad en modelos animalesAunque ninguno de los sistemas animales existentes reproduce con fidelidad los eventos que concurren en el desarrollo de la diabetes tipo 2 en humanos, existen modelos que permiten obtener informacin parcial de algunas fases de la enfermedad. Quizs, las evidencias ms slidas han venido de los modelos genticos de diabetes, en particular de la rata ZDF. Este animal desarrolla sntomas de la enfermedad de una forma muy rpida durante su etapa adulta, presentando hiperglucemia, hiperlipidemia y acumulacin de triglicridos en los islotes. La aparicin de todos estos sntomas es coincidente con un fallo funcional y progresivo a nivel de la clula . Por lo tanto, adems de tener un defecto gnico en el receptor de la leptina, la rata ZDF tiene una secrecin de insulina deficiente, lo que la distingue de la rata ZF, que siendo obesa no llega a desarrollar enteramente diabetes. Determinadas manipulaciones, como una restriccin en la ingesta, o tratamientos farmacolgicos permiten retrasar o incluso impedir la progresin hacia la diabetes en la rata ZDF. Estos estudios han revelado que agentes hipolipemiantes como el bezafibrato, aunque fueron efectivos a nivel sistmico, no lograron disminuir los depsitos de triglicridos de los islotes ni normalizar los niveles de expresin del gen de la insulina. P

Tomo 5 - El Islote Pancreático En El Desarrollo Y Tratamiento De La Diabetes

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